Литература для студентов медицинских вузов биохимический практикум под общей редакцией профессора агма д. М. Никулиной

• Название: Литература для студентов медицинских вузов биохимический практикум под общей редакцией профессора агма д. М. Никулиной
• Дата: 20.09.2019
• Размер: 2.08 Mb.
• Имя файла: Biokhimicheskiy_praktikum_chast_1.doc
• Тип: Литература; #87283
• страница: 4 из 5

Занятие № 3

ТЕМА. КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ. ХИМИЯ ПРОСТЫХ И

СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ
Цель занятия: 1.Ознакомиться с классификацией белков, харак-

теристиками отдельных групп белков и пептидов.

2.Освоить методы осаждения белков.

Исходный уровень знаний:

- строение и свойства белков;

- биологическая роль белков.

Содержание занятия.

I.2. Характеристика основных групп простых белков.

Принцип классификации сложных белков.

Характеристика природных пептидов.

Содержание белков и аминокислот в крови в норме и при патологии.

I.3. Контрольная работа.
СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ

ПО РАЗДЕЛУ "СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА БЕЛКОВ"
1. Определение класса белков. Элементарный состав, наименьшая структурная единица, молекулярная масса белков.

2. Классификация аминокислот, входящих в состав белков, основанная на полярности радикалов; примеры неполярных, полярных, положительно- и отрицательно заряженных аминокислот.

3. Амфотерность и растворимость аминокислот. Функциональные группы аминокислот, участвующие в образовании ковалентных, ионных, электростатических и гидрофобных (Ван-дер-Ваальса) связей белковой молекулы.

4. Структура и название аминокислот, производных пропионовой, масляной, валериановой, капроновой, янтарной и глутаровой кислот.

5. Структура и название окси- и серусодержащих, гомо- и гетероциклических аминокислот.

6. Факторы, удерживающие белок в растворе. Изоэлектрическая точка белков. Методы осаждения белков, значение для медицины. Обратимое и необратимое осаждение. Примеры.

7. Основные физико-химические свойства белков. Свойства коллоидных растворов, отличительные от свойств истинных растворов. Методы выделения и очистки белков. Диализ, значение для медицины.

8. Методы обнаружения белков в растворе и изучения качественного состава белка. Гидролиз белка, виды гидролиза, промежуточные и конечные продукты. Применение белковых гидролизатов в лечебной практике.

9. Назовите трипептид, например:
H₃C-CH-CH₂-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH

| | | |

CH₃ NH₂ CH₃ CH₂

|

CH₂-S-CH₃


-CH₂-CH-CO-NH-CH-CO-N

| | |

NH₂ (CH₂)₃ COOH

|

CH₂NH₂
10. Напишите трипептид: а) глицил-валил-изолейцин;

б) лейцил-тирозил-гистидин; в) аланил-метионил-триптофан и т.п.

11. Белки - основа жизненных процессов. Значение работ А.Я.Данилевского, Э.Фишера, Л.Полинга в формировании представлений о строении белков. Уровни структурной организации белковой молекулы.

12. Первичная структура, формирующие её связи. Зависимость биологических свойств белков от характера аминокислотной последовательности в полипептидной цепи ( HbA, HbS ).

13. Конформация пептидных цепей в белках: вторичная и третичная структуры, связи, определяющие эти структуры. Об-ратимая и необратимая денатурация белков; причины, значение.

14. Высшая форма организации белковой молекулы - четвертичная структура. Кооперативные изменения конформации протомеров (на примере гемоглобина и миоглобина).

15. Зависимость функциональных свойств белков от их конформации. Способность к специфическим взаимодействиям ("узнавание") как основа функционирования всех белков. Антигенные свойства белков.

16. Биологические функции белков. Различия белкового состава органов. Изменение белкового состава при онтогенезе и болезнях.

17. Классификация белков. Химия сложных белков. Важ-нейшие представители простых и сложных белков в организме человека.

18. Структурные белки. Классификация, особенности строения, распределение в тканях. Самосборка многомолекулярных белковых структур на примере коллагеновых волокон.
II.1. Работа № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ КИПЯЧЕНИИ

Принцип метода основан на денатурации большинства белков при нагревании их растворов при температуре свыше 5О-6О⁰С, что приводит к потере растворимости, особенно в изоэлектрической точке.

Почти все белки свертываются и осаждаются при нагревании в нейтральной и слабокислой среде. В сильнокислых и щелочных средах растворы белков при кипячении денатурируют, но не коагулируют и могут дать осадок лишь при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли (NaCl, сернокислый аммоний и др.). Устойчивость белка в растворе зависит от приобретения (+) заряда в случае сильнокислой среды и усиления (-) заряда в щелочной среде.
+H⁺ -H⁺

H₃N⁺-CH-COOH H₃N⁺-CH-COO^- H₂N-CH-COO<sup>-

| | |</sup>

R R R

молекула заряжена цвиттерионная молекула заряжена

"+" форма аминокислоты "-"

рН = 2-3 рН = 4-9 рН = 9-10

(биполярная форма)

При понижении рН диссоциация карбоксильной группы подавляется и молекула становится положительно заряженной. При повышении pH происходит отрыв связанного протона аминокислоты и молекула приобретает отрицательный заряд. Более полное и быстрое осаждение происходит при достижении изоэлектрической точки. Изоэлектрической точкой называют такое значение рН, при котором суммарный электрический заряд белка равен нулю и, следовательно, белок при этом в электрическом поле теряет подвижность, т.е. остается на старте. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой среде (в пределах от 5,5 до 6,9).

Итак, важную роль в денатурации белков при нагревании играет концентрация водородных ионов, т.е. определенная реакция среды, и присутствие солей.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.)	Пробирки
	1	2	3	4	5
1% раствор яичного белка	10	10	10	10	10
1% раствор CH3COOH	-	2	10	10	-
насыщенный раст-вор NaCl	-	-	-	4	-
10% раствор NaOH	-	-	-	-	4
КИПЯЧЕНИЕ
Реакция среды	Нейт-ральная	слабо-кислая	сильнокислая	сильнокислая, + электролит	щело-чная
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:


Работа № 2a. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ СОЛЯМИ

ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ

Принцип метода.

Осаждение белков солями тяжелых металлов в отличие от высаливания происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя солеобразные и комплексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исключением солей AgNO₃, HgCl₂), но нерастворимые в воде.

Растворение осадка в избытке солей называется адсорбционной пептизацией. Данное явление происходит вследствие возникновения одноименного (+) заряда на частицах белка. Способность белка прочно связывать ионы тяжелых металлов в виде нерастворимых осадков в воде используется как противоядие при отравлении солями ртути, меди, свинца и др. Обычно применяют белки молока и яиц сразу после отравления, пока эти соли еще находятся в желудке и не успели всосаться. Вслед за введением белка у больного вызывают рвоту, чтобы удалить остатки яда из организма.

