Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
Конъюгация — перенос генетического материала из клетки- донора в клетку реципиента при их скрещивании. Процесс конъюгации у бактерий был впервые обнаружен Д. Ледер- бергом и Э. Тейтумом в 1946 г. Позднее было показано, что донорами генетического материала являлись клетки, несущие F-плазмиду (половой фактор) (см. 6.6). Бактериальные клетки, не имеющие F-плазмиды, неспособны быть генетическими донорами. Они являются реципиентами генетического материала и обозначаются как F -клетки. При скрещивании F+- с F 'клеткой половой фактор передается независимо от хромосомы донора с высокой частотой, близкой к 100%. При этом почти все реципиентные клетки получают половой фактор и становятся Р+-клетками. Г" четы u m Рис. 6.6. Схематическое изображение включения F-плазмиды в бактериальную хромосому при коньюгации Важнейшим свойством F-плазмиды является способность включаться (интегрировать) в определенные участки бактериальной хромосомы и становиться ее частью, также как это имело место в слу- ч і і с умеренного фага Я (рис. 6.6). В некоторых случаях F-плазмида, аналогично профагу X, освобождается из хромосомы, захватывая при ном сцепленные с ней бактериальные гены. Такие F-плазмиды обо- шачают с указанием названия включенного в ее состав гена. Например Flac, которая при передаче реципиенту наделяет его способнос- I їло ферментировать лактозу. Первым этапом конъюгации является прикрепление клетки-доно ра к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок (sex pili). (лтем между обеими клетками образуется конъюгационный мостик рис. 6.7, 6.8), через который из клетки-донора в клетку-реципиент могут передаваться фактор и другие плазмиды, находящиеся в ци- тплазме бактерии-донора в автономном состоянии. Для переноса бактериальной хромосомы необходим разрыв одной из цепей ДНК, который происходит вместе включения F-плаз миды при участии эндонуклеазы. Проксимальный конец ДНК через конъюгационный мостик проникает в клетку-реципиент и сразу же достраивается до двунитевой структуры. Оставшаяся в клетке донора нить ДНК является матрицей для синтеза второй нити. Следовательно, при конъюгации передается только одна нить ДНК-донора, авто рим, оставшаяся комплементарная, цепь достраивается в реципиент ной клетке (рис. Рис. 6.7. Конъюгация бактерий. ЭМ. Ув. 60 ООО Рис. 6.8. Перенос бактериальной хромосоиы при конъюгации из клетки донора (Hfr) в клетку реципиента. Стрелками указано направление переноса. Пунктирной линией обозначен синтез дочерней нити ДНК на матрице материнской нити Таким образом, интеграция F-плазмиды в состав бактериальной хромосомы приводит к разрыву одной из нитей ДНК, что обеспечивает возможность ее переноса в реципиентную клетку. Такие штаммы бактерий-доноров получили название штаммы (англ. high frequency o f recombination — высокая частота рекомбинации. При скрещивании штамма с бактериями фактор, как правило, не передается, поскольку он расположен в дистальной части хромосомы. С высокой частотой передаются только гены бактериальной хромосомы, расположенные вблизи начала переноса О-точки (англ. origin — начало, вследствие разрыва конъюгационного мостика. При этом F-плазмида определяет не только О-точку, характерную для каждого штамма, но и направление передачи хромосомы от донорной клетки к реципиентной. 6.9. ОСНОВЫ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ГЕНЕТИКИ В организме человека бактерии находятся в виде популяций, локализующихся в определенных биотопах (полость рта, просвет кишки и т.д.). Стабильность и выживаемость бактериальной популяции определяются ее генофондом, те. совокупностью генотипов всех составляющих ее микробных клеток. В процессе жизнедеятельности микробной популяции в ней появляются отдельные особи с измененными признаками, которые явля- іотся гетерогенными по отношению к подавляющему оольшинству клеток. Выживание и размножение гетерогенных кле- кж под воздействием направленного отбора определяются соответствием признаков отдельных клеток новым условиям их существования. Чем выше гетерогенность популяции, тем больше шансов на ее ммживание. По мере накопления гетерогенных особей, имеющих селективные преимущества перед исходными клетками, изменяется генофонд по пуляции. Изменчивость генофонда микробной популяции может быть подразделена на два типа фенотипическую — модификационную и генотипическую — мутационно-рекомбинационную. Первый, модификационный, тип осуществляется с помощью постоянно действующих механизмов репрессии и индукции структурных генов, не сопровождающихся их перестройкой. Этом конечном счете способствует выживанию тех клеток, которые лучше, чем исходные, адаптируются к изменяющимся условиям среды или, говоря другими словами, настраиваются на оптимальный режим работы. После прекращения действий того или другого фактора микробные клетки утрачивают приобретенные признаки и возвращаются к первоначальному фенотипу. Их генотип при этом не подвергается изменениям. К данному типу изменчивости можно отнести альтернативную •кспрессию генов, контролирующих образование белков, участвующих в адгезии (адсорбции) гонококков на слизистой оболочке утер- п. Эти белки, выполняющие идентичную функцию, отличатся друг di друга по антигенным свойствам. Смена белков происходит входе инфекции путем включения молчащего гена и выключения ранее функционирующего. При этом каждая бактериальная клетка может интезировать только один тип антигенного белка. Функционирование одного или двух генов или групп генов может определяться инверсией промотора, который в зависимости от своего положения включает те или другие гены. Включение тех или иных механизмов обеспечивает микробной популяции селективные преиму щества. Сигнал, обеспечивающий правильный выбор гена, по-видимому, исходит от антител, образующихся к соответствующим микробным