Гормоны. ЛР гормоны. Лабораторная работа 9 Реакции, доказывающие белковую природу инсулина Цветные реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина

• Название: Лабораторная работа 9 Реакции, доказывающие белковую природу инсулина Цветные реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина
• Анкор: Гормоны
• Дата: 07.05.2021
• Размер: 36.36 Kb.
• Имя файла: ЛР гормоны.docx
• Тип: Лабораторная работа; #202419

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №9

Реакции, доказывающие белковую природу инсулина
1.Цветные реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина

Принцип реакций. Инсулин дает ряд реакций, специфических для белков: биуретовую, Фоля, Милона. Для качественных реакций используют раствор инсулина в ампулах.
1.1 Биуретовая реакция на обнаружение пептидных связей в инсулине

Принцип реакции. Инсулин, являясь белком в щелочном растворе в присутствии сульфата меди (II) образует комплексное соединение , окрашенное в сине-фиолетовый цвет.

Материалы и реактивы. Разбавленный раствор инсулина (0,5-1%, можно использовать в разведении 1:100), 10% раствор гидроксида натрия (или калия), 1 % раствор сульфата меди.Оборудование. Стеклянные палочки, штатив с пробирками, пипетки, капельница.

Ход работы. К 2-3 (1) мл раствора инсулина добавляют 1мл (5-6 капель) раствора гидроксида натрия, 1-2 капли раствора сульфата меди, перемешивают. Наблюдают за изменением окраски.

1.2 Реакция Фоля на обнаружение серусодержащих аминокислот в инсулине.

Принцип реакции. При кипячении раствора инсулина в щелочной среде от цистеина и цистина, входящих в состав инсулина, от них легко в щелочной среде отщепляется сера в виде сероводорода, который в щелочной среде образует сульфид натрия. Для цистеина уравнение реакции имеет вид:
СН₂-SН СН₂ОН

‌‌‌│ нагревание │

СН-NН₂ + 2NаОН → СН-NН₂ +Na₂S +H₂O +H₂O

│ │

СООН COOH

Для явлениях выявления сульфида (Na₂S) используют ацетат свинца, который при взаимодействии с гидроксидом натрия образует плюмбит натрия. В свою очередь плюмбит натрия, реагируя с сульфидом натрия, приводит к образованию сульфида свинца:

Рb(CН₃СОО)₂ + NаОН → Рb(ОNа)₂ + 2СН₃СООН

Nа₂S +Рb(ОNа)₂ + 2Н₂О → РbS +4NаОН
Материалы и реактивы. Неразбавленный раствор инсулина, реактив Фоля (к 1 капле 10% раствора гидроксида натрия до растворения образовавшегося осадка), концентрированный раствор гидроксида натрия).

Ход работы. В пробирку вносят 5-10 капель неразбавленного раствора инсулина, 2 мл концентрированного раствора гидроксида натрия и 1 мл реактива Фоля. Смесь тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане 2 минуты. Через 3-5 минут выпадает бурый или черный осадок сульфида свинца.
2.Реакции осаждения, свидетельствующие о белковой природе инсулина

Принцип реакций. Нарушение факторов, стабилизирующих структуру молекулы белка, приводит к осаждению белков. Так, при кипячении большинства белков нарушаются связи, свойственные нативному состоянию молекулы белка. Лучший способ осаждения белков – кипячение в средах, имеющих значение рН, равное изоэлектрической точке белков.

Минеральные и некоторые органические кислоты, органические растворители осаждают белки в результате денатурации и дегидратации. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами (танином, пикриновой кислотой и др.) обусловлен образованием нерастворимых соединений этих реактивов с азотистыми группами ртути, свинца) осаждают белки в результате образования комплексных соединений с сульфидными группами белков. Осаждение белков сульфатом аммония используется при очистке.

Материалы и реактивы. Раствор инсулина в ампулах, 0,1% раствор гидроксида натрия, 0,5% раствор уксусной кислоты, 20% раствор сульфосалициловой кислоты, 0,1 раствор трихлоруксусной кислоты, 0,1% раствор сульфата меди, 1% раствор ацетата свинца, 96% раствор этилового спирта, 95% раствор, 95% раствор ацетона, кристаллический сульфат аммония, универсальная индикаторная бумага.

Оборудование. Пробирки со штативом, пипетки, стеклянные палочки, капельница, воронки, фильтровальная бумага.

Ход работы

2.1 Реакция с разбавленным раствором гидрокида натрия.

К 1-1,5 мл раствора инсулина прибавляют по каплям раствор гидрокида натрия до выпадения хлопьевидного осадка, который растворяется при подкислении раствором уксусной кислоты (до рН 2,5-3,5).

2.2 Осаждение инсулина сульфосалициловой и трихлоруксусной кислотой.

В две пробирки вносят по 1 мл раствора инсулина. В одну пробирку добавляют 3-5 капель сульфосалициловой кислоты, в другую 3-5 капель – трихлоруксусной кислоты. В обоих случаях наблюдают выпадение осадка.

2.3 Осаждение инсулина органическими растворителями.

В две пробирки вносят по 1 мл инсулина. В первую пробирку добавляют 2 мл этилового спирта, во вторую – 2 мл ацетона. Растворы в обоих случаях становятся мутными. При добавлении к ним по 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия инсулин выпадает в осадок.

2.4 Осаждение инсулина сульфатом аммония.

В пробирку на 20 мл вносят 4 мл, разбавленного в 2 раза. раствора инсулина и добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до появления осадка. Осадок отделяют фильтрацией на вороне или центрифугированием (3-5 минут при 3000 об/мин). Фильтрат проверяют на содержание белка с реактивом Фолина.

Осадок после центрифугирования растворяют в 5 мл Н₂О и в полученном растворе определяют белок по методу Лоури.

Определение белка по методу Лоури.

Реактивы: стандартный раствор альбумина сыворотки крови, концентрация 20 мг в 20 мл дистиллированной воды или 1мг/1 мл.

0,5% раствор карбоната натрия (безводный) в 0,1 М растворе гидроксида натрия (реактив №1).

0.5% раствор сульфата меди в 1% растворе цитрата натрия (реактив №2). Непосредственно перед употреблением 1 мл реактива 2 смешивают с 50 мл реактива №1 (реактив №3).

Реактив Фолина готовится путем смешивания солей кислот : вольфрамовой, молибденовой, фосфорной и нагреванием смеси в течение 10 часов. Затем добавляют сернокислый литий и несколько капель брома.

Ход работы. Исследуемый раствор (инсулина) в количестве 0,4 мл смешивают с 2 мл реактива №3 и спустя 10 мин, добавляют 0,2 мл реактива Фолина, разбавленного в 2 раза. Через 40 минут пробы колориметрируют при длине волны 750 нм. Содержание белка определяют по калибровочной кривой.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №10

Качественное и количественное определение адреналина

1. 
   Реакция с хлоридом железа (III)
   

Принцип реакции. При добавлении к раствору адреналина хлорида железа (III) жидкость окрашивается в изумрудно-зеленый цвет в следствие образования комплексного соединения типа фенолята железа.

Адреналин обладает слабощелочной реакцией, легко окисляется на воздухе с образованием адренохрома, вследствие чего раствор окрашивается в красный цвет.

Материалы и реактивы. 1% раствор FeСl₃, 10% раствор NаОН, 0.1% раствор адреналина.

Оборудование. Пробирки, капельница, пипетки.

Ход работы В пробирку вносят 1 мл раствора адреналина, прибавляют 1 каплю раствора FeCl₃ и перемешивают. Наблюдают появление изумрудно-зеленой окраски, затем добавляют 1 каплю раствора щелочи – возникает вишнево-красное окрашивание.

2. 
   Реакция с диазореактивом
   

Принцип метода. При взаимодействии диазореактива с адреналином жидкость окрашивается в красный цвет вследствие образования сложного соединения типа азокрасителя.

Материалы и реактивы. Раствор адреналина (1:1000), 1% раствор сульфаниловой кислоты, 5% раствор нитрата натрия, 10% раствор Nа₂СО₃.

Оборудование. Пробирки, пипетки.

Ход работы. К 1 мл раствора прибавляют 1 мл раствора нитрита натрия (смесь диазореактива), 1,5 мл раствора адреналина и 1 мл раствора Nа₂СО₃. Перемешивают, наблюдают окрашивание раствора в красный цвет.

3. 
   Реакция с йодатом калия
   

Принцип реакции. Адреналин в кислой среде с йодноватокислым калием образует соединение красно-фиолетового цвета.

Материалы и реактивы. Раствор адреналина (содержимое ампулы растворяют в 100 мл воды), 10% раствор КIО₃, 10 капель раствора уксусной или ортофосфорной кислоты.

Оборудование. Пробирки, пипетки, капельница.

Ход работы. К 0,5 мл раствора адреналина прибавляют 1 мл раствора КIО₃, 10 капель раствора уксусной или ортофосфорной кислоты и смесь подогревают до температуры 60-65ºС. Появляется интенсивное красно-фиолетовое окрашивание.

4. 
   Проба с йодом
   

Эта реакция основана на образовании окрашенных продуктов окисления адреналина.

Оборудование. Штатив с пробирками, спиртовки, пипетки.

