Пішак_Медична біологія_2004. Лауреат и но белівсь ко ї прем І ї мечников І
 Скачать 14.51 Mb.
|
|
1 . 2 . 3 . 1 4 Молекулярні меха н і з ми мінливості в людини Під впливом різних фізико хімічних факторів у молекулах ДНК можуть відбуватися порушення структурної організації. Такі зміни, якщо вони тор- каються функціонально активних генів, призводять до порушень метаболізму або функцій (ознак). Якщо ці зміни не викликають загибелі організму або кліти- ни, вони передаються нащадкам. Таким чином, ген- ними мутаціями називаються стабільні зміни хімічної структури генів, що повторюються в на- ступних циклах реплікації та виявляються в на- щадків у вигляді нових варіантів ознак. Усі різнови- ди мутацій пов'язані зі зміною нуклеотидної по- слідовності генів. Причини мутацій: 1. Помилки реплікації. Вони виникають у ви- падку некомплементарного приєднання азотистих основу процесі реплікації. Якщо помилки не були виправлені ДНК полімеразою, вони передаються наступним поколінням у процесі реплікації. 2. Помилки рекомбінації. Порушення точності рекомбінацій ділянок ДНК при кросинговері веде до обміну невідповідними ділянками хромосом. Це при- зводить до порушення генного складу хромосом хромосомних мутацій. 3. Хімічні мутагени. Багато хімічних речовин можуть змінювати структуру ДНК. Наприклад, аналоги азотистих основ, включаючись у ДНК, мо- жуть зупиняти реплікацію або порушувати компле ментарність ланцюгів; формальдегід (НСОН) може "зшивати" між собою ДНК, РНК, білки; гідрокси ламін (NH 2 OH) специфічно реагує з цитозином, а його деривати замість гуаніну зв'язують аденін; азо- тиста кислота (HN0 2 ) окиснює й пошкоджує азо- тисту основу ДНК. 4. Фізичні мутагени. Зокрема, ультрафіолето- ве випромінювання (200 400 нм) викликає утворен- ня димерів тиміну, що порушує структуру ДНК. В результаті зупиняється транскрипція, порушується реплікація. Іонізуюча радіація (рентгенівські промені, у промені) порушують структуру пуринових основ і фосфодиефірні зв'язки ДНК. 5. Біологічні мутагени (наприклад, віруси, які мають здатність вмонтовувати свій гену ДНК кліти ни хазяїна і змінювати вихідну структуру генетич- ного матеріалу). 6. Спонтанні зміни (без видимих причин. На- приклад, спонтанне дезамінування цитозину й ут- ворення при цьому урацилу призводить до пору- шення комплементарності і заміни однієї пари основ на іншу. 109 Розділ 1. Біологічні основи життєдіяльності людини 1.2.3.15 Зміни послідовності нуклеотидів ДНК Мутації гена здебільшого є наслідком зміни по- слідовності нуклеотидів ДНК. Структурна класифікація мутацій гена 1) заміна одних азотних основ іншими (транспозиція); 2) зміна кількості нуклеотидних пару структурі гена 3) зміна порядку послідовності нукле- отидів у складі гена (інверсії, дуплікації, делеції, інсер ція); 4) розрив ланцюгів; 5) утворення зшивок. Заміна азотистих основ Причинами таких мутацій є а) помилки реплікації, б) вплив певних хімічних агентів. Під впливом хімічних агентів може відбуватися порушення структури азотистої основи вже приєдна- ного нуклеотиду Наприклад, під впливом азотистої кислоти може відбуватися спонтанне дезамінуван- ня цитозину. В результаті цього цитозин перетво- рюється в урацил. Надалі у циклі реплікації урацил з'єднується з аденіном, що в наступному циклі при- єднує тимідиновий нуклеотид (рис. 1.66). Ще однією причиною може бути помилкове вклю- чення в ланцюг ДНК, що утворюється, нуклеотиду зі зміненою основою або його аналога. Якщо це за- лишається невиправленим ферментами репарації, змінена основа включається в процес реплікації, що може призвести до заміни основної пари на іншу. Помилки реплікації виникають дуже рідко, тому що ДНК полімерази мають