пнтигенам. Этот сигнал опасности воспринимается рецепторами микробной клетки и передается регуляторным генам, которые включают соответствующие структурные гены, контролирующие образо- ішние иных антигенов. В противном случае упомянутые микроорганизмы под воздействием антител будут элиминированы не только из популяции, но и из организма своего хозяина. Таким образом, в данном случае антитела являются индуцирующими и селективными фак торами. М у та ц ионно- рекомбинационный механизм связан с образованием в микробной популяции измененных генотипов, постоянно возникающих в результате мутаций, рекомбинаций, внесения внешней информации с транспозируемыми элементами. Увеличение гетерогенности микробных популяций в организме человека происходит за счет воздействия мутагенных факторов, образующихся в результате метаболических реакций (пероксида водорода, нитрозамины и др, некоторых химиотерапевтических средств производные нитрофурана и др, а также молекул ДНК и РНК, освобождающихся после гибели микроорганизмов и клеток разнообразных тканей и органов. Вместе стем транспозоны и последовательности при перемещении на бактериальной хромосоме встраиваются в любые ее участки, вызывая инсертационные мутации. Гетерогенность микробных популяций увеличивается также в результате перестройки структурных генов, в том числе и тех, которые контролируют образование антигенов см. 13.3). Так, например, при локализации отдельных фрагментов одного итого же гена враз ных частях бактериальной хромосомы или в хромосомной и плаз- мидной ДНК они будут функционировать только при сборке веди ный ген. Число вариантов этого функционирующего гена для каждой микробной клетки весьма велико, что дает возможность синтезировать широкий ассортимент разновидностей одного итого же продукта. В данном случае селективными преимуществами буцут обладать микроорганизмы, имеющие гетерологичные антигены к циркулирующим в крови антителам. Подобные генетические механизмы лежат в основе антигенной изменчивости гонококков, боррелий возвратного тифа, трипаносом, малярийного плазмодия и других микроорганизмов входе инфекционного заболевания. Некоторые F-, R-плазмиды, трансдуцирующие бактериофаги, вносят с собой фрагменты чужеродной ДНК, которые могут рекомбинировать с ДНК реципиентных клеток в том случае, если они имеют гомологичные нуклеотидные последовательности. В результате описанных событий изменяются генотипы бактериальных клеток, что фенотипически проявляется в появлении новых признаков, которые оцениваются естественным отбором. В организме человека в качестве селективных факторов выступают химиотерапевтические средства, специфические антитела и др. Вместе стем эти же факторы могут служить индукторами соответствующих сигналов, которые воспринимаются рецепторами микробных клеток и передаются регуляторным генам, что приводит к появлению новых генотипов и фенотипов Молекулярно-генетические механизмы гетерогенности микробных популяций чрезвычайно многообразны, поскольку в самой природе ДНК заложены два механизма сохранение стабильности генома и обеспечение его изменчивости. ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ Модификации. Модификационные ненаследуемые (феноти пические) изменения у вирусов обусловлены особенностями клетки хозяина, в которой происходит их репродукция. У многих вирусов животных и человека модификации проявляются изменением химического состава внешней оболочки (суперкапсида) вириона, связанного с включением в ее состав липидов и углеводов тех клеток хозяина, в которых происходит их репродукция. Мутации. Спонтанные мутации у вирусов возникают вовремя репликации их нуклеиновых кислот. Они затрагивают различные свойства вирусов. Индуцированные мутации возникают под действием тех же химических и физических мутагенов, которые вызывают мутации у Пактерий. Одни из них (азотистая кислота, гидроксиламин, нитрозо- іуанидин) действуют на внеклеточный вирус, другие (акридин, ана- иоги азотистых оснований на внутриклеточный вирус вовремя репликации его нуклеиновой кислоты. Мутанты вирусов фенотипически различаются построению бляшек, которые они образуют на тканевых культурах с агаровым покрытием, по чувствительности к температуре (мутанты, по анти- I с иным свойствам белков капсида. Рекомбинации и другие феномены Свойства вирусов могут изменяться при одновременном заражении двумя вирусами чувствительной к ним клетки хозяина. Эти изменения можно классифицировать кик генетическую рекомбинацию, генетическую реактивацию, комп- псментацию, фенотипическое смешивание. При генетической рекомбинации происходит "Г>мен отдельными генами между двумя или более вирусами в фонде реплицирующейся ДНК, в результате чего образуются рекомбинан- ы, содержащие гены двух или более родителей. Рекомбинации между РНК-вирусами происходят реже. Они встречаются у вируса грип- ІІИ. имеющего фрагментированный геном. Г е нет и ческа яре активация особый случай 1 >гкомбинации, или перераспределения, генов, когда у двух родственник вирусов инактивированы разные гены. При скрещивании таких иирусов могут образовываться полноценные вирусные частицы, те. происходит множественная реактивация вирусных геномов. Данный процесс наблюдается у рео-, поксвирусов и др К негенетическим процессам относятся ком племен та ц и я и фенотип и чес кое смешивание. Комплементация происходит в том случае, когда белки, кодируемые геномом одного вируса, способствуют репродукции другого вируса. При этом один из вирусов доставляет генный продукт, который дефектен у другого вируса. В отличие от рекомбинации комплементация не сопровождается обменом нуклеиновых кислот между молекулами данных вирусов. Комплементация описана у многих вирусов. Так, аденовирусы человека в течение многих лет выделяли и культивировали в почечных клетках обезьян макак резусов. Оказалось, что аденовирусы могли репродