Курслекций по дисциплине в. Од. 1 Ветеринарная микробиология, вирусология
 Скачать 1.08 Mb.
|
|
Плесневые и другие микромицеты. Микромицеты (микрогрибы) — низшие эвкариоты — представляют собой большую группу организмов, совмещающих в себе признаки живот- ных и растений. Как и животные, они лишены зеленых пигментов — хлорофиллов, с помо- щью которых осуществляется фотосинтез; содержат цитохромы — железосодержащие бел- ки, окисляющиеся и восстанавливающиеся в процессе дыхания. Гетеротрофы в качестве ис- точника углерода используют готовые органические вещества. В клеточных стенках содер- жат характерный для насекомых хитин. Вместо крахмала накапливают гликоген. В процессе превращения азотистых соединений они образуют мочевину. Как и растения, обладают способностью к неограниченному верхушечному росту, име- ют ригидную клеточную стенку, высшие грибы — поперечные перегородки (септы) и др.Для большинства микромицетов характерно наличие грибницы, или мицелия. Низшие грибы имеют одноклеточный мицелий, высшие — многоклеточный. Размножаются спорами, поч- кованием, фрагментами мицелия, а также путем слияния половых клеток — гамет. Многие исследователи считают, что грибы представляют собой самостоятельную груп- пу (царство) организмов. В последнее время на основании генетического анализа мутаций 22 видов ДНК установлено, что грибы ближе к животному миру. В связи с этим определение грибов «как растение без цветов и хлорофилла», возможно, придется заменить определением «животное без гемоглобина». Микромицеты — аэробы, нетребовательны к питательным веществам, растут преиму- щественно на поверхности различных субстратов, выдерживают низкие температуры — встречаются в холодильных камерах и других местах. Они принимают участие в превраще- нии веществ в природе. Являются продуцентами антибиотиков, ферментов, органических кислот и других соединений. Среди них встречаются как сапрофиты, так и паразиты. Систематика организмов, в том числе и грибов, периодически совершенствуется. В на- стоящее время большинство микологов считают, что развитие грибов шло разными эволю- ционными путями, в результате чего сформировались два отдела. У представителей отдела Oomycota, как и у растений, в стенках клеток содержится целлюлоза. Подвижные стадии имеют один или два жгутика. У настоящих грибов (отдел Eumycota) в стенках клеток содер- жится хитин. Они составляют более 95 % всех грибов и объединены в пять классов: 1) хит- ридиемицеты (Chytridiomycetes); мицелий слаборазвитый, одноклеточный; подвижные ста- дии имеют один бичевидный жгутик; 2) зигомицеты (Zygomycetes); мицелий несептирован- ный, хорошо развитый; размножение осуществляется чаще спорангиеспорами (эндоспора- ми); 3) аскомицеты, или сумчатые грибы (Ascomycetes); мейоспоры (споры полового раз- множения) образуются внутри специальных клеток — сумок, или асков;митоспоры (споры полового размножения) представлены конидиями; 4) базидиомицеты (Basidiomycetes); име- ют хорошо развитый многоклеточный мицелий; митоспоры представлены конидиями; мей- оспоры образуются на специальных клетках — базидиях; к этому классу относится боль- шинство съедобных грибов — макромицетов; 5) дейтеромицеты (Deuteromycetes); размно- жаются бесполовым путем — конидиями; мицелий септированный; они представляют собой «бывшие» аскомицеты, или базидиомицеты, которые в процессе эволюции утратили половые спороношения; многие из дейтеромицетов — паразиты животных, растений и человека. Рассмотрим представителей некоторых классов. Зигомицеты — одноклеточные орга- низмы с сильно развитым мицелием, размножаются половым и бесполовым путем: бесполо- вое размножение происходит с помощью спор, развивающихся на спорангиях; при половом процессе (оогамии) образуются зигоспоры, или ооспоры. Представитель этого класса — род мукор (головчатая плесень), которую можно встретить на хлебе, овощах, навозе, а также в сырых помещениях. Рост гриба напоминает двухсуточную культуру на сусле-агаре. Многие мукоровые сбраживают углеводы с образованием спирта и органических кислот, использу- ются в пищевой промышленности. У мукора (семейство Mucoraceae) от одноклеточного мицелия отходят одноклеточные гифы — спорангиеносцы, которые заканчиваются шаровидным утолщением — спорангием (плодовым телом). Внутри его находятся эндоспоры, спорангиеспоры. При разрыве споран- гия споры выходят во внешнюю среду и, попадая в благоприятные условия, дают начало но- вой плесени. Половая стадия размножения у низших грибов начинается с формирования половых клеток, или гамет, которые образуются в дифференцированных клетках — гаметангиях. Слияние гамет может происходить как в