Порядок выполнения работы.

Реактивы (кап.)	Пробирки
	1	2	3
а) Раствор яичного белка	5	5	5
1% раствор CuSO4	2	-	-
5% раствор Pb(CH3COO)2	-	2	-
5% pаствор AgNO3	-	-	2
РЕЗУЛЬТАТЫ:
б) продолжение опыта в тех же пробирках (добавить)
1% раствор CuSO4	5-10	-	-
5% pаствоp Pb(CH3COO)2	-	5-10	-
5% pаствоp AgNO3	-	-	5-10
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:
Работа № 2б. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАН-

НЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Принцип метода.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатурацию белка и образуют комплексные соли белка с кислотами. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется. Качественная реакция с концентрированной HNО₃ лежит в основе количественного определения белка в моче по методу Робертса-Столь-никова-Брендберга.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.)	I этап		II этап
	Пробирки
	1	2	1	2
Концентрированная HNO3	10	-	10	-
Концентрированная H2SO4	-	10	-	10
Раствор белка	10	10	-	-
Примечание: Раствор белка осторожно наслоить на кислоту по стенке пробирки, наклоненной под углом 450.
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:






2

1


Рис. 2. Наслаивание пробы на концентрированную кислоту:

1 -раствор белка; 2-кислота.
III.2. Контрольные вопросы.

Какие факторы удерживают белки в растворе?

Чем обусловлена реакция осаждения белков?

Что такое коагуляция белков? Виды коагуляции.

Что такое денатурация белка? Виды денатурации.

При каких условиях происходит: коагуляция

с денатурацией; коагуляция без денатурации;

денатурация без коагуляции?

Что такое адсорбционная пептизация?

Как используется в медицине реакция адсорбционной

пептизации?

Материал для самоподготовки: I а)1. с.19-74, 662-565. II, III.
РАЗДЕЛ II. ФЕРМЕНТЫ
Занятие № 4
ТЕМА. СТРОЕНИЕ И ОСНОВНЫЕ

СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

Цель занятия: 1.Повторить материал по физико-химическим

свойствам белков.

2.Ознакомиться с современными представлениями о структу-

ре ферментов, изучить их характерные свойства.

Исходный уровень знаний:

- строение и физико-химические свойства белков;

- понятие о катализаторах.

Содержание занятия.

I.2. Понятие о катализе.

Химическая природа ферментов.

Свойства ферментов.

Строение ферментов (функциональные центры, их строение).

Факторы, определяющие активность ферментов.

Витамины как коферменты.

Понятие об изоферментах.

Мультимолекулярные ферментные системы.
II.1.Работа № 1.ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА

АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Принцип метода и химизм.

Амилаза слюны (-1,4-гликозидаза) катализирует гидролиз -1,4-гликозидной связи крахмала и гликогена до дисахарида мальтозы с промежуточным образованием декстринов различного размера. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, амилодекстрины - фиолетовое, эритродекстрины - красно-бурое, ахродекстрины и мальтоза - желтое (цвет водного раствора йода, т.е. окрашивания с йодом не дают). Конечные продукты гидролиза крахмала - мальтоза и глюкоза - имеют свободную альдегидную группу и могут быть обнаружены реакцией Троммера, в основе которой лежит окислительно-восстановительная реакция. При нагревании альдегидная группа окисляется до глюконовой кислоты, а медь гидрата окиси меди (голубого цвета) - восстанавливается в гидрат закиси меди (желтого цвета). При дальнейшем нагревании образуется красная закись меди:

H O

C=O + 2CuSO₄ + 5NaOН  C–O–Na + 2CuOH + 2Na₂SO₄ + 2H₂O

R R
Одним из характерных свойств ферментов является термолабильность, т.е. чувствительность фермента к температуре. Для многих ферментов максимальная ферментативная скорость наблюдается при 38-40⁰C. Эта температура называется температурным оптимумом. При нагревании свыше 70⁰С они утрачивают свои свойства биологических катализаторов. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. Замедление и прекращение ферментативной реакции происходит вследствие тепловой денатурации белковой молекулы фермента. При низких температурах ферменты не денатурируются, но скорость реакции резко снижается за счет снижения кинетической энергии молекул. О действии фермента судят по исчезновению субстрата или появлению продуктов реакции.

Порядок выполнения работы:

В чистую пробирку собрать примерно 2 мл нативной (неразведенной) слюны и кипятить в течение 5 минут, охладить.

Реагенты (кап.)	Пробирки
	1-я	2-я	3-я
1% раствор крахмала	10	10	10
Нативная слюна, разведенная в 10 раз	10	-	-
Прокипяченная неразведенная слюна	-	10	-
Дистиллированная вода	-	-	10
Поместить в термостат при 380С на 10 мин. Из содержимого каждой пробирки отлить по 5 капель в дополнительные пробирки. а) йодная проба (на крахмал)
Реагенты (кап.)	Пробирки
	1-а	2-а	3-а
Исследуемый раствор	5	5	5
Раствор йода в йодистом калии	1	1	1
РЕЗУЛЬТАТЫ:
б) реакция Троммера (на глюкозу и мальтозу)
Реагенты (кап.)	1-б	2-б	3-б
Исследуемый раствор	5	5	5
10% раствор NаОН	5	5	5
1% раствор CuSO4	3	3	3
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:


Работа № 2. ВЛИЯНИЕ РЕАКЦИИ СРЕДЫ НА АКТИВ-

НОСТЬ ФЕРМЕНТОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ОПТИМУМА рН

Принцип метода и химизм.

Для разных ферментов существует свой оптимум рН среды, когда фермент наиболее активен. Например, оптимум рН пепсина (фермент желудочного сока) - 1,5-2,0; аргиназы (фермент печени) - 9,5. Для амилазы слюны оптимум рН - 6,8-7.2; в кислой и щелочной среде активность ее снижается за счет взаимодействия белковой молекулы с ионами раствора.

Химизм реакции см. выше (раб. N1).

Порядок выполнения работы:

Слюну развести в 10 раз. Взять 5 пробирок и приготовить смеси в соответствии с таблицей (все растворы берутся в каплях).

Реактивы	Пробирки
	1	2	3	4	5
раствор 1	5	5	5	5	5
раствор 2	8	6	5	3	1
1% раствор NaCl	7	9	10	12	14
рН	5,8	6,9	7,4	7,9	8,5
0,5% раствор крахмала	7	7	7	7	7
Слюна разведенная	7	7	7	7	7
Перемешать, поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут
раствор йода	1	1	1	1	1
Окраска
Продукты гидролиза крахмала

ВЫВОД:
Работа № 3. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ

АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Принцип метода.