Реактивы. Адреналин, водный раствор (содержимое ампулы адреналина растворяют в 100 мл воды), йод 0,1 Н раствор.

Ход работы. При нагревании 1 мл водного раствора адреналина с каплей 0,1 Н раствора йода появляется розовое или красное окрашивание.

5. 
   Проба с нитритно-молибденовым реактивом
   

Материалы. Штатив с пробирками, пипетки.

Реактивы. Нитритно-молибденовый реактив (5г азотистокислого натрия и 5 г молибденовокислого натрия растворяют в 50 мл дистиллированной воды). Адреналин, водный раствор. Соляная кислота концентрированная и 5% раствор. Гидроксид натрия – 10% раствор.

Ход работы. В пробирку наливают немного водного раствора адреналина, добавляют немного 5% соляной кислоты и столько же нитритмолибденового реактива. Содержимое пробирки перемешивают. Появляется желто-оранжевая окраска. Добавляют немного 10% раствора гидроксида натрия. При этом появляется малиново-красная окраска. После добавления нескольких капель концентрированной соляной кислоты окраска переходит в лимонно-желтую.
6. Доказательство наличия остатка пирокатехина в структуре молекулы адреналина



Пирокатехин Адреналин
Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки

Реактивы. Адреналин - водный раствор, пирокатехин – 0,05% раствор, хлорное железо - 3% раствор.

Ход работы. В одну пробирку наливают раствор адреналина, в другую – раствор пирокатехина. Затем добавляют в обе пробирки несколько капель хлорного железа. В обеих пробирках появляется изумрудно-зеленое окрашивание.
7. Количественное определение адреналина по Фолину

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении интенсивности окрашивания, возникающего при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина. Так как реактив Фолина состоит из солей фософорновольфрамовой и фосфорномолибденовой кислот, то при взаимодейстивии с адреналином эти соли восстанавливаются с образованием более низких оксидов металлов, комплексы которых окрашиваются в синий цвет.

Материалы и реактивы. Стандартный раствор адреналина ( в мерную колбу на 25 мл отмеривают 1 мл раствора адреналина (1:1000) и доводят до метки водой – 1 мл такого раствора содержит 0,04 мг адреналина), 10% свежеприготовленный раствор Nа₂СО₃, реактив Фолина.

Оборудование. Фотоколориметр, пробирки, пипетки, мерные колбы на 25 мл.

Ход работы. Готовят две мерные сухие пробирки емкостью 10 мл. В первую вносят 1 мл стандартного раствора адреналина, во вторую – 1 мл исследуемого раствора, приливают по 4 мл раствора Nа₂СО₃ и по 0,5 мл реактива Фолина. Содержимое обеих пробирок встряхивают. Жидкость постепенно окрашивается в синий цвет, достигающий наибольшей интенсивности через 3-5 мин. Далее объем жидкости в пробирках доводят до метки раствором Nа₂СО₃. Содержимое пробирок перемешивают и окраску исследуемого раствора сравнивают в колориметре с окраской стандартного раствора адреналина. Массовую концентрацию адреналина в исследуемом растворе (мг/мл) рассчитывают по формуле :

С=С₀Е₀/Е_ст ,

где С₀ – массовая концентрация адреналина в стандартном растворе (0,04 мг/мл)

Е₀ и Е_ст – экстинкция исследуемого и стандартного растворов адреналина соответственно.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №11

Качественные реакции на тироксин.
Принцип реакции. Йодсодержащие гормоны при разрушении дают йодид калия (КI), который окисляется йодатом калия (КIО₃) в кислой среде с образованием молекулярного йода.

5КI +КIО₃ + 6НСl → 3I₂ + 6КСl +3Н₂О

Материалы и реактивы. Таблетки тиреоидина или высушенная ткань щитовидной железы, 10% раствор КОН (или NаОН), 10% раствор Н₂SО₄ (или НСI), 1% раствор крахмала, 2% раствор КIО₃, лакмус.

Оборудование. Фарфоровая ступка с пестиком, спиртовка, пипетки, колба, капельница.

Ход работы.

В фарфоровой ступке тщательно растирают 5 таблеток тиреоидина или 100-200 мг измельченной и высушенной ткани щитовидной железы. Образованную массу переносят в колбу для гидролиза, добавляют 5 мл раствора NаОН и 5 мл воды. Кипятят на асбестовой сетке в течение 10-15 мин. К 3 мл охлажденного гидролизата прибавляют раствор серной кислоты до кислой реакции на лакмус. После подкисления приливают 5 капель раствора крахмала и 1 мл раствора КIО₃. Выделившийся йод дает синее окрашивание с крахмалом.