гаметангиях, так и вне их. Если женская клетка не- подвижна, то мужская (антеридия) проникает в оогоний (женский гаметангий) и оплодотво- ряет ее; если подвижны обе гаметы (обычно у водных грибов), то слияние может происхо- дить вне гаметангиев. Аскомицеты — сумчатые грибы. Представителем этого класса являются дрожжи — безмицелиальные, не образующие хлорофилла одноклеточные грибы. Внешне - это довольно крупные (до 10 мкм) овальные или округлые клетки с дифференцированным ядром. В их ци- топлазме можно встретить одну-две вакуоли, гликоген, волютин, капли жира, удлиненные тельца — митохондрии. Дрожжи широко распространены в природе, встречаются на плодах и листьях многих растений (виноградная лоза, фруктовые деревья). Почкование — наиболее распространенный способ размножения дрожжей — характе- ризуется образованием на поверхности зрелой клетки одного или нескольких бугорков (по- чек), в которые переходит часть цитоплазмы и ядра. Перетяжка (место сужения) между ма- теринской и дочерней клетками постепенно уменьшается, и затем наступает такой момент, когда дочерняя клетка отделяется и начинает самостоятельную жизнь. На поверхности мате- ринской клетки после отделения почки остается дочерний шрам, который состоит из хитина и представляет собой округлое выпячивание с приподнятым ободком по периферии. Деление у дрожжей происходит так же, как и у других микробов. Клетка (цитоплазма и ядро) делится на две равные части. Посередине клетки от периферии к центру начинает расти клеточная стенка. К концу деления новая клеточная стенка удваивается и расщепляется — образуются две дочерние клетки.При половом размножении после слияния (копуляции) двух дрожжевых клеток оболочка между ними растворяется. Оплодотворенное ядро делится 2 или 3 раза, и образуются четыре или восемь аскоспор; такая клетка превращается в аску (сумку) со спора- ми. Аскоспоры образуются при неблагоприятных условиях (недостатке питательных ве- ществ, обильном поступлении кислорода) и представляют собой клетки с толстыми оболоч- ками, устойчивыми к неблагоприятным факторам среды. После прорастания споры начина- ют размножаться бесполовым путем. Среди дрожжей имеются сапрофиты и паразиты. Сапрофиты используют в бродильной промышленности и в животноводстве как источники белка. Паразиты вызывают болезни у животных — бластомикозы. Дейтеромицеты (несовершенные грибы) имеют многоклеточный мицелий, размножа- ются с помощью оидий и конидий. Половой способ размножения не установлен. Грибы этого класса широко распространены в природе: насчитывается около 25 тыс. видов. К дейтероми- цетам относят грибы родов Aspergillus и Penicillium. Род аспергилл, или леечная плесень (семейство Moniliaceae). Типичным представителем этого рода является гриб Aspergillusniger. Мицелий септирован — разделен перегородками (септами) с отверстиями, благодаря чему осуществляется связь между клетками. Таким образом, тело гриба представляет собой сис- тему трубочек (гиф), по которым передвигается цитоплазма с множеством ядер. От мицелия отходит одноклеточный конидиеносец с утолщением на конце. На головке конидиеносца веерообразно расположены короткие стеригмы, напоминающие шипы, от которых отшнуро- вываются конидии, или экзоспоры. Конидии расположены радиально и напоминают струйки воды, выходящие из лейки, отсюда второе название гриба. Конидии леечной плесени бывают окрашены в разные цвета, но чаще встречаются черные (Aspergillusniger).Аспергиллы ис- пользуются для приготовления лимонной, щавелевой и других кислот. Некоторые аспергил- лы — продуценты антибиотиков (аспергиллин, фумигации, клавацин). Среди аспергилловых грибов имеются возбудители заразных болезней. Род пеницилл, или кистевик (семейство Moniliaceae). Мицелий и конидиеносцы много- клеточные. В верхней части плодоносящее тело разветвлено в виде кисти, откуда и второе название плесени. Последние сегменты кисти — фиалиды (стеригмы) — заканчиваются ко- нидиями, или экзоспорами. Пеницилловых грибов в природе много. Они составляют около половины всех плесневых грибов. В больших количествах они находятся в почве, на кормах, молочных продуктах, фруктах, а также в сырых помещениях. Чаще встречается зеленая пле- сень, реже — белая и др. Плесени пенициллиум нотатум и крустозум — продуценты анти- биотика пенициллина. Некоторые виды несовершенных грибов вызывают болезни кожи и волос (трихофития, микроспория, парша и др.). Мицелий таких грибов имеет большое количество хламидоспор (концевых или интеркалярных — по ходу мицелия), артроспоры (сегменты мицелия) и алей- рии (конидии). Род фузариум (семейство Turberculariaceae) поражает плоды, овощи и