Ферменты обладают специфичностью, т.к. способны катализировать только определённые химические реакции. Специфичность действия ферментов бывает абсолютная, относительная и стереохимическая. Она определяется тем, что только некоторые строго определённые функциональные группы, входящие в состав ферментов, могут участвовать в образовании фермент-субстратных комплексов.

Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов, не оказывая действия на дисахариды. Мальтаза слюны ускоряет гидролиз образующегося дисахарида мальтозы и не оказывает действия на сахарозу.

Химизм реакции см. в работе N 1.

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.)	1-я пробирка	2-я пробирка
Слюна, разведенная 1:5	5	5
1% раствор крахмала	10	-
1% раствор сахарозы	-	10
Поместить в термостат при температуре 380С на 10 минут
Реактив Фелинга	9	9
Нагреть до кипения и кипятить 1 мин
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Как и почему активность ферментов зависит от температуры?

Что такое температурный оптимум ферментов?

Как и почему активность ферментов зависит от рН среды

(график)?

Какие ферменты активны в кислой; нейтральной;

щелочной среде?

Что такое специфичность ферментов?

Какие виды специфичности ферментов Вы знаете?

Примеры.

Укажите качественную реакцию на крахмал.
Материал для самоподготовки: I а) 1. с.44-49, 114-129,

139-143; II; III.

Занятие № 5
ТЕМА. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ,

КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Цель занятия: Ознакомиться с современными представлениями о механизме действия ферментов и кинетике ферментативных реакций.

Исходный уровень знаний:

- белковая природа ферментов;

- структура сложных ферментов;

- строение молекулы фермента;

- кинетика химических реакций.

Содержание занятия.

I.2. Современные представления о механизме действия ферментов (гипотеза Фишера, Кошланда).

Полифункциональный катализ.

Кинетика ферментативных реакций. Константа Михаэлиса.

Зависимость активности ферментов от различных факторов.

Определение активности ферментов: принцип, значение в медицине.

II.1. Работа № 1. АКТИВНОСТЬ  - АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ.

Принцип метода.

Метод основан на определении наименьшего количества амилазы (при максимальном разведении слюны), полностью расщепляющего весь добавленный крахмал. Амилазная активность слюны выражается количеством (в мл) 0,1% раствора крахмала, которое расщепляется 1 мл неразведенной слюны при температуре 38⁰С в течение 30 минут. В норме амилазная активность равна 160 - 320. Амилазная активность обозначается А 38⁰/30'. Этот метод широко используется для определения амилазной активности крови и мочи.

Порядок выполнения работы:

В 10 пробирок налить по 1 мл воды. В 1-ю пробирку добавить 1 мл слюны, разведённой в 10 раз. Содержимое пробирки перемешать несколько раз, втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набрать в пипетку 1,0 мл смеси и перенести её во 2-ю пробирку. Содержимое тоже перемешать и 1,0 мл перенести в 3-ю пробирку и т. д. до 10 пробирки. Из 10-ой пробирки 1,0 мл смеси вылить.


1 мл слюны


1 мл смеси



1 мл воды

n

I II III




Рис. 3. Разведение слюны
Во все пробирки добавить по 1,0 мл воды и по 2,0 мл 0,1% раствора крахмала, встряхивая, перемешать и поместить в термостат при 38⁰С на 30 минут. После инкубации пробирки охладить водопроводной водой, добавить по 1 капле 0,1% раствора йода и перемешать. Отметить окраску в каждой пробирке и, пользуясь таблицей, сделать расчет.

Расчет: отметить пробирку, где гидролиз крахмала прошел полностью при наименьшем количестве фермента и по количеству неразведённой слюны (А) в данной пробирке рассчитать амилазную активность (Х) следующим образом:

А мл слюны расщепили 2,0 мл 0,1% раствора крахмала.

1 мл слюны расщепил Х мл раствора крахмала.

В 3-й пробирке, например, А =1/80 мл.

	Пробирки
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разведение слюны
Окраска р-ра с йодом

ВЫВОД:

Работа № 2. АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

(ДИАСТАЗЫ) МОЧИ

Принцип метода.

Метод основан на определении времени, необходимого для полного расщепления крахмала в присутствии 1 мл мочи. Условно за единицу активности амилазы мочи принимают количество фермента, расщепляющего 2 мг крахмала за 15 минут. Активность амилазы выражают количеством единиц в 1 мл мочи. В норме она составляет 1-2 ЕД, а по методу Вольгемута колеблется от 16 до 64 ЕД.

Моча здоровых людей обладает низкой амилазной активностью по сравнению с амилазой слюны. Определение активности -амилазы в моче и сыворотке крови широко используется в клинике при диагностике заболеваний поджелудочной железы. В первые сутки заболевания амилазная активность увеличивается в моче и сыворотке крови в десятки раз, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.

В детском возрасте увеличение активности амилазы наблюдается при эндемическом паротите, что указывает на одновременное поражение поджелудочной железы вирусом паротита. Вирус гриппа также поражает поджелудочную железу, но реже.

Порядок выполнения работы.

На сухую чашку Петри капнуть в разных местах по 1 капле 0,1% раствора йода в йодиде калия (всего 8-10 капель). В пробирку внести 2 мл 0,1% раствора крахмала, содержащего 2 мг крахмала, 1 мл 0,85% р-ра хлорида натрия и поместить пробирку в термостат при 37⁰С на 2 минуты. Через 2 минуты добавить в пробирку 0,5 мл мочи, перемешать и отметить время начала реакции. Затем каждые 2-3 минуты переносить каплю смеси из пробирки на чашку Петри в каплю раствора йода до появления желтой (или бесцветной) окраски и отметить время реакции в минутах. Активность амилазы мочи рассчитать по формуле:

15

Х =

Т ∙ 0,5

где Х - активность амилазы в 1 мл мочи;

15 - время, необходимое для полного расщепления 2 мг крахмала в минутах;

0,5 - количество мочи, взятое в реакционную смесь в мл;

Т - время реакции в минутах.
РЕЗУЛЬТАТ:


ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Какую реакцию катализирует амилаза?

Укажите промежуточные и конечные продукты гидролиза

крахмала.

Чему равна в норме диастаза мочи?

При каких заболеваниях повышается активность диастазы

мочи (у взрослых и детей)?

Когда в моче отсутствует амилаза?

