Курслекций по дисциплине в. Од. 1 Ветеринарная микробиология, вирусология
 Скачать 1.08 Mb.
|
|
Противобактериальный иммунитет направлен как против бактерий, так и про- тив их токсинов. Бактерии и их токсины нейтрализуются антибактериальными и антиток- сическими антителами. Комплексы бактерия (антигены) – антитела активируют компле- мент, компоненты которого образуют мембраноатакующий комплекс, разрушающий на- ружную мембрану клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Пептидогликан кле- точных стенок грамположительных бактерий разрушается лизоцимом. Антитела и ком- племент обволакивают бактерии и приклеивают их к Fс – и С3в –рецепторам фагоцитов, выполняя роль опсонинов. Основным механизмом антибактериального иммунитета является фагоцитоз. Фа- гоциты направленно перемещаются к объекту фагоцитоза, реагируя на хемоаттрактанты: вещества микробов, активированные компоненты комплемента (С5а, С3а) и цитокины. Противобактериальная защита слизистых оболочек обусловлена секреторными IgА, который, взаимодействуя с бактериями, препятствует их адгезии на эпителиоциты. 33 Противовирусный иммунитет - его основу составляет клеточный иммунитет. Клетки–мишени, инфицированные вирусом, уничтожаются цитотоксическими лимфоци- тами, а также Nк-клетками и фагоцитами, взаимодействующими с Fс–фрагментами анти- тел, прикрепленных к вирусоспецифическим белкам инфицированной клетки. Противови- русные антитела способны нейтрализовать блокированные белками организмы, поглоща- ются фагоцитами или выводятся с мочой, потом и др. биожидкостями. Интерфероны уси- ливают противовирусную резистентность, индуцируя в клетках синтез ферментов, подав- ляющих образование нуклеиновых кислот и белков вирусов. Кроме того, интерфероны оказывают иммуномодулирующее действие, усиливают в клетках экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости. Противовирусная защита слизистых оболочек обусловлена секреторными IgА, которые, взаимодействуя с вирусами, препятствуют их адгезии на эпителиоцитах. Не всегда на внедрение в организм патогенных микроорганизмов он реагирует им- мунным ответом. Известен обратный феномен, получивший название иммунологической толерантности. Иммунологическая толерантность – отсутствие иммунного ответа при наличии в организме антигенов, доступных лимфоцитам. Толерогенные свойства у антигена усили- ваются по мере уменьшения его молекулярного веса. Наиболее толерантными являются растворимые антигены. Толерантность легче возникает в раннем возрасте. Этому способствует недоста- точная функциональная активность и незрелость клеток основных классов: макрофагов, Т- и В-клеток. Возникновение толерантности зависит от дозы антигена, способа его вве- дения, свойств самого антигена и физиологического состояния организма. Механизмы возникновения иммунологической толерантности достаточно разнооб- разны: делеция отдельных клонов иммунокомпетентных клеток, усиление активности Т- супрессоров, блокада клеточных рецепторов, нарушение конечной дифференцировки кле- ток без образования клеток памяти, блокада эффекторных клеток, усиленный синтез анти- идиотипических антител и др. Возможность появления иммунологической толерантности необходимо учитывать при разработке, подборе оптимальных доз и применении вакцин. Любая белковая и поли- сахаридная вакцина способна индуцировать определенную степень иммунологической толерантности при условии антигенной перегрузки, при введении больших доз антигена и частого его введения. Лекция№5 Серологические реакции для диагностики инфекционных болезней Все серологические реакции основаны на взаимодействии антигенов со специфиче- скими им (гомологичными) антителами. Реакция нейтрализации (РН) – наиболее универсальная высокоспецифичная реак- ция, поэтому она служит эталоном при оценке других реакций в вирусологии. Принцип ее состоит в том, что при смешивании вируса с сывороткой, содержащей специфические ан- титела, вирус теряет инфекционные свойства, то есть возможность репродукции в чувст- вительных клетках. Смесь вируса и сыворотки испытывают на чувствительной к данному вирусу системе (лабораторных животных, куриных эмбрионах, культурах клеток). Биоло- гическую систему и метод ее заражения подбирают с учетом наилучшего культивирова- ния используемого в реакции вируса. Реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА, РЗГА) основана на нейтра- лизации антителами при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) не только его ин- фекционной, но и гемагглютинирующей активности в результате блокирования рецепто- ров вирионов, ответственных за гемагглютинацию и образования с ними комплекса анти- ген + антитело. 