здатність до контролю комп лементарності та встановлення помилкових при- єднань невідповідних нуклеотидів. Таким чином, мутації за типом заміни азотис- тих основ виникають спочатку водному із ланцюгів ДНК. Якщо вони не виправляються в ході репарації, Рис. 1.66 Виникнення мутації за механізмом заміни однієї азотистої осно- ви іншою. то при наступних реплікаціях закріплюються в обох ланцюгах молекули. Наслідком цього є утворення нового триплету в генетичному коді ДНК. Це може позначитися на первинній структурі кодованого білка, його просторовій організації і функції. Зміни первинної структури пептиду не відбудеться в тому випадку, якщо новий триплет є синонімом колишньо- го, тобто буде кодувати ту ж амінокислоту. Напри- клад, амінокислота лейцин кодується шістьма триплетами УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ. Заміна одного з нуклеотидів у цих триплетах не змінить їх змісту. Цей приклад демонструє важливе значення надмірності генетичного коду. Однак у деяких ви- падках заміна однієї амінокислоти іншою призводить до серйозних наслідків. Наприклад, заміна глутамі нової кислоти валіном у молекулі гемоглобіну змінює його структуру і функції. Внаслідок у людини розви- вається хвороба серпоподібноклітинна анемія. Здебільшого заміна азотистих основ може при- звести до появи нонсенс кодонів, які не кодують амінокислот. Внаслідок цього буде спостерігатися передчасне переривання процесу синтезу. Вва- жається, що заміна азотистих основ призводить у 25 % випадків до утворення триплетів синонімів, у 5 % випадків до утворення нонсенс кодонів і в 70 % до виникнення генних мутацій. Зміна кількості нуклеотидів у гені. Цей вид мутацій відбувається в результаті випа- дання (делеції) або вставки однієї чи декількох пар нуклеотидів у молекулі ДНК (рис. 1.67). Такий тип мутацій зустрічається досить часто. Зазначена зміна відбувається внаслідок впливу на ДНК деяких хімічних агентів, радіоактивного опромінювання. Результатом цієї мутації є зрушення рамки зчитування інформації з генетичного коду. Наслідком цього є синтез поліпептидів із зміненою амінокислотною послідов- ністю, порушення структури і функцій білків, зміна фенотипу. Отже, якщо кількість встановлених або втрачених нуклеотидів кратна трьом, то зрушення рамки не відбувається. У цьому випадку в білку може з'явитися зайва амінокислота або їх буде на одну менше. Однією з причин мутацій, що призводять до зміни кількості нуклеотидів, є вставки або делеції в результаті активності рухливих генетичних еле- ментів. Це певні нуклеотидні послідовності, вмонто- вані в геноми багатьох організмів. Дані структури ДНК здатні спонтанно змінювати своє положення внаслідок помилок при рекомбінації. 110 1.2. Молекулярно генетичний і клітинний рівні організації життя Рис. 1.67 Виникнення мутації: 1 2 внаслідок зміни кількості нуклеотидів; 3 4 в результаті інверсії. Зміна нуклеотидної послідовності гена (інверсія). Цей тип мутації пов'язаний з поворотом певної ділянки ДНК на 180°. Такі порушення відбувають- ся внаслідок дії хімічних агентів і фізичних факторів на молекулярно генетичні процеси реплікації і ре- комбінації. Наслідком цього є порушення нуклеотидної по- слідовності гена, що призводить до зміни первинної структури поліпептиду, порушення структури і функції білка і зміни фенотипу. Розриви одного з ланцюгів можуть відбуватися під дією іонізуючої радіації, внаслідок ушкодження хімічних зв'язків між молекулами. Вони можуть відновлюватися ферментом лігазою. Зшивання нуклеотидів, наприклад, двох поруч розташованих тимінів, відбувається під дією ульт- рафіолетового опромінення. Це призводить до по- милок транскрипції. 