Напишите формулы витаминов В₂ и РР, укажите

соответствующие коферменты.
Материал для самоподготовки: Iа) 1. с.129-139, 143-152; II; III
Занятие № 6
ТЕМА. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ.

КЛАССИФИКАЦИЯ, НОМЕНКЛАТУРА И

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ.
Цель занятия: Ознакомиться со способами регуляции ферментов in vivo, принципами количественной характеристики, классификации, номенклатуры ферментов, применением их в медицине.

Исходный уровень знаний:

- строение холоферментов;

- специфичность действия ферментов;

- механизм образования фермент-субстратного комплекса;

- зависимость активности ферментов от различных факторов.

Содержание занятия.

I.2. Факторы, регулирующие активность ферментов in vivo.

Активирование ферментов, его виды.

Типы ингибирования ферментов.

Классы ферментов, примеры.

Номенклатура ферментов.

Разделы медицинской энзимологии, примеры.

Иммобилизованные ферменты.

Ферменты плазмы крови.
II.1. Работа № 1. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТО-

РОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ
Принцип метода и химизм.

Активаторы стимулируют действие ферментов, но не принимают участия в реакции. Активаторы некоторых ферментов: для амилазы слюны - хлорид натрия; для пепсина - ионы Н⁺ хлористо-водородной кислоты; для липазы - желчные кислоты; для аденозинтрифосфатазы - Мg⁺⁺, Mn⁺⁺.

Ингибиторы тормозят действие ферментов вплоть до полной остановки реакции. Ингибиторами часто являются продукты промежуточных или конечных реакций какого-либо биохимического процесса. Примеры ингибиторов: ДФФ (диизопропилфторфосфат) - для холинэстеразы и трипсина; синильная кислота - для цитохромоксидазы; малоновая кислота - для сукцинатдегидрогеназы; сульфат меди - для амилазы слюны.

Активаторы и ингибиторы изменяют активность фермента, влияя на его активный или аллостерический центр.

Химизм реакции см. в работе № 1 (занятие № 4).

Порядок выполнения работы:

Реактивы (кап.)	Пробирки
	1	2	3
Слюна - 1:40 (в мл)	1	1	1
Н2О	2	-	-
1% раствор NaCl	-	2	-
1% раствор CuSO4	-	-	2
1% раствор крахмала	5	5	5
Инкубировать при комнатной температуре 2 мин
Раствор йода	1	1	1
Н2О (в мл)	2	2	2
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода.

Метод определения амилазы основан на определении остатка нерасщепленного крахмала и промежуточных продуктов его гидролиза (декстринов). У здорового человека из переварившегося под влиянием амилазы крахмала образуется 25-40 мг глюкозы. Амилаза (диастаза) сыворотки крови значительно активируется при таких заболеваниях как сахарный диабет, болезни поджелудочной железы, инфекционный паротит и некоторых других.

Порядок выполнения работы:

Свежую сыворотку крови в объеме 0,1 мл (набрать микропипеткой) нагреть в закрытой пробкой пробирке в термостате при 38⁰С в течение 1-2 минут. Затем добавить 0,25 мл 0,1% раствора крахмала и вновь поместить в термостат при той же температуре на 15 минут, периодически встряхивая. После инкубации капнуть 0,025 N раствор йода и отметить окраску. Количество глюкозы, соответствующее количеству расщепленного крахмала, найти по следующей таблице:

ОКРАСКА	Глюкоза в мг
Голубая	около 20
Голубовато-зеленая	25-35
Цвет желчи	35-40
Желтая	40-60
Оранжево-красная	выше 60
РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.

Укажите роль активаторов и ингибиторов ферментативной реакции.

Какие вещества могут выступать в роли активаторов и ингибиторов ферментов?

Указать нормальное содержание амилазы в крови человека.

Укажите клиническое значение определения диастазы сыворотки крови.

Что является ингибитором амилазы слюны?

Что является активатором амилазы слюны?
Материал для самоподготовки: I а)1. с.152-168, 579-580; II; III.

Занятие № 7
КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ "ФЕРМЕНТЫ"
Вопросы к коллоквиуму
1. История открытия и изучения ферментов. Значение работ Л.Пастера, М.М.Манассеиной, Э.Бюхнера, Д.Самнера в установлении природы ферментов.

2. Сходство (различие) ферментов и неорганических катализаторов.

3. Общая характеристика ферментов. Биологическая роль ферментов и место энзимологии в биологии и медицине.

4. Химическая природа ферментов. Простые и сложные ферменты.

5. Строение ферментов. Понятие об активном и аллостерическом центрах.

6. Понятие о кофакторах, коферментах и простетических группах. Химическое строение и функции коферментов.

7. Изоферменты как пример биохимического полиморфизма.

8. Мультимолекулярные ферментные системы. Иммобилизованные ферменты.

9. Основы ферментативной кинетики. Константа Михаэлиса.

10. Зависимость активности ферментов от температуры. Как выявить в эксперименте термолабильность ферментов?

11. Зависимость активности ферментов от рН. Как выявить эту зависимость в эксперименте?

12. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента и субстрата.

13. Специфичность действия ферментов. Комплементарность структуры субстрата и активного центра фермента. Виды специфичности ферментов.

14. Строение аллостерических ферментов. Аллостерический переход.

15. Теории действия ферментов как биологических катализаторов.

16. Современная теория ферментативного катализа. Представления о механизме действия ферментов.

17. Полифункциональный катализ. Кислотно-основной (электрофильно-нуклеофильный) катализ.

18. Регуляция активности действия ферментов.

19. Активирование ферментов. Виды активирования. Про-ферменты.

20. Ингибирование ферментов. Обратимые, необратимые и конкурентные ингибиторы. Применение ингибиторов в качестве лекарств.

21. Принципы количественного определения ферментов.

Единицы активности и количества ферментов. Измерение активности ферментов с диагностической целью.

22. Энзимопатии: наследственные (первичные), вторичные. Нарушения обмена при алкаптонурии, фенилкетонурии, гипераммониемии и др.

23. Различия ферментного состава органов и тканей. Органоспецифические ферменты. Ферменты плазмы крови. (Изменение ферментного состава при онтогенезе).

24. Классификация и номенклатура ферментов.

25. Понятие об энзимодиагностике и энзимотерапии.
РАЗДЕЛ III. ВИТАМИНЫ
Занятие № 8
ТЕМА. КЛАССИФИКАЦИЯ, СТРУКТУРА И БИО-

ЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ.

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНОВ
Цель занятия: Уяснить роль витаминов в метаболизме, их классификацию, характеристику представителей каждого класса витаминов.

Исходный уровень знаний:

- общие понятия о витаминах, их биологическом значении;

- симптомы некоторых гиповитаминозов;

- пути поступления в организм.

