или:
1 2
0
x
w
f
m
Введем:
,
)
(ln
1 1
2 2
2
dt
x
d
w
x
w
dt
dx
x
w
S
где S – коэффициент седиментации (1 сведберг = 10
-3
с).
Парциальный удельный объѐм:
75
,
0 6
,
0 1
кг
л
V
для макромолекул это возрастание объѐма растворителя при растворении 1 кг сухого вещества в фиксированном объѐме растворителя.
)
1
(
0 0
V
D
Ts
K
m
)
1
(
0
V
D
RTs
MM
– формула Сведберга.
Следовательно, нужно заранее определить D и V и измерить на центрифуге S и получим ММ. Необходимо определить S и D в одинаковых растворителях, при одной температуре.
Электрофорез макромолекул – движение частиц в жидкой фазе под действием электрического поля.
F
э
=q E,
где q – заряд молекулы, Е – напряжѐнность поля, F
э
– действующая сила.
F
c
=f , где f – коэффициент трения (для сферы 6
r), F
c
– сила сопротивления,
– скорость движения.
После установления стационарного состояния: q E = f при этом скорость движения постоянна ( = const.)
57
сек
В
м
f
q
E
U
2
– электрофоретическая подвижность.
Для сферы:
r
q
U
6
Если исследуют белки (молекулярную массу), то электрофорез проводят в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) в полиакриламидном геле
(Вебер, Осборн, 1969). Исследования проводят после обработки 1% раствором
ДСН, который является детергентом, обладающим денатурирующим действием, и добавления – меркаптоэтанола для разрыва дисульфидных связей. ДСН одинаково связывается со всеми белками (1,4 кг
ДСН на 1 кг белка). Каждая молекула ДСН несѐт один отрицательный заряд и общая плотность зарядов одинакова для разных белков.
Таким образом, поверхностная «шуба» из молекул ДСН устраняет зарядовые значения между белками. После денатурации белок приобретает форму стержня 1,8 нм. Длина пропорциональна молекулярной массе.
В качестве носителя используется полиакриламидный гель в концентрации 5 – 15%.
M
а
в
U
lg
,
где а и в – константы, зависящие от свойств геля.
2. Термодинамические исследования
Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия. Измеряется количество теплоты, необходимое для повышения температуры объекта на заданную малую величину – Т (то есть Н). Если в этот момент происходит
«разворачивание» глобулы – Н в камере с белком много больше, чем Н в контрольной камере (буферный раствор) – этот контроль позволяет внести поправку на величину теплоѐмкости.
Чувствительность микрокалориметрии – 16 10
-6
Дж/моль град
Кривые представляют в виде температурной зависимости теплоѐмкости
С
р
При переходе из нативного в денатурированное состояние максимальная
С
р соответствует температуре плавления Т
п
. Если в белке есть домены с разной термоустойчивостью, кривая имеет два пика.
3. Оптические (спектральные) методы
Рентгеноструктурный анализ.
Этот метод основан на явлении дифракции рентгеновских лучей.
Дифракция – огибание волной препятствия – происходит, когда сравнима с размером объекта. Поэтому для исследования молекул
58 используются рентгеновские лучи, которого сопоставима с размерами атома. Получая дифракционную решѐтку, можно по картине судить о структуре макромолекул.
Оптическое вращение и круговой дихроизм.
Оба метода основаны на пропускании через образец монохроматического поляризованного света.
Дисперсия оптического вращения (ДОВ) оценивается по углу поворота плоскости поляризации вышедшего света по сравнению с падающим.
Основной вклад в неѐ вносят – спирали белков и по величине дисперсии можно оценить содержание – спиралей в белках (зависимость угла поворота от ).
Круговой дихроизм (КД):
Его величина определяется в разнице поглощения образцом право – и лево – поляризованного света Разница объясняется различными коэффициентами молярной экстинкции для право – и лево – поляризованного света и позволяет определить направление, в котором «закручена» спираль – зависит [Q] от .
Для каждой хромофорной группы аминокислот, существует точка пика поглощения, преимущественно в УФ области (230 – 310 нм)
Простой абсорбционный спектр, таким образом, может позволить исследовать аминокислотный состав белка.
– спираль
моль
д
см
град
Q
нм
моль
д
см
град
Q
нм
моль
д
см
град
Q
нм
2 2
2 38000 222 36000 206 71000 190
– спираль
моль
д
см
град
Q
нм
моль
д
см
град
Q
нм
2 2
20000 215 35000 195
клубок
моль
д
см
град
Q
нм
2 25000 197
По структуре КД можно определить доли глобулярных и фибриллярных участков и неупорядоченных структур.