1.2.3.16 Генна інженерія та біотехнологія Генна інженерія галузь молекулярної біології і генетики, завдання якої конструювання генетич- них структур за заздалегідь наміченим планом, створення організмів із новою генетичною програ- мою. Виникнення генної інженерії стало можливим завдяки синтезу ідей і методів молекулярної біології, генетики, біохімії і мікробіології. Основні принципи генної інженерії були розроблені в 60 70 х роках XX сторіччя. Вони включали три основних етапи: а) отримання генетичного матеріалу (штучний синтез або виділення природних генів); б) включення цих генів у генетичну структуру, яка реплікується автономно (векторну молекулу ДНК, тобто ство- рення рекомбінантної молекули ДНК в) введення векторної молекули (з включеним у неї геному клітину реципієнта, девона вмонтовується в хро- мосомний апарат (рис. 1.68). Експериментальне перенесення генів в інший геном називається трансгенезом. Він грунтується на технології рекомбінантної ДНК. В основі генної інженерії лежать різні методи маніпуляцій із молекулами ДНК. Отримання генетичного матеріалу. Усу- часній генетиці використовуються два способи синтезу генів поза організмом хімічний і фермента- тивний. Для хімічного синтезу необхідно мати пов- ністю розшифровану послідовність нуклеотидів ДНК. Вперше штучний ген синтезував індійський вчений Г. Корана (1970) (рис. 1.69). Це був ген ала нінової тРНК дріжджів, який складався з 77 нуклео- тидів. Уперших дослідах він не виявляв функціо- нальної активності, боне мав регуляторних ділянок. У 1976 р. вдалося синтезувати ген тирозинової тРНК кишкової палички, який складається не тільки із структурної ділянки (126 нуклеотидних пара й ре- гуляторних частин промотора і термінатора. Цей штучно створений за спеціальною програмою ген був трансплантований у бактеріальну клітину і функ- ціонував як природний. Іншим прикладом хімічного синтезу є синтез гена, який кодує фермент розщеплення лактози. Син 111 Рис. 1.68 Основні етапи клонування ДНК людини: 1 одержання певного гена 2 підготовка вектора 3 вмотування гена людини у вектор 4 проник- нення рекомбінантно! ДНК у бактерію, де разом із плазмідою реплікується (відтворюється) ген людини. Розділ 1. Біологічні основи життєдіяльності людини тезований у пробірці ген був вмонтований у плазмі ду і введений у бактерію; кишкова паличка набула здатності засвоювати лактозу. Проте хімічним шляхом можна синтезувати невеликі за розміром гени прокаріотів. Синтез генів еукаріотів, які складають- ся з тисячі й більше нуклеотидів, шляхом хімічного синтезу створити поки що не вдалося. Ферментативний синтез генів здійснюють за до- помогою процесу зворотної транскрипції. Відкрит- тя цього процесу зроблено на пухлиноутворюваль них РНК вмісних вірусах. Проте згодом виявило- ся, що передавання генетичної інформації з іРНК на ДНК може відбуватися в умовах експерименту і з іншими РНК. Саме це лежить в основі ферментативного синтезу гена. Спрощено це можна подати таким чином у пробірці на матриці ІРНК за допо- могою ферменту зворотної транскриптази (реверта зи) синтезується комплементарна до неї нитка ДНК, потім утворюється двониткова молекула ДНК. Після цього іРНК руйнується ферментом рибонуклеазою, отриману ДНК називають ДНК копією (кДНК). Така кДНК не має вставок інтронів, тобто схема її будови не відрізняється від бактеріального гена. Матричну (інформаційну) РНК (мРНК) виділя- ють із клітин або тканин, в яких експресується по- трібний ген. Так, для клонування проінсулінового гена використовують B клітини підшлункової зало- зи, тому що саме для них характерний високий вміст проінсулінової мРНК. Ген, отриманий внаслідок ферментативного синтезу, може функціонувати в бактеріальній клітині. На ньому