Содержание занятия.

I.3. Контрольная работа.

 

СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ

ПО РАЗДЕЛУ "ВИТАМИНЫ"
1. История изучения витаминов. Вклад отечественных ученых.

2. Определение класса "Витамины", функции витаминов, их участие в метаболизме.

3. Классификация витаминов, буквенные обозначения, эмпирические названия.

4. Жирорастворимые витамины: биологическая роль, источники, формулы витаминов А и D₃.

5. Водорастворимые витамины: биологическая роль, источники; формулы витаминов В₁, В₂, В₃, В₆, РР, Н, С.

6. Витаминоподобные вещества: названия, биологическая роль; формулы липоевой кислоты, холина, инозита, KoQ, парааминобензойной кислоты.

7. Понятие об алиментарных и вторичных авитаминозах, гипо- и гипервитаминозы.

8. Причины развития гиповитаминозов.

9. Заболевания, связанные с избытком, недостатком или отсутствием витаминов в организме. Укажите их основные симптомы.

10. Коферментные функции витаминов; формулы НАД (НАДФ), ФАД (ФМН), ПФ, ТДФ.

11. Понятие об антивитаминах и механизм их действия.

12. Структурные аналоги витаминов - лекарственные средства, область их применения.

13. Провитамины. Провитамин А.

14. Определение веществ по формуле. Например:
СНОН

СООН НОНС СНОН

НОНС СНОН

N CНОН

II.1. Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ

НА ВИТАМИН В₂

Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов - флавопротеидов в виде коферментов флавинадениндинуклеотида (ФАД) и флавинмононуклеотида (ФМН). Флавопротеиды участвуют в реакции дегидрирования, т.е. отщепления электронов и протонов от субстрата. Они участвуют в окислении НАД*Н (Н⁺) в цепи биологического окисления -аминокислот, -кетокислот и других субстратов.

Принцип метода и химизм реакции.

Окисленная форма витамина В₂ представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витамин В₂ основана на его способности легко восстанавливаться. При этом раствор витамина В₂, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточных соединений, а затем обесцвечивается, т.к. восстановленная форма витамина В₂ бесцветна.
CH₂-(CHOH)₃-CH₂OH CH₂-(CHOH)₃-CH₂OH

| |

N N N NH

H₃C- ═O H₃C- ═O

+Zn+2HCl

Н₃С- NH H₃C- NH

N ║ NH ║

O O

Рибофлавин (В₂) Рибофлавин (В₂)

окисленный восстановленный

(желтый) (бесцветный)
Порядок выполнения работы:

К 10 каплям раствора витамина В₂ добавить 5 капель концентрированной хлористо-водородной кислоты и опустить зёрнышко металлического цинка.

Результат:

Работа № 2. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ

НА ВИТАМИН РР

Витамин РР входит в состав коферментов пиридинзависимых ферментов: никотинамидадениндинуклеотида - НАД⁺ и никотинамидадениндинуклеотидфосфата - НАДФ⁺. Эти коферменты входят в состав дегидрогеназ и участвуют во многих окислительно-восстановительных реакциях. Отсутствие витамина РР в пище вызывает пеллагру.

Принцип метода.

Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди

образует синий плохо растворимый осадок медной соли никотиновой кислоты.

Порядок выполнения работы:

Перед определением 3% раствор витамина РР следует обязательно взболтать. Затем набрать 20 капель его и нагреть до кипения; при этом мутный раствор становится прозрачным. Прилить, предварительно взболтав, 20 капель 5% раствора ацетата меди к нагретому раствору витамина РР. Затем содержимое пробирки довести до кипения и сразу охладить под струёй холодной воды.

РЕЗУЛЬТАТ:


Работа № 3. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА ВИТАМИН С

Аскорбиновая кислота связана с системой глутатиона и участвует в тканевых окислительно-восстановительных процессах. Она необходима для гидроксилирования стероидных гормонов, образования гидрофолиевой кислоты, активации дофамингидроксилазы.

Принцип метода.

Аскорбиновая кислота способна легко окисляться и восстанавливать различные вещества (железосинеродистый калий, метиленовую синь, молекулярный йод, 2,6 - дихлорфенолиндофенол и др.).
1. O OH

|

O=C-CHO=COH-CH-CH-CH₂OH+2K₃Fe(CN)₆+2KOH
O OH

|

---->O=C-CO-CO-CH-CH-CH₂OH+2K₄Fe(CN)₆+2H₂О
2. 3K₄Fe(CN)₆+4FeCl₃ Fe₄[Fe(CN)₆]₃+12KCl

берлинская лазурь (синего цвета)
Порядок выполнения работы:

К 5 каплям 1% раствора витамина С прилить 1 каплю 10% раствора едкого натра и 1 каплю 5% раствора железосинеродистого калия, перемешать, добавить 3 капли 10% раствора соляной кислоты и 1 каплю 1% раствора хлорного железа.

РЕЗУЛЬТАТ:

III.2. Контрольные вопросы.

В состав каких коферментов входит витамин В₂?

Как выявить окисленную и восстановленную формы рибофлавина?

В каких реакциях участвует аскорбиновая кислота?

На чем основан принцип выявления аскорбиновой кислоты?

В состав каких коферментов входит витамин РР?

Какое заболевание развивается при отсутствии в пище витамина РР?
Материал для самоподготовки: I а)1. с.204-247; II; III.

РАЗДЕЛ IV. ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН
Занятие № 9

ТЕМА. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЦЕПЬ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ И ПРОТОНОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРОЭРГОВ.

Цель занятия: 1.Сформировать знания о биологическом окисле

нии как источнике энергии в живых системах.

2.Усвоить структуру и биологическую роль макроэргов, ды-

хательных ферментов и их коферментов.

3.Познакомиться с методикой определения макроэргов.

Исходный уровень знаний:

- понятие об обмене веществ, его составных частях;

- связь обмена веществ с обменом энергии;

- строение клетки, роль митохондрий;

- химическая природа ферментов;

- коферментная функция витаминов.

Содержание занятия.

I.2. Основные этапы обмена веществ.

Соотношение понятий метаболизм, анаболизм, катаболизм.

Общие понятия о метаболических путях и энергетическом

обмене.

Биологическое окисление и тканевое дыхание.

Дегидрирование субстратов как источник энергии для синтеза АТФ.

Состав цепи переноса электронов и протонов при окислении субстратов.

Роль витаминов в тканевом дыхании.