59
Флуоресцентная спектроскопия белков. а) Собственная флуоресценция белков, имеющих в составе аминокислоты: Tyr, Try, Phe, и по спектру флуоресценции можно
судить о положении этих остатков в белке, и взаимодействие его с окружающими группами. ф
чистого Try равна 323 нм, в его вариации в белках от 320-342 нм. б) «Тушение флуоресценции» введѐнными хромофорами (то есть миграция энергии с молекулы белка на ионы Cs
+
, J
-
, акриламид) позволяет оценить доступность хромофорных групп для внешних реагентов. в) Более удобным в ряде случаев оказывается двухволновой флуоресцентный метод, то есть регистрация одновременно
1
J и
2
J, что позволяет оценить динамику смещения спектра, так как положение максимальной флуоресценции более чувствительно к конформационным перестройкам
1 2
JВJ – двухволновой флуоресцентный параметр, он заметно уменьшается при разворачивании глобулы. г) Флуоресцентная спектроскопия с временным (наносекундным) разрешением (флаш – фотолиз).
Флуоресценция возбуждается наносекундными вспышками лазера, и по повороту угла поляризации измеряется степень поворота хромофорной группы за указанное время. Метод позволяет регистрировать быстрые процессы.
Силы внутримолекулярного взаимодействия биомакромолекул Относительно энергии теплового движения молекул воды при нормальных условиях (2,5 к Дж/моль) их можно подразделить на
сильные, к которым относятся ковалентные (200 – 800 к Дж/моль) и ионные взаимодействия (40 – 400 к Дж/моль), величина энергии которых рассчитывается по закону Кулона:
rqqWi2 1
0
'
4 1
, где q
1 и
q
2
- электрические заряды групп, и
0
- диэлектрические постоянные в среде и вакууме (
0
=8,85 10
-23
Кл В
-1
м
-1
). и
слабые– все остальные.
К ним относятся:
I. Ван–дер–Ваальсовы силы 4 – 8 кДж/моль.
Эти силы играют роль в образовании конденсированных жидких и твѐрдых состояний, во взаимодействиях на поверхности раздела фаз. Они имеют электромагнитную природу и определяются взаимодействием электрических диполей в соседних молекулах
60
nRT
в
а
Р
)
(
)
/
(
2
– это уравнение Ван–дер–Ваальса. где а и в – постоянные притяжения и отталкивания Уравнение Ван–дер–
Ваальса описывает отклонения реального газа от идеального.
1. Ориентационные силы (диполь–дипольные).
Когда обе молекулы обладают постоянными дипольными моментами М
1
и
М
2 6
2 2
2 1
0 0
6 1
r
M
M
T
k
W
op
,
где: k
0
– постоянная Больцмана, Т – абсолютная температура.
2. Индукционные взаимодействия (диполь–индуцированный диполь)
В том случае, когда первая молекула обладает постоянным дипольным моментом М, а вторая нет, но характеризуется определѐнной поляризуемостью , то за счѐт создаваемого диполем во второй молекуле 2 электрического поля напряжѐнностью Е
1,
, которое равно:
3 1
2
R
М
Е
, наводится диполь:
6 2
0 2
1
r
M
W
ind
3. Дисперсионные (поляризационные) взаимодействия
Обе молекулы не обладают постоянными дипольными моментами, но обладают поляризуемостью (
1 и
2
) и наведенным потенциалами ионизации I
1 и
I
2
Взаимодействие обусловлено внешними, наиболее слабо связанными электронами. Природа их носит квантово – механический характер и является результатом появления так называемых «мгновенных диполей» при движении электронов:
6 2
1 2
1 2
1 2
3
r
I
I
I
I
W
dis
II. Водородные связи (заряд – дипольные взаимодействия)
Это взаимодействия между атомом Н одной молекулы и N, O, S, F, Cl, – другой.
Основной вклад в энергию вносит электростатическое притяжение. Но так же по уравнению Ван–дер–Ваальсова сила и энергия деполяризации двух электронов связи О–Н.
Для воды:
ВОДОРОД
ЭЛ СТАТ
ДИСП
ОТТАЛ
U
U
U
U U
61 25 2 12 6 33 6 35 28 36 12
,
,
,
,
,
кДж/моль.
В разных точках протон испытывает различные воздействия со стороны электроотрицательных атомов – имеется 2 минимума.
III. Гидрофобные взаимодействия с энергией 4-8,5 к Дж/моль.
Основано на силах отталкивания воды гидрофобными (неполярными) молекулами. Более корректно их можно определить, основываясь на термодинамике.
Вода представляет собой довольно сложную структуру, ассиметрична и имеет большой дипольный момент (1,82 дебая (Д)).
Тетраэдрическая структура полностью координированной воды
Молекулы воды ассоциированны с координаторным числом 4, то есть атомы кислорода четырѐх молекул образуют тетраэдр, в центре которого атом кислорода пятой молекулы. Структура жидкой воды до конца не ясна.