синтезується ІРНК, а потім білок. Під керівництвом В. Енгельгардта був отриманий ген, який визначає синтез ферменту галактозидази. Цей ген вводили у фаг, при розмноженні якого в клітині одержали безліч копій, що забезпечило синтез ве- ликої кількості ферменту. Це має не тільки теоре- тичне, але й практичне значення, тому що галакто зидаза застосовується в харчовій промисловості. Синтезовано гени глобіну людини, кроля, голуба, деякі гени мітохондрій печінки пацюків і багато інших. Гени, синтезовані за допомогою ревертази, не мають регуляторної частини і промотора. Від- сутність регуляторних ділянок перешкоджає функ- ціонуванню цих штучних генів у тваринних кліти- нах. При перенесенні в мікробну клітину до струк- турних генів експериментально, за допомогою фер- ментів, приєднують промотор, який добувають з мікробної клітини. Так були синтезовані два гени, відповідальні за синтез ланцюгів інсуліну. їх уводи 1.2. Молекулярно генетичний і клітинний рівні організації життя ли в геном кишкової палички, яка почала продуку- вати інсулін. Важливим досягненням генної інже- нерії є синтез гена соматостатину, який може функ- ціонувати у мікробній клітині. Таким же методом під керівництвом Ю. О. Овчиннікова і М. П. Дубі ніна здійснений синтез генів, які кодують нейрогор мони людини (лейцин енкефалін і брадикінін). Ферментативний синтез генів має велике значен- ня, тому що принципово можливо проводити штуч- ний синтез будь яких індивідуальних генів шляхом транскрибування їх із відповідних матричних РНК. Основною перешкодою є синтез не структурних, а регуляторних частин генів, необхідних для їх нор- мальної роботи. Це здебільшого обмежує викорис- тання штучно синтезованих генів. У генній інженерії широко використовують так само і виділення природних генів з метою створен- ня рекомбінативних молекул ДНК. Включення отриманого гена у вектор. Вектор це щось подібне до молекулярного "таксі", здатного переносити чужу ДНК всередину бактеріальної клітини таким чином, щоб вона там змогла реплікуватися. Існує два основних типи век- торів: бактеріальні плазміди і бактеріофаги. Після виділення або синтезу гена його зшива- ють з векторною (спрямовуючою) молекулою ДНК. Рис. 1.69 Г. Корана (Наг Gobind Khorana) (нар. у 1922 p.) Рис. 1.70 Поділ подвійного ланцюга ДНК. З цією метою використовують особливі бактеріальні ферменти. Такі ферменти є у бактерій, у яких вони зупиняють репродукцію вірусу, вирізаючи вірусну ДНК із геному бактерії. Вони називаються рест риктазами, оскільки обмежують розмноження вірусів. Кожен тип ферментів рестрикції, а їх відомо близько 100, розділяє ДНК у специфічному місці, що називається сайтом рестрикції (рис. 1.70). У проміжку, що з'явився, може бути розміщена ділянка чужорідної ДНК. Таку ДНК можна розрі- зати за допомогою того ж ферменту рестрикції. Одноланцюгові комплементарні кінці двох ДНК на- зивають "липкими кінцями", тому що вони з'єдну- ються внаслідок комплементарного спарювання азотистих основ. Вони полегшують вставку чужо- рідної ДНК у векторну. Таким чином, можна поєднувати відрізки ДНК, отримані з різних джерел, і створювати комбінації генів в одній довгій молекулі. Оскільки водневі зв'яз- ки легко розриваються, для з'єднання ділянок за- стосовують фермент лігазу один із ферментів ре- парації. Комбінуючи різні рестриктази і лігази, мож- на розрізати нитку ДНК у різних місцях і одержува- ти рекомбінантні молекули (наприклад, плазмідну ДНК з вмонтованим чужим геном. Вмонтовування в геном реципієнта. Векторні молекули, які містять у собі фрагмен- ти чужорідної ДНК, повинні мати властивість, яка забезпечує третій етап генної інженерії проник- нення в клітину реципієнта і вмонтовування