Структура и функция коферментов дегидрогеназ.
Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРО-

ЭРГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЫШЦ (АТФ И КРЕАТИНФОСФАТА)

АТФ и креатинфосфат являются основными макроэргами мышечной ткани. АТФ синтезируется главным образом в процессе окислительного фосфорилирования, а креатинфосфат – при участии АТФ в состоянии мышечного покоя. При активной работе мышц креатинфосфат дает энергию для синтеза АТФ из АДФ.

Принцип метода.

Фосфатные остатки АТФ и креатинфосфата легко отщепляются при кислотном гидролизе (т.н. лабильно связанный фосфор). Сравнивают содержание неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.
Порядок выполнения работы.
В пробирку внести 0,5 г мышечной кашицы, поместить на ледяную баню и добавить 5 мл охлажденного раствора ТХУ. Содержимое пробирки помешивать стеклянной палочкой в течение 5 мин. Экстракт профильтровать в мерную пробирку, стоящую на ледяной бане. Остаток кашицы залить дистиллированной водой (5 мл), через 5 мин. профильтровать в ту же мерную пробирку и довести объем фильтрата до 10 мл, добавив дистиллят.

Реагенты	Пробирки
	Опытная		Контрольная
Безбелковый фильтрат	0,5		0,5
1М раствор HCl	1.0		1,0
	Закрыть фольгой и кипятить 10 мин. на бане, охладить
1M раствор NaOH	1.0		1.0
Дистиллированная вода	7,5		7,5
Перенести из обеих пробирок в другие пробирки по 5 мл и добавить
Раствор молибдата аммония	0,5	0,5
Аскорбиновая кислота	0,5	0,5
Дистиллированная вода	2,0	2,0
Перемешать, оставить при комнатной температуре на 10 мин., колориметрировать на ФЭКе против воды, длина волны 670 нм.

Расчет. Определить разницу между оптической плотностью опытной пробы и контрольной. По калибровочному графику найти концентрацию лабильно связанного неорганического фосфора (А) в пробе.

Х = А ∙ ( 3,3 ∙ 400 ) ∙ 100, где

Х – содержание макроэргов в мг/100г (мг%),

А – содержание АТФ в пробе.

3,3 ∙ 400 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов

РЕЗУЛЬТАТ:


III.2.Контрольные вопросы.

Что такое макроэрги? Приведите примеры.

Какие пути образования АТФ вы знаете?

Где и когда образуется креатинфосфат?

Какова биологическая роль креатинфосфата?
Материал для самоподготовки: I а)I. с.305–311; II; III.

Занятие № 10.
ТЕМА. ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ.

РЕГУЛЯЦИЯ ЦЕПИ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ

(ДЫХАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ).
Цель занятия: Получить представления о сопряжении биологического окисления с катаболическими и анаболическими процессами в клетке, этапах синтеза макроэргов в дыхательной цепи, значении и механизме регуляции окислительного фосфофорилирования.

Исходный уровень знаний:

- анаболизм и катаболизм как две стороны единого процесса

обмена веществ;

- состав дыхательной цепи электронов;

- структура и функция дегидрогеназ.

Содержание занятия.

I.2. Строение митохондрий.

Этапы синтеза АТФ в цепи дыхательных ферментов при окислительном фосфорилировании. Коэффициент Р/О.

Субстратное фосфорилирование, его энергетическая ценность.

Разобщение дыхания и фосфорилирования.

Регуляция тканевого дыхания.

Цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) - "фокус", в котором сходятся все метаболические пути.
II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТ-

ДЕГИДРОГЕНАЗЫ МЫШЦ И КОНКУРЕНТНОЕ

ТОРМОЖЕНИЕ ЕЁ АКТИВНОСТИ
Принцип метода и химизм реакции.

Сукцинатдегидрогеназа катализирует окисление (дегидрирование) янтарной кислоты в фумаровую. Коферментом служит флавинадениндинуклеотид (ФАД). В качестве акцептора водорода используется окисленная форма 2,6-дихлорфенол-индофенола (его натриевой соли), водный раствор которого окрашен в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения бесцветна. Источником фермента служит мышечная кашица. Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназы вызывает малоновая кислота (НООС-СН₂-СООН), являющаяся структурным аналогом янтарной кислоты.

Cl

|

HOOC-CH₂-CH₂-COOH + O= =N– –ONa

сукцинат | сукцинат-

Cl дегидрогеназа

Cl

|

HOOC-CH=CH-COOH + HO– –NH– –ONa

фумарат |

  Cl

Порядок выполнения работы.

Свежую мышечную ткань (около 1 г) измельчить ножницами и растереть в ступке с небольшим количеством воды (2-3 мл) в течение 1 минуты. Затем мышечную кашицу перенести на двойной слой марли, помещенной на воронку, промыть водой, переложить на фильтровальную бумагу и осушить.

Реагенты	Пробирки
	1 опытная	2 опытная	3 контроль
Фосфатный буфер (рН 7,4)	3 мл	3 мл	3 мл
Мышечная кашица	0,1 г	0,1 г	0,1 г
3% раствор янтарной кислоты	5 кап.	5 кап.	-
0,1 N раствор NаОН	5 кап.	5 кап.	-
дистиллированная Н2О	-	-	10 кап.
3% раствор малоновой кислоты	-	5 кап.	-
0,001 N раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола	1 мл	1 мл	1 мл
Поместить в термостат при 370С на 40 минут
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

III.2.Контрольные вопросы.

Какую реакцию катализирует сукцинатдегидрогеназа?

Что является коферментом сукцинатдегидрогеназы?

Что является структурным аналогом янтарной кислоты, вызывающим конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназы?
Материал для самоподготовки: I а)1. с.311-313, 345-353; II; III.
Занятие № 11.
ТЕМА. МИКРОСОМАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ.

КОМПОНЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ. ОПРЕ-

ДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ.
Цель занятия: 1.Получить представления об особенностях микросомального окисления, компонентах монооксигеназной цепи, биологическом значении гидроксилирования субстратов, антиоксидантах.

2.Овладеть методикой определения фермента каталазы.

Исходный уровень знаний:

- анаболизм и катаболизм как две стороны единого процесса

обмена веществ;

- представления о окислительном фосфорилировании;

- строение клетки, микросомы;

- оксидоредуктазы.

Содержание занятия.

I.2. Состав микросомной фракции, выделяемой из клеток.

Особенности строения монооксигеназ (гидроксилаз).

Роль микросомального окисления в метаболизме регуляторных молекул, ксенобиотиков.

Антиоксидантная роль витаминов С и Е.

Понятие о пероксисомальном окислении.

Роль пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы.
II.1.Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА КАТАЛАЗУ

Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в разложении вредной для организма перекиси водорода на молекулярный кислород и воду.
2H₂O₂ 2H₂O + O₂

каталаза
Принцип метода.

