Литература для студентов медицинских вузов биохимический практикум под общей редакцией профессора агма д. М. Никулиной
 Скачать 2.08 Mb.
|
ТЕМЫ ДОКЛАДОВ К СЕМИНАРУ1. История изучения и общая схема синтеза белка. 2. Генетический код: кодирующие элементы, свойства. 3. Движение генетической информации. Матричный синтез РНК. РНК-полимеразы. Обратные транскриптазы. 4. Активирование аминокислот и транспорт их к месту синтеза белка. Роль т-РНК как адаптора между нуклеотидами и аминокислотами. 5. Этапы синтеза белка. Строение рибосом, функционирование полирибосом. 6. Механизмы трансляции и синтеза полипептидной цепи: инициация и элонгация упорядоченной расстановки аминокислот. 7. Терминация синтеза белка, формирование вторичной, третичной и четвертичной структур. 8. Регуляция синтеза белка у прокариотов. Теория Ф.Жакоба и Ж.Моно. 9. Регуляция синтеза белка у эукариотов. Гипотеза Г.П. Георгиева. 10. Молекулярные мутации и наследственные болезни. Материал для самоподготовки. I а)1. с. 509-544; II; III. Список дополнительной литературы. 1. БРОДСКИЙ В.Я. и НЕЧАЕВА Н.В.//Ритм синтеза белка. М.: Наука,1988.-239с. 2. ЗЕНГБУШ П.//Молекулярная и клеточная биология. В 3-х томах. М.: Мир.-1982. 3. ЗЕНГЕР В.//Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.:Мир.-1987.-584с. 4. КИСЕЛЕВ Л.Л.//Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-т-РНК.М.:Наука.-1984.-408с. 5. Р.МАРРИ, Д.ГРЕННЕР, П.МЕЙЕЛ, В.РОДУЭЛЛ. //Биохимия человека. В 2-х томах. М.: Мир,1993. 6. СИНГЕР М., БЕРГ П. //Гены и геномы. М.: Мир, 1998.- тт.I,II.-392с. 7. СПИРИН А.С.//Структура рибосом и синтез белка. Пущино,ОНТИ НЦБИ,1984.-367с. 8. ФЕДОРОВ Н.А.//Структура ДНК и трансформация клеток. М.: Медицина.-1983.-158с. 9. ЭЛЛИОТ В., ЭЛЛИОТ Д. //Биохимия и молекулярная биология. М.: Изд-во НИИ биомед.химии РАМН, 1999.-372с. Занятие № 16 КОЛЛОКВИУМ: "МАТРИЧНЫЕ БИОСИНТЕЗЫ. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ" Вопросы к коллоквиуму1. Нуклеиновые основания. Лактим-лактамная таутомерия. 2. Минорные основания, их таутомерные формы. Псевдонуклеозиды. 3. Нуклеозиды и нуклеотиды. Примеры. 4. Строение нуклеозидмонофосфатов, схемы неполного и полного гидролиза. Циклическая АМФ. 5. Строение нуклеозидди- и нуклеозидтрифосфатов, схемы неполного и полного гидролиза. Макроэргические связи. 6. Первичная структура ДНК. Правила Чаргаффа. 7. Вторичная и третичная структура ДНК. 8. Первичная структура и типы РНК, их локализация в клетке. 9. Особенности строения разных типов РНК. Представления о вторичной и третичной структуре РНК на примере тРНК. 10. Комплементарность гетероциклических оснований (нуклеотидов). Роль водородных связей в формировании вторичной структуры нуклеиновых кислот. 11. Репликация ДНК и фазы клеточного цикла. ДНК-полимеразы. Повреждения ДНК и их репарация. 12. Биосинтез РНК (транскрипция). РНК-полимеразы. 13. Природа генетического кода. Постулаты Ф.Крика. 14. Основные компоненты белоксинтезирующей системы и этапы синтеза белка. Направление движения генетической информации. 15. Активирование аминокислот (синтез аминоацил-тРНК) и транспорт их к месту синтеза белка. тРНК как адаптор. Субстратная специфичность аминоацил-тРНК-синтетазы. 16. Строение и функционирование рибосом и полирибосом. 17. Стадии синтеза белка: инициация трансляции. 18. Стадии синтеза белка: элонгация трансляции. 19. Стадии синтеза белка: терминация трансляции и формирование вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. 20. Ингибиторы матричных синтезов: лекарственные препараты, вирусные и бактериальные токсины. 21. Регуляция действия генов. Понятие об оперонах. Репрессия и индукция синтеза белков у прокариотов (теория Ф.Жакоба и Ж.Моно). 22. Индукция и репрессия синтеза белков в организме человека (у эукариотов). Роль гормонов в регуляции действия генов. 23. Клеточная дифференцировка и онтогенез как результат дифференциальной активности генов. Изменение белкового состава клеток при дифференцировке. 24. Биохимические основы медицинской генетики. Молекулярные механизмы генетической изменчивости: мутации, рекомбинации. 25. Генотипическая гетерогенность популяций и полиморфизм белков на примере гемоглобина и некоторых ферментов. 26. Молекулярные мутации и наследственные болезни. Биохимические методы в диагностике врожденных заболеваний. РАЗДЕЛ VI. Б И О Х И М И Я К Р О В И Занятие № 17 ТЕМА: БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ Цель занятия: 1.Знать основные белки плазмы крови, их функции и особенности структуры. 2.Ознакомиться с методами разделения белков. Исходный уровень знаний: - структура и биологическая роль белков; - классификация белков; - различие альбуминов и глобулинов; - энзимодиагностика. Содержание занятия. I.2. Физиологическая роль белков плазмы крови. Характеристика отдельных белков. Понятие о нормо-, гипо- и гиперпротеинемии. Диспротеинемии, парапротеинемии, дефектопротеинемии. Эмбриоспецифические белки. II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ Принцип метода. Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди (сульфата меди) в щелочной среде (биуретовый комплекс). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически. Порядок выполнения работы:
Осторожно перемешать, оставить на 30 минут в штативе при комнатной температуре. Фотоколориметрировать при зеленом светофильтре 540 нм против контрольного раствора. Определив экстинкцию исследуемого раствора, найти по графику, какой концентрации белка (в г/л) она соответствует. РЕЗУЛЬТАТ: ВЫВОД: Клинико-диагностическое значение. Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови у взрослых 65-85 г/л (6,5-8,5 г%), у детей до 6 лет - 56-85 г/л (5,6-8,5г%). Повышение содержания белка (гиперпротеинемия) наблюдается при ревматизме и миеломной болезни (плазмоцитоме) - до 120-150 г/л. Кратковременная относительная гиперпротеинемия отмечается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости, например, при усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, профузных поносах, несахарном диабете, холере, тяжелых ожогах. Понижение уровня белка (гипопротеинемия) имеет место при нефритах, злокачественных опухолях, алиментарной дистрофии. Работа № 2. ТИМОЛОВАЯ ПРОБА. Принцип метода. Патологически повышенные -глобулины, -глобулины и липопротеиды осаждаются из сыворотки крови насыщенным тимолом. Измеряют интенсивность помутнения, зависящую от содержания белковых фракций и их количественных соотношений. Порядок выполнения работы
Перемешать и выдержать точно 30 минут при комнатной температуре, после этого вновь перемешать и измерить оптическую плотность пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при длине волн 650 нм (светофильтр № 4). РЕЗУЛЬТАТ: ВЫВОД: Клинико-диагностическое значение. Нормальные величины: 0-4 единиц S-H (единицы помутнения по Shank-Hoagland). Повышение тимоловой пробы наиболее характерно для заболеваний печени (ещё до появления желтухи). Патологические величины - более 5 единиц S-H. Работа № 3. ПРОБА ВЕЛЬТМАНА Принцип метода. При добавлении к сыворотке раствора хлорида кальция и нагревании происходит нарушение коллоидальной устойчивости сыворотки. Порядок выполнения работы. К 0,1 мл сыворотки прибавить 4,9 мл воды, перемешать, опрокидывая пробирку, и прибавить 0,1 мл 0,5% раствора хлорида кальция. Встряхивать и нагревать пробирку над пламенем до однократного закипания смеси. Охладить пробирку и осмотреть на свету. Если хлопьев нет, то в эту же пробирку добавить еще 0,1 мл хлорида кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторить, пока не выпадут хлопья. Результаты оценить, подсчитав общее количество пошедшего на реакцию хлорида кальция. РЕЗУЛЬТАТ: ВЫВОД: Клинико-диагностическое значение. В норме коагуляция наступает при прибавлении 0,4-0,5 мл раствора хлорида кальция. Проба Вельтмана снижена при паренхиматозном поражении печени и малярии. Коагуляция при добавлении большего количества раствора хлорида кальция наблюдается при ревматизме, туберкулезе легких. Все последующие работы демонстрируются преподавателем. Работа № 4. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРЕ ПО ОУХТЕРЛОНИ Принцип метода. П  ри встречной диффузии в агар молекулы антигена и антител реагируют между собой, образуя преципитат. Линия преципитации становится видимой в проходящем луче света, если реагирующие компоненты находятся в оптимальном соотношении. С помощью этого метода можно провести анализ антигенной смеси, т.к. каждая пара антиген-антитело образует свою линию преципитации, и сравнить антигенные компоненты в различных системах. Рис. 4. Полуколичественный учет результатов анализа. 1- антисыворотка, 2 -тест-антиген, 3-10 - последовательное разведение исследуемой пробы: 1/1, 1/2, 1/4, и т.д. до 1/128. Работа № 5. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ, В АГАРОВОМ И В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЯХ Принцип метода. Молекулы белков обладают свободным электрическим зарядом, величина которого и знак зависят от соотношения основных и кислых ионизированных групп в молекуле. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы белка передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Разделение смеси белков на отдельные фракции происходит в результате различия относительной молекулярной массы и зарядов молекул белков, которые перемещаются в электрическом поле неодинаково. Скорость передвижения белковых молекул пропорциональна величине их свободного заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации. Электрофоретическое разделение белков широко используется как для диагностики заболеваний, так и для препаративных целей.  Рис. 5а. Разделение сыворотки крови человека с помощью электрофореза в геле агарозы и кривые, полученные при денситометрическом измерении электрофореграмм. Нормальная сыворотка (А) и сыворотки больных с множественной миеломой (Б), циррозом печени (В) и нефротическим синдромом (Г).  Рис.5б. Разделение белков сыворотки крови в полиакриламидном геле с линейным градиентом концентраций в пределах 4-30%. Работа № 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА Принцип метода. Иммуноэлектрофорез впервые был предложен Грабарем и Уильямсом в 1953 году и представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с последующей иммунопреципитацией в геле, что значительно повышает чувствительность метода. С помощью иммуноэлектрофореза можно провести анализ антигенной смеси, качественное и количественное определение известного антигена. Так, например, в сыворотке крови здорового взрослого человека данным методом можно выделить более 30 различных белковых фракций. В зависимости от поставленных целей можно использовать различные варианты иммуноэлектрофореза.  1  глобулины Альбумин старт 2 а) |