в її геном. Реципієнтні клітини, тобто клітини, обрані для клонування гена, можуть бути як про , так і еукаріо 113 Розділ 1. Біологічні основи життєдіяльності людини тичними. Найчастіше для цієї мети використовують бактерії, оскільки їх легко одержувати у великих кількостях. Перенесення генів може здійснювати- ся з однієї бактерії в іншу за допомогою плазмід. Рекомбінантні молекули ДНК відокремлюють від молекул, що містять тільки донорську або тільки плазмідну ДНК. Для їхнього поділу використовуєть- ся плазміда, що має два гени стійкості до двох ви- значених антибіотиків. При цьому клітини, що рос- туть за наявності двох антибіотиків, містять тільки вихідну плазміду. Клітини, що гинуть під дією двох антибіотиків, позбавлені плазмід і містять тільки донорську ДНК. Клітини, що ростуть за наявності одного антибіотика і гинуть за наявності іншого, містять рекомбінантну плазміду. Якщо в плазміду вмонтовані інші гени, вони пе- редаються в клітину хазяїна шляхом трансдукції і вмонтовуються в її геном (рис. 1.68), де здатні до швидкої реплікації за допомогою ферментативної сис- теми клітини хазяїна. Цей процес швидкого одер- жання великої кількості однакових копій називаєть- ся клонуванням. Клон це велика популяція іден- тичних молекул, бактерій, клітин, організмів, які от- римані від одного предка (рис. 1.71). Клонування генів це процес, що включає виді- лення й ампліфікацію (дублювання великої кіль- кості) окремих генів у реципієнтних про й еукаріо тичних клітинах. Ці клітини, які містять потрібний нам ген, можна використовувати для одержання: а) великої кількості білка, що кодується даним геном, або б) великої кількості самого гена у висо коочищеному вигляді. Крім плазмід, як вектор використовуються фаги фаг лямбда, віруси (мавпячий вірус SV40). У ви- падку використання фагів і вірусів перенесення ге- нетичного матеріалу здійснюється за допомогою трансдукції. Особливим випадком трансдукції є пе- ренесення чужорідних генів в еукаріотичні клітини за допомогою неонкогенних вірусів і фагів. Вперше припущення, що трансдукція можлива в еукаріотів, було висловлено СМ. Гершензоном у 1966 р. при дослідах на шовковичному шовкопряді. Рекомбінантна ДНК технологія має як наукове значення (дозволяє виділити окремий ген складного організму і вивчити його функцію на молекулярному рівні), так і практичне застосування. За допо- могою рекомбінантної ДНК технології можна вироб- ляти різні білки для медичної практики. Такі ліки більш безпечні, ніж аналогічні білки, отримані без- посередньо з організмів. Першим таким рекомбі нантним препаратом став інсулін. Інший важливий напрямок біотехнології вироб- ництво вакцин. Такі вакцини не можуть викликати хвороб, тому що виготовляються з одного із поверх- невих білків. Ген такого білка використовується для біореконструкції бактерії. Так створена вакцина про- ти гепатиту В. Успішно ведеться робота над вакцинами для гепатитів АС, хламідіозів, герпесу й інших захворювань. Трансгенні організми. За допомогою методів генної інженерії можна одержати різні організми, які мають у складі свого геному чужорідні гени інших організмів. Такі організми називаються трансгенними. У даний час ця галузь науки швид- ко розвивається. У різних галузях господарської діяльності люди- ни використовуються трансгенні бактерії. Крім того, що бактерії використовуються для клонування генів і виробництва білка, вони реконструюються і для інших цілей. Так, біоінженерні бактерії використовуються для оздоровлення рослин. Бактерії, що живуть у росли- нах і стимулюють утворення кришталиків льоду, були змінені з холод плюс на холод мінус рослини. Такі бактерії почали захищати вегетативні частини рос |