Фермент каталаза содержит гем. В процессе разрушения перекиси водорода происходит окисление и восстановление железа, входящего в состав фермента.

Порядок выполнения работы:

Реактивы	Контрольная пробирка	Опытная пробирка
Н2О (мл)	1	1
Кровь (кап)	2	2
Кипятить 2-3 мин, затем охладить
3% раствор Н2О2 (кап)	5-10	5-10
Встряхнуть
РЕЗУЛЬТАТЫ:

Работа № 2.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

КАТАЛАЗЫ (ПО БАХУ И ЗУБКОВОЙ).

Принцип метода. В основе количественного определения каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени, по следующему уравнению:
2KMnO₄+5H₂O₂+4H₂SO₄ 2MnSO₄+8H₂O+5O₂+2KHSO₄
Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом (КЧ) называют количество миллиграммов Н₂О₂, которое разлагается в 1 мкл крови. О количестве расщепленной Н₂О₂ судят по разности объема раствора KMnO₄, израсходованного до и после действия каталазы.
Порядок выполнения работы:

Приготовление раствора крови. В мерную колбу вместимостью 100 мл налить около 10 мл дистиллированной Н₂О, затем внести микропипеткой 0,1 мл крови. Микропипетку промыть три раза водой из колбы. Долить водой до метки, чтобы кровь была разведена в 1000 раз (1 мл раствора содержит 1 мкл крови)

Реактивы (мл)	Опытная колба	Контрольная колба
Н2О	7	7
Кровь, разведенная 1:1000	1	1
1% раствор Н2О2	2	-
10% раствор Н2SO4	-	5
Примечание. Действие каталазы прекращается в кислой среде, т.к. она действует при рН 7,4 Инкубация 30 минут при комнатной температуре
10% раствор H2SO4	5	-
1% раствор Н2О2	-	2

Титрование 0,1 N раствором KMnO₄ до розовой окраски.
КЧ = (А - В) ∙ 1,7
где: А - количество мл 0,1 N р-ра KMnO₄, пошедшее на титрование контрольной пробы;

В - количество мл 0,1 N р-ра KMnO₄, пошедшее на титрование опытной пробы.

Полученную разность умножают на 1,7 (1 мл 0,1 N раствора KMnO₄ эквивалентен 1 мл 0,1 N Н₂О₂, в котором содержится 1,7 ммоль/л (1,7 мг) Н₂О₂, т.к. 1 моль/л Н₂О₂ равен 1,7 г.)

Клинико-диагностическое значение.

В норме каталазное число составляет 10-15 ед. При раке, анемии, туберкулезе содержание каталазы в крови снижается.

РЕЗУЛЬТАТЫ:	А =	В =
КЧ =

ВЫВОД:


III.2. Контрольные вопросы.

К какому классу ферментов относятся каталаза и пероксидаза?

В каких клетках наибольшее количество каталазы?

Какой субстрат является специфическим для каталазы?

Что такое каталазное число?

Чему в норме равно каталазное число?

Укажите диагностическое значение количественного определения каталазы крови.
Материал для самоподготовки: I а)1. с.313–318, 559

595-596; II; III.
Занятие № 12
 КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ: "ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН. МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ЦЕПЬ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ. ОБЩИЙ ПУТЬ КАТАБОЛИЗМА"
Вопросы к коллоквиуму
1. Источники и пути использования энергии для различных организмов. Соотношение между понятиями энергетический обмен, биологическое окисление, тканевое дыхание.

2. Обмен веществ и энергии как основа жизни. Общие понятия о метаболических путях и энергетическом обмене.

3. Эндергонические и экзергонические реакции в живой клетке.

4. Макроэргические соединения - универсальные аккумуляторы энергии при метаболизме. Цикл АДФ↔АТФ. Основные пути фосфорилирования АДФ и использования АТФ.

5. Современное представление о биологическом окислении. Значение работ А.Н.Баха и В.И.Палладина.

6. Строение митохондрий и структурная организация цепи переноса электронов и протонов.

7. Дегидрирование субстратов и окисление водорода как источник энергии для синтеза АТФ. Характеристика дегидрогеназ.

8. Место в цепи дыхательных ферментов и значение пиридинзависимых дегидрогеназ, структура коферментов (окисленных и восстановленных форм). Важнейшие субстраты НАД-зависимых дегидрогеназ.

9. Место в цепи дыхательных ферментов и значение флавинзависимых дегидрогеназ, структура коферментов (окисленных и восстановленных форм). Важнейшие субстраты ФАД-зависимых дегидрогеназ.

10. Место в цепи дыхательных ферментов и значение убихинона (KoQ), химическая природа и роль в окислительных процессах.

11. Цитохромы, цитохромоксидаза, химическая природа и роль в окислительных процессах.

12. Свободное окисление, окислительное и субстратное фосфорилирование.

13. Этапы продукции макроэргов в цепи дыхательных ферментов. Коэффициент Р/О.

14. Регуляция переноса электронов (дыхательный контроль). Роль некоторых биологически активных и лекарственных веществ.

15. Разобщение дыхания и фосфорилирования, терморегуляторная функция тканевого дыхания.

16. Строение митохондрий. Избирательная проницаемость митохондриальной мембраны для субстратов, АДФ и АТФ.

17. Нарушения энергетического обмена и гипоксические состояния.

18. Витамины РР и В₂, убихинон. Роль в биологическом окислении.

19. Особенности микросомального и пероксисомального окисления. Роль токоферола и аскорбиновой кислоты в защите от токсического действия кислорода.

20. Цикл трикарбоновых кислот (последовательность реакций). Биологическое значение ЦТК.

21. Аллостерический механизм регуляции цикла лимонной кислоты (ЦТК).

22. Связь между общими путями катаболизма и цепью переноса электронов и протонов (на примере ЦТК).

РАЗДЕЛ V. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ.
Занятие № 13
ТЕМА. СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.

Цель занятия: 1.Повторить строение мононуклеотидов.

2.Усвоить структурные особенности ДНК и РНК, виды

химических связей в данных молекулах.

Исходный уровень знаний:

- нуклеиновые основания: виды, строение;

- структура мононуклеотидов;

- биологическая роль нуклеиновых кислот.

Содержание занятия.

I.2. Строение ДНК и механизм самовоспроизведения генов.

Виды РНК, их количественное соотношение и локализация.

Рибосомы и р-РНК.

Транспортные РНК: уникальность структуры, специфичность действия.
II.1.Работа № 1. ГИДРОЛИЗ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ ДРОЖЖЕЙ

Для изучения химического состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей, т.к. они богаты нуклеопротеидами. Специфическими реакциями для каждого вещества открывают продукты гидролиза - полипептиды, пуриновые основания, углевод и фосфорную кислоту.