злаки. Мицелий гриба бывает разных цветов (белый, розовый, сиреневый). Для этой плесени характерны сер- повидные конидии и одноклеточные микроконидии. Могут образовываться и хламидоспоры. Грибы рода фузариум ведут сапрофитический и паразитический образ жизни. Поражая рас- тения, они вызывают болезнь фузариоз. Если такие грибы встречаются на перезимовавшем хлебе, они могут вызывать зеараленонтоксикоз (фузариотоксикоз) (народное название «пья- ный хлеб»). Молочная плесень (Endomyceslactis) образует белые бархатистые пленки на поверхности молочных продуктов и квашеных овощей. В результате распада септированного мицелия по- являются споры оидии. Это крупные, чаще прямоугольной формы клетки. Развиваясь на мо- лочных продуктах, гриб снижает кислотность, при этом создаются благоприятные условия для развития других микробов, которые и вызывают их порчу. Цианобактерии (от греч.Kyanos ‒ синий) — одни из древних фотосинтезирующих прокари- от. Полагают, что они появились на заре формирования Земли. По форме это палочки и кок- ки, располагаются одиночно или цепочками (в виде нитей). В клеточной стенке содержат муреин, в цитоплазме — нуклеоид, 70 S-рибосомы и другие органеллы прокариот. Иногда образуют слизистую капсулу. Для них характерны движения скользящего типа. Грамотрица- тельные. Цианобактерии вездесущие и многочисленны: встречаются в морях, пресных водоемах, почве. Среди них бывают гелиофилы и криофилы. Они могут расти в экстремальных услови- ях: ледниках Антарктиды, в заполярной тундре, на скалах, в жарких пустынях, в нейтраль- ных или щелочных водах горячих источников. Термофилы могут жить при температуре вы- ше 70°С. Цианобактерии осуществляют одновременно оксигенный фотосинтез и фиксацию моле- кулярного азота. При оксигенном фотосинтезе на свету образуют кислород. Донором элек- тронов при этом является вода. Фиксация молекулярного азота осуществляется в анаэробных условиях, поскольку кислород подавляет действие фермента нитрогеназы. В летние месяцы на поверхности мелких водоемов наблюдается массовый рост микроорганизмов в виде сине- зеленой пленки. При их разложении (гниении) в такой среде создаются условия, благоприят- ные для развития хемогетеротрофов, в результате чего уменьшается количество растворен- ного кислорода, а вместе с ним и живых организмов. Цианобактерии содержат до 70 % белка, образуют биологически активные вещества, ферменты. Поглощая большие количества диоксида углерода (СО 2 ), они предотвращают раз- витие парникового эффекта на планете. Микроскопирование живых микробов Существуют два основных способа приготовления прижизненных препаратов микро- организмов: «висячая капля» и «раздавленная капля». Препарат «висячая капля». Небольшую каплю суспензии (взвеси) микробных кле- ток наносят на покровное стекло и осторожно накладывают на него предметное стекло с лу- ночкой так, чтобы капля свободно помещалась в центре углубления. Края луночки пред- варительно смазывают вазелином, препарат переворачивают и микроскопируют. Этот метод применяют главным образом для изучения подвижности микроорганизмов. Жгутики имеются только у подвижных видов бактерий. Они очень тонкие, обычно их величина за пределами разрешающей способности микроскопа, окрашиваются плохо, поэто- му при световой микроскопии к окраске жгутиков прибегают редко. Чаще бактерий иссле- дуют в живом состоянии (без окраски) и определяют их подвижность. Количество и располо- жение жгутиков у разных видов различное. Препарат «раздавленная капля» неокрашенный (нативный). На предметное стек- ло наносят каплю жидкости (при работе с бактериями — водопроводную воду, при работе с микроскопическими грибами — смесь равных объемов этилового спирта и глицерина), вно- сят в нее немного исследуемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Выращенные на плотной среде бактерии переносятся в каплю жидкости с помощью бактериологической петли, а микроскопические грибы - двух препаровальных игл. Культура, выращенная в жид- кой среде, помещается на предметное стекло стерильной пипеткой без предварительного на- несения капли жидкости. Микроскопируют препарат, как правило, сухой системой (объективы 8х, 20х, 40х). Препарат позволяет установить форму клеток преимущественно крупных микроорганизмов, их размеры, расположение, подвижность. Препарат «раздавленная капля» прижизненно окрашенных микроорганизмов. К капле микробной суспензии на предметном стекле добавляют каплю слабого раствора (1:1000) красителя (метиленового синего или фуксина), размешивают, затем накрывают по- кровным стеклом. Подобным образом рекомендуется дифференцировать живые и мертвые клетки, на- пример при