34 Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке смешивают равные объемы сыворотки крови и суспензии вируса и после экспозиции определяют, сохранился ли в смеси вирус путем добавления суспензии эритроцитов. Агглютинация эритроцитов указывает на нали- чие, а отсутствие гемагглютинации – на отсутствие вируса в смеси. Исчезновение вируса из смеси вирус + сыворотка – признак взаимодействия антител сыворотки и вируса. Реакция гемадсорбции и ее задержка (РГА Д и РЗГА Д ). Гемадсорбция – соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток. В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепто- рами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглю- тинации. Реакция диффузионной преципитации в геле (РДП) (синонимы: реакция гель- преципитации, реакция двойной диффузии в геле) основана на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов и отсутствии такой способности у комплекса ан- тиген + антитело. Комплекс антиген + антитело образуется при контакте диффундирую- щих навстречу друг другу гомологичных антигена и антитела. Он осаждается на месте об- разования в толще геля в виде беловатой полосы преципитации, хорошо заметной на фоне прозрачного геля. Реакция связывания комплемента (РСК) – одна из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных болезней: ящура, КЛО, АЧЛ, вирусной диареи КРС, аденовирусной инфекции, гриппа. В основе реакции лежит связы- вание комплемента специфическим комплексом антиген + антитело и выявление этого феномена с помощью индикаторной (гемолитической) системы – смеси бараньих эритро- цитов и антисыворотки к ним – гемолизина. Если исследуемый антиген гомологичен ан- тителам, то образуется комплекс антиген + антитело и комплемент ими связан. В силу этого лизиса эритроцитов не происходит – положительная РСК (эритроциты находятся во взвеси – жидкость мутная, красного цвета). Если антиген не гомологичен антителам, ком- плекс не образуется, свободный комплемент лизирует эритроциты – отрицательная РСК (лизис эритроцитов – жидкость прозрачная, красного цвета). Между этими двумя крайни- ми результатами может быть задержка гемолиза разной степени выраженности. Метод флуоресцирующих антител (МФА), или реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Принцип данного метода заключается в том, что антитела, соединенные с флуоро- хромом (коньюгат), сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомоло- гичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело обнаруживают под лю- минисцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома. Метод иммуноферментного анализа (ИФА). Для идентификации вирусспецифиче- ского антигена иммуноферментный тест применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном. Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазная реакция Иммунопероксидазная реакция аналогична методу иммунофлуоресценции, но отли- чается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохро- мом, а ферментом – пероксидазой, и учет результатов реакции проводят не под люминис- центным микроскопом, а под обычным микроскопом. Иммунопероксидазную реакцию ставят в прямом и непрямом вариантах. Методы твердофазного иммуноферментного анализа. Они основаны на применении антител (антигенов), фиксированных на нераствори- мых носителях. В качестве носителей используют стеклянные или нейлоновые шарики, полистироловые или керамические пробирки или микропанели. Метод ДНК-зондов позволяет обнаруживать нуклеиновые кислоты, в том числе и вирусные, в любом материале от больных животных: свежем (ткани, смывы, кровь), вы- сушенном, мороженом и даже частично разложившемся. Метод ДНК-зондов основан на Рис.72 РДП в агаровом геле на предметном стекле ( по С.С. Маренниковой) 35 способности одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот соединяться в двухцепочеч- ные, если они взаимно комплементарны. Методика ДНК-зондов включает в себя: 1. Получение одноцепочечного фрагмента ДНК определенного вируса (ДНК-зонда) и его метка радиоактивным фосфором (Р 32 ) или биотином. 2. Выделение из патологического материала нуклеиновых кислот и их денатурация (рас- плетение двухцепочечных молекул на одноцепочечные в результате кипячения (80 о С) или обработки щелочью). 