Существуют две группы гипотез:
1. Модель непрерывной структуры воды
Вода представляет собой непрерывную структуру, связанная водородными связями, и при изменении температуры, давления и других факторов они лишь растягиваются и деформируются. Но по расчѐтам, тогда при t=25 С =1,8 г/см
3
(а не 1,0).
2. Модели мерцающих кластеров. Франк, Уэн (1957)
Водородные связи формируют короткоживущие (10
-10
- 10
-11
сек) кластеры, размер которых зависит от температуры. При t=20 С в кластеры входит 29,5% молекул воды.
Вода как полярная молекула может конкурировать с другими полярными молекулами за места образования водородных связей. Но неполярное вещество, попав в водную среду, будет подчиняться другим закономерностям, описанным Каузманом.
Если помните, свободная энергия
G= H-T S. При растворении неполярных веществ
G увеличится, но
Н почти не изменится, следовательно, S<0.
Понижение энтропии связано с изменением структуры воды. Вблизи неполярных участков снижается конкуренция за водородные связи, следовательно, повышается вероятность формирования упорядоченных кластеров.
Согласно второму началу термодинамики в неравновесной области система стремится увеличить энтропию. Для этого есть один путь – неполярным молекулам в растворе «установить контакты», вытеснив воду и тем самым разрушить кластеры и снизить упорядоченность системы.
Исходя из этого, была количественно оценена гидрофобность аминокислот в белках. Мерой гидрофобности служит G при переносе их из
100% этанола в воду:
62
Try
G=14 к Дж/моль,
Phe
G=10,5 к Дж/моль,
Ala
G=2,1 к Дж/моль,
Ser
G=1,25 к Дж/моль.
Ala и Ser – гидрофильные остатки.
Пространственная структура белка
Первичная структура белка – последовательность аминокислот (АК).
Пептидная связь между аминокислотами (Рис. 5) отличается от обычной ковалентной связи перераспределением электронной плотности и, потому, является жѐсткой и вокруг неѐ вращение затруднено. Расстояния в ней соответствуют:
C –N-0,132 нм
N – C -0,147 нм
С – С -0,153 нм
Рис. 5. Пептидная связь между
аминокислотами
Зато оно возможно вокруг связей С – С (угол ) и N – C (угол ), за счѐт чего и возникают конформации белковых молекул. Число возможных конформаций ограничено, так как согласно расчѐтам Рамачандрана и могут принимать лишь определѐнные значения.
Конформации стабилизируются слабыми взаимодействиями между пептидными группами
(вторичная структура) и боковыми остатками АК (третичная структура).
Вторичная структура – упорядоченное расположение полипептидной цепи, стабилизированное водородными связями между пептидными группами.
Чаще всего встречается и наиболее термодинамически выгодна правая
-спираль, постулированная Поллингом и Кори (Рис. 6).
1. на один шаг спирали – 3,6 остатка,
2. шаг спирали d = 0,54 нм,
3. трансляция на 1 остаток вдоль спирали d = 0,15 нм,
4. радиус спирали r = 0,23 нм,
5. водородные связи параллельны оси спирали и образуются между 1 –
4 аминокислотными остатками,
6. = -57 , = -47 .
Но возможны и другие виды спиралей. Она обнаруживается в отдельных участках белка, r = 0,19 нм, то есть она более скручена. На 1шаг три АК,
63 водородные связи между 1 –10 АК. Это – спираль. Она теоретически рассчитана, но пока не обнаружена в белках, r = 0,28 нм, длина шага 4, 4
АМК.
Рис.
6.
Вторичная
структура белка
Слева – α-спираль
Справа – β-склад- чатая структура
Другой тип вторичных структур: – складчатые структуры.
Водородные связи расположены параллельно оси спирали. Они могут быть параллельными – = +1130 , = -119 и антипараллельными – =
+113 , = -119 , имеют фиксированные значения и , включают до 6 белковых цепей, состоящих из 6 остатков, размеры – складчатого листа
2 2,5 нм. Они могут быть скручены перпендикулярно цепям.
В некоторых случаях выделяют сверхвторичные структуры – суперспирали (например миозин – 2 – спирали и фибриноген – 3 – спирали), скрученные относительно друг друга. К третичным структурам их отнести нельзя, так как связи опять же между пептидными группами. Сюда же относятся структуры типа или
Третичная структура белка – конформации, стабилизированные слабыми связями между боковыми остатками АК. В основном это Ван–дер–
Ваальсовы и электростатические взаимодействия. Переход в растворе от неупорядоченного клубка в наиболее удобную упаковку третичной структуры происходит от 10
-6
до 10 сек у разных белков. Сегменты белка образуют – спирали и - структуры, которые затем укладываются в глобулы – домены. Домены относительно автономны, могут самостоятельно раскручиваться и, как правило, являются носителями определѐнных функций.