исследовании пекарских дрожжей. Мертвые клетки обычно прокрашиваются быстрее и ярче вследствие посмертного - повышения проницаемости клеточной оболочки. Отработанные препараты живых микроорганизмов помещают в сосуд с дезинфицирующим рас- твором для обезвреживания. Краски, применяемые в микробиологии. Микроскопируют микробы в живом и неживом состоянии. Для изучения внешней и структурных элементов клетки, тинкториаль- ных свойств (способность микробов к окраске) готовят специально окрашенный препарат, применяя для этого специальные анилиновые красители. Краски и красящие растворы. Наиболее часто в микробиологической практике ис- пользуют следующие анилиновые краски. а) фуксин (основной), метиловый красный, нейтральный красный - в растворе имеют красный цвет; б) кристаллвиолет, метилвиолет, генцинвиолет, готовая жидкая краска, гимза (азур-эозин) фиолетового цвета; в) метиленовая синь (синька), бриллиантовая и малахитовая зелень. Из сухих кристаллических или порошкообразных красителей готовят водные или спиртовые растворы красок. Последние обычно готовят впрок, они хорошо сохраняются в темном месте (или в посуде из темного стекла). Чтобы усилить действие красящих растворов на микронную клетку, используют различные протравители. Последние добавляют в раствор красителя (фенол, едкий калий) или ими обрабатывают препарат перед окрашиванием (сла- бые растворы соляной, серной или хромовой кислоты). Для протравы применяют так же прогревание препарата с налитой на него краской или предварительно подогревают раствор краски и окрашивают ею в горячем виде. Краски, не стойкие в растворе, не сохра- няющиеся длительное время, готовят только непосредственно перед употреблением в виде 1 -2%-ного раствора. Спиртово-водные растворы. Карболовый фуксин (фуксин Циля). Кристаллы основно- го фуксина предварительно растворяют в 96 градусном спирте. Сначала готовят насыщен- ный спиртовой раствор (на 5-10,0 краски 100 мл спирта). Для лучшего и более быстрого рас- творения кристаллы краски предварительно растирают в фарфоровой ступке в небольшом количестве спирта с добавлением нескольких капель глицерина. Чисто спиртовой раствор для окраски непригоден, поэтому готовят спиртово-водный раствор: 10-20мл насыщенного спиртового раствора фуксина 100мл дистиллированной воды с 5% фенола (протрава). Полу- ченный раствор фуксина фильтруют через фильтровальную бумагу. В ряде случаев фуксин Циля перед использованием разбавляют еще раз дистиллированной водой (1:10) и получают рабочий раствор фуксина (фуксин Пфейффера). Карболовый кристаллвиолет, метилвиолет, генцианвиолет. Первые два красителя в растворе очень быстро выпадают в осадок и при окрашивании могут исказить микроскопи- ческую картину. Чаще используют генцианвиолет, который получают смешиванием метил - и кристаллвиолета с добавлением декстрина, он дает более ровное окрашивание. 1г сухого генцианвиолета растворяют в 10 мл спирта растирая в ступке с глицерином и кристалликами фенола (2%), затем добавляют дистиллированную воду. Чтобы избежать образования осадка при хранении раствора листы фильтровальной бумаги пропитываю! насыщенным спиртовым раствором краски, высушивают их на воздухе, нарезают мелкими полосками или квадрати- ками и сохраняют в темной банке с притертой пробкой. При окраске препарата на него накладывают высушенную полоску с генцианвиоле- том. сверху наливают несколько капель воды, выдерживают 2-3 минуты. Раствор метиленовой синьки (щелочная синька Леффлера). Для приготовления рас- твора 3,0 краски настаивают длительное время (3-4 мес.) в 100мл 96 градусного спирта, за- тем 30мл насыщенного раствора разбавляют в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 1мл 1%-ного раствора едкого калия (протрава). Фильтруют. Водные растворы.2%-ный сафранин: 2,0 сухого красителя заливают 100 мл горячей дистиллированной воды, пропускают через бумажный фильтр и сразу используют свежий раствор для окрашивания. Раствор малахитовой зелени (1%-ный): на 1,0 кристаллической краски берут 100 мл горячей дистиллированной воды, фильтруют ее, остужают и используют для окрашивания. При специальных методах окрашивания бактерийных препаратов применяют готовую жид- кую краску азур-эозин (краска Гимза), но перед употреблением ее необходимо разбавить дистиллированной водой (1:10). В краске сразу образуется осадок. Чтобы последний не вли- ял на препарат, окрашивание проводят, по рекомендации Романовского, следующим обра- зом: на дно чашки Петри кладут стеклянные палочки или спички с обломанными головками, на них помещают препарат мазком вниз, раствор краски подливают под препарат (метод Ро- мановского-Гимза). |