а) Биуретовая реакция на полипептиды.

Химизм и порядок выполнения см. работу № 1 (стр.9-11)

РЕЗУЛЬТАТ:
б) Серебряная проба на пуриновые основания.

Химизм реакции:

NH₂

⌡ N

N

+ AgNO₃+NH₄OH

N NH

NH₂

⌡ N

N

+ NH₄NO₃ + H₂O

N N-Ag
Порядок выполнения работы.

К 10 каплям гидролизата добавить по каплям крепкий раствор аммиака (приблизительно 10 капель) до щелочной реакции, определяемой по лакмусу, опущенному в пробирку, затем добавить 10 капель 2% аммиачного раствора нитрата серебра. Не перемешивая, оставить пробирку на 3-5 минут.

РЕЗУЛЬТАТ:

в) Качественная реакция на пентозу (реакция Молиша).

Принцип метода и химизм реакции.

При взаимодействии концентрированной серной кислоты с пентозами происходит их дегидратация и образуется фурфурол, дающий с тимолом продукты конденсации красного цвета.

3Н₂О CH₃

H₂COH-(CHOH)₃-COH +

Конц. COH ―ОН

H₂SO₄ O │

H₃C-CH-CH₃

рибоза фурфурол тимол
продукты конденсации красного цвета
Порядок выполнения работы:

К 10 каплям гидролизата дрожжей добавить 3 капли 1% спиртового р-ра тимола, перемешать и по стенке пробирки осторожно прибавить 20-30 капель концентрированной серной кислоты и встряхнуть.

РЕЗУЛЬТАТ:
г) Молибденовая проба на фосфорную кислоту.

Химизм реакции.

H₃PO₄+12(NH₄)MoO₄+21HNO₃

(NH₄)₃P ∙ 12MoO₃ + 21NH₄NO₃ + 12H₂O

фосфомолибденовокислый

аммоний (желтый осадок)
Порядок выполнения работы.

К 10 каплям гидролизата прилить 20 капель молибденового реактива и кипятить несколько минут. При этом жидкость (не осадок) окрашивается в лимонно-желтый цвет. Пробирку охладить в струе холодной воды.

РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОДЫ:

III.2. Контрольные вопросы.

Что такое нуклеопротеиды?

В каких тканях содержится много нуклеопротеидов?

Укажите продукты гидролиза нуклеопротеидов.

Какие белки входят в состав нуклеопротеидов? Укажите их особенности.

Какие качественные реакции на продукты гидролиза нуклеопротеидов Вы знаете?
Материал для самоподготовки: I а)1. с. 86-88, 96-113; II; III.

Занятие № 14
ТЕМА. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Цель занятия: Ознакомиться с этапами синтеза нуклеиновых

кислот в живых организмах.

Исходный уровень знаний:

- строение и функции нуклеиновых кислот;

- репликация, связь с клеточным циклом;

- понятие о транскрипции.

Содержание занятия.

I.2. Синтез ДНК: этапы, механизм, значение.

Повреждения и репарация ДНК.

Механизм транскрипции.

Понятие о мозаичной структуре генов, первичном транскриптоне.

Посттранскрипционная достройка РНК.

I.3. Контрольная работа.
СВОДНЫЕ ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ

ПО РАЗДЕЛУ «СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ»

1. Строение (в виде лактам-лактимных таутомеров) пиримидиновых и пуриновых нуклеиновых оснований. Комплементарность оснований. Минорные азотистые основания.

2. Строение N-гликозидов (нуклеозидов) Д-рибозы и 2-дезокси-Д-рибозы с нуклеиновыми основаниями и реакции их гидролиза. Псевдонуклеозиды.

3. Строение нуклеотидов, входящих в ДНК (дезоксиадениловой, дезоксигуаниловой, дезоксицитидиловой, тимидиловой кислот) и в РНК (адениловой, уридиловой, гуаниловой, цитидиловой кислот). Схемы неполного и полного гидролиза этих мононуклеотидов.

4. Строение дифосфо- и трифосфонуклеотидов, схемы их неполного и полного гидролиза.

5. Схемы неполного и полного гидролиза нуклеиновых кислот.

6. Первичная структура нуклеиновых кислот. Строение участков ДНК (строение триплетов, например, ТГА, АЦГ, ЦТА и т.п.).

7. Вторичная и третичная структура нуклеиновых кислот. Различие состава и структуры ДНК и РНК.

8. Комплементарные полинуклеотидные цепи. Модель двойной спирали.

9. Функции ДНК и РНК. Типы РНК.

10. Строение участков РНК с последовательностью оснований: УГА, АУГ, ЦУГ и т.п.

11. Строение фрагментов мРНК, полученных при транскрипции с ТЦА, ГТА, АЦТ и т. п.

12. Особенности структуры и специфичность транспортной РНК.

13. Строение антикодонов тРНК, соответствующих кодонам АУГ, ЦУА, УАГ и т. п.
II.1. Работа № 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБО-

НУКЛЕОТИДОВ ИЗ СЕЛЕЗЁНКИ
Дезоксирибонуклеопротеиды выделяют из богатых клеточными ядрами тканей: зобной железы, селезёнки и др. В работе используется готовый раствор дезоксирибонуклеопротеидов, в котором определяют наличие белка (биуретовая реакция) и ДНК.

а) Биуретовая реакция проводится так же, как описано в работе №1 (занятие № 1).

РЕЗУЛЬТАТ:

б) Реакция на ДНК.

Химизм реакции.

При нагревании ДНК гидролизуется и освободившаяся дезоксирибоза в реакции с дифениламином даёт синее окрашивание.

Порядок выполнения работы.

К 15-20 кап. раствора добавить равный объём дифениламина. Смесь нагреть в кипящей водяной бане в течение 15 минут.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Материал для самоподготовки. I а)1. с. 86-88, 96-113,

478-498; II; III.

Занятие № 15

СЕМИНАР ПО ТЕМЕ: "БИОСИНТЕЗ БЕЛКА. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА У ПРО- И ЭУКАРИОТОВ"
Цель занятия: 1.Закрепить знания этапов репликации и транскрипции, роли ДНК- и РНК-полимераз.

2.Усвоить механизм трансляции и регуляции биосинтеза белка.

Исходный уровень знаний:

- виды нуклеиновых кислот;

- строение и функция ДНК;

- строение и функции различных типов РНК;

- биосинтез нуклеиновых кислот.

Содержание занятия.

I.2. Обсуждение устных сообщений студентов.