Четвертичная структура белка
Наиболее сложные белки, особенно ферменты, имеют ещѐ более высокую структурную организацию, включающую несколько белковых глобул, объединѐнных гидрофобными взаимодействиями.
64
Согласно модели Бреслера–Тилмуда.
d
r
d
в
S
0 3
,
где в – отношение числа полярных остатков к неполярным остаткам, если в в s
– то глобула в растворе будет сферической формы, если в в s
– то глобула в растворе будет эллипсоидной формы. если в в s
, то неполярные структуры не могут быть полностью закрыты полярными и тогда и образуются олигомерные структуры, стабилизированы гидрофобными взаимодействиями.
Тест–задания
1. Предметом исследования молекулярной биофизики является:
A. Молекулярный состав биомакромолекул
B. Пространственная организация биомакромолекул
C. Химические реакции с участием биомакромолекул
2. К сильным взаимодействиям относятся:
A. Ковалентные связи
B. Водородные связи
C. Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия
D. Гидрофобные взаимодействия
3. К слабым взаимодействиям относятся:
A. Ковалентные связи
B. Водородные связи
C. Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия
D. Гидрофобные взаимодействия
4. Ориентационные взаимодействия возможны в том случае, если:
A. Обе молекулы обладают постоянным дипольным моментом
B. Одна из молекул обладает постоянным дипольным моментом
C. Ни одна из молекул не обладает постоянным дипольным моментом
5. Индукционные взаимодействия возможны в том случае, если:
Рис. 7. Виды четвертичной структуры белка согласно отношению числа
полярных остатков (R
п
) к неполярным остаткам (R
н
)
65
A. Обе молекулы обладают постоянным дипольным моментом
B. Одна из молекул обладает постоянным дипольным моментом
C. Ни одна из молекул не обладает постоянным дипольным моментом
6. Дисперсионные взаимодействия возможны в том случае, если:
A. Обе молекулы обладают постоянным дипольным моментом
B. Одна из молекул обладает постоянным дипольным моментом
C. Ни одна из молекул не обладает постоянным дипольным моментом
7. Ван-дерВаальсовы взаимодействия являются:
A. взаимодействиями электрических зарядов
B. взаимодействиями электрических диполей
C. гидрофобными взаимодействиями
8. Водородные связи имеют природу:
A. Диполь-дипольных взаимодействий
B. Заряд-дипольных взаимодействий
C. Заряд-зарядных взаимодействий
9. Водородные связи образуются между атомом водорода и:
A. Кислорода
B. Азота
C. Углерода
D. Фтора
E. Железа
10. Природа гидрофобных взаимодействий связана:
A. С взаимным притяжением неполярных групп
B. С отталкиванием полярных и неполярных групп
C. С отталкиванием молекул воды неполярными группами
11. Молекула воды является:
A. Неполярным соединением
B. Сильнополярным соединением
C. Амфифильным соединением
12. Молекулы воды связанны друг с другом:
A. Электростатическими взаимодействиями
B. Водородными связями
C. Гидрофобными связями
13. Мерой гидрофобности аминокислот служит:
A. Изменение свободной энергии при переносе из спирта в воду
B. Изменение энтропии при переносе из спирта в воду
C. Изменение свободной энергии при переносе из масла в воду
14. Гидрофобные взаимодействия возможны при следующих условиях:
A. полярный растворитель
B. амфифильность растворенных веществ
C. неполярный растворитель
15. Что такое Дебаевский радиус макромолекулы:
A. Радиус глобулы в полярном растворителе
B. Расстояние, на котором заряд уменьшается в 0,37 раз
C. Минимальное расстояние, на которое могут сблизится молекулы
16. Вискозимитрическим методом можно оценить:
A. Форму макромолекул
66
B. Размеры макромолекул
C. Заряд макромолекул
17. Метод квазиупругого рассеяния света для исследования макромолекул основан:
A. На изменении длинны волны рассеянного света
B. На изменении направления рассеянного света
C. На изменении интенсивности рассеянного света
18. Седиментационный метод позволяет определить:
A. Форму макромолекул
B. Заряд макромолекул
C. Массу макромолекул
19. Метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии позволяет оценить:
A. Кооперативность структурных перестроек в глобуле
B. Размер глобулы
C. Электрический заряд глобулы
20. Метод рентгеноструктурного анализа основан на явлении:
A. Поглощения рентгеновского излучения
B. Дифракции рентгеновских лучей
C. Рассеяния рентгеновских лучей
Правильные варианты ответов:
1. B
2. A
3. B, C, D
4. A
5. B
6. C
7. B
8. B
9. A, B, D
10. C
11. B
12. B
13. A
14. A, B
15. B
16. A, B
17. A
18. B
19. A
20. B
Скачать 1.98 Mb.