3. Контакт образовавшихся одноцепочечных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55 о С, приводящий к образованию двухцепочечных молекул (молекулярная гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности А А Г Ц А Т Г Г Ц Т…………Ц А А А Г Т || || ||| ||| || || ||| ||| ||| || ||| || || || ||| || Т Т Ц Г Т А Ц Ц Г А………… Г Т Т Т Ц А 4. Удаление всех негибридизированных одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот. 5. Обнаружение (по метке) образовавшихся двухцепочечных молекул нуклеиновых ки- слот, которые и будут указывать на наличие в материале того вируса, на который был по- лучен ДНК-зонд. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации ДНК, то есть уве- личении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК invitro с помощью фермента – термостабильной (выдерживающей многократный нагрев до 90 о С) ДНК- полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3 / - концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. ПЦР включает в себя три циклически повторяющихся процесса: 1. Плавление ДНК-матрицы – денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании реакци- онной смеси до 90-100 о С. 2. Отжиг праймеров – гибридизация (комплементарное связывание) праймера с ДНК- матрицей (55-65 о С). 3. Синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы – комплементарное достраивание нитей ДНК-матрицы с помощью ДНК-полимеразы из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (72 о С). Стандартный цикл ПЦР – плавление, отжиг, синтез - воспроизводится многократно и в идеале количество амплификонов (амплифицируемый участок) растет в геометрической прогрессии. Весь цикл длится 3-5 минут и может повторяться до 20-40 раз. Теоретически за 30 циклов количество ДНК должно увеличиться в миллиард раз (20 циклов – в миллион раз). Индикацию амплифицированных ДНК производят известными методами: электрофо- резом с окрашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно меченными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуорометриче- ским, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР меченых пред- шественников синтеза нуклеиновых кислот. Лекция №6 Отбор, консервирование, транспортировка и хранение патматериала для лабораторного исследования Отбор патматериала для лабораторного исследования. Правильный отбор мате- риала и его транспортировка в значительной мере определяют успех исследований. Материал берут с учетом клинических признаков болезни, которые указывают на по- ражение той или иной системы, патологоанатомической картины при вскрытии (измене- 36 ния в различных органах — печени, легких, кишечнике и т.д.), а также основываясь на предполагаемом диагнозе, поскольку для каждой инфекции характерна определенная ло- кализация возбудителя в организме. Материал для исследования берут прижизненно или посмертно (от павших или уби- тых с диагностической целью животных). Во всех случаях желательно материал брать от животных, не подвергавшихся лечению антибиотиками, и в максимально короткие после их гибели сроки, так как через 2 - 3 ч после смерти нормальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани, что затрудняет выделение возбудителя в виде чистой культу- ры. Чтобы избежать контаминации посторонней микрофлорой, исследуемый материал бе- рут стерильно, с использованием стерильного инструмента и посуды для транспортиров- ки. Трупы мелких животных направляют в лабораторию целиком. Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая требования асептики. Каждый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транс- портируют в нативном виде или консервируют одним из способов. Трубчатые кости очищают от мышц, сухожилий, заворачивают в ткань, смоченную 5%-м раствором фенола, или пересыпают поваренной солью и затем заворачивают в ткань. Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца. Кровь рекомендуют брать при лихорадочных состояниях стерильным шприцем в ко- личестве 15-20 мл. Кровь, а также другие жидкие материалы можно отбирать стерильной пастеровской пипеткой с последующим запаиванием ее кончика. Моча: наружные половые органы обмывают, ополаскивают стерильным физиологи- ческим раствором, осушают стерильным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, последующую в необходимом количестве набирают в стерильную посуду. Мокрота: собирают до приема корма. Из трахеи берут при помощи стерильного тра- хеотубуса и стерильного ватного тампона на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении тампона возникает кашель и удается получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором. При взя- тии материала из носоглотки используют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны. Секрет молочной железы: сосок обмывают водой, обрабатывают этанолом, ополаски- вают стерильным физиологическим раствором, сцеживают и удаляют первую порцию секрета, для микробиологического исследования берут последующие порции молока. Спинномозговая жидкость: обычно берут при наличии менингоэнцефалитического синдрома путем пункции. Кишечник: если исследуют содержимое кишечника, то пересылают отдельные отрез- ки (сегменты) кишечника, перевязанные на концах лигатурами. В остальных случаях ин- тересующие отрезки кишечника освобождают от содержимого, промывают стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или на- сыщенным раствором хлорида натрия. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с ре- гионарными лимфатическими узлами. Фекалии берут стерильными ватными или ватномарлевыми ректальными тампонами, которые вводят на 8-10 см в прямую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирующие смеси. В про- тивном случае нарушается исходное количественное соотношение микробных видов и размножение некоторых бактерий может привести к инактивации искомого возбудителя. Консервирование, транспортировка и хранение патматериала. Материал поме- щают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, флаконы, банки и т.д.), закупоривают. При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с материалом помещают в гер- метичный металлический пенал (ящик), который опечатывают. 37 Транспортировку и хранение материала до исследования проводят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганизма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) помещают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиолоuического раствора или помеща- ют в термос, содержащий: 1) снег или лед и поваренную соль (в соотношении 3: 1), тем- пература смеси — 15 минус 20 °С; 2) равные части сухого льда и этанола, температура смеси около —70 °С. Для консервирования патматериала, содержащего энтеробактерии, используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема. Глицериновая смесь: глицерин – 500 мл, физиологический раствор – 1000 мл, рН смеси доводят до 7,8-8,0 добавлением 20%-го раствора гидрофосфата калия. Смесь стери- лизуют дробно, текучим паром. Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода – 1000 мл, дигидрофосфат ка- лия - 0,45 г, гидрофосфат калия - 5,34 г. Стерилизуют при 121 °С 20 мин. Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магние- вая, желчный бульон), которые должны составлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервирования фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2-6°С. В сопроводительном документе указывают: название и адрес хозяйства, фамилию ветеринарного работника, направляющего материал, вид животного, от которого матери- ал получен, характер материала, на какую инфекцию необходимо исследовать. Кроме то- го, прилагают протокол патологоанатомического вскрытия и описание клинико- эпизоотологических данных. Поступивший в лабораторию неконсервированный материал можно хранить при 4 °С 1-2 сут; консервированный в 50%-м растворе глицерина (кусочки органов) — несколько недель; для длительного хранения материал замораживают при —15-20 °С. Кровь для серологических исследований у крупного рогатого скота, овец, лошадей берут из яремной вены в стерильные бактериологические пробирки в количестве 10-15 мл, у свиней — из хвостовой, передней краниальной вен или глазного синуса, у птиц — из подкрыльцовой вен, у кроликов — из краевой ушной вены. Пробирки с кровью необ- ходимо выдержать до формирования сгустка в тепле (1,5-2 ч), затем для отделения от сте- нок пробирки обвести сгусток стеклянной чистой палочкой или спицей. Для отстаивания сыворотки пробирки с кровью помещают в холодильник при 4-6 °С на 18-20 ч. После рет- ракции сгустка сыворотку крови переливают в серологические пробирки с резиновыми пробками. При необходимости сыворотку крови консервируют, добавляя в пробирку не- сколько крупинок борной кислоты, тиомерсал (конечное разведение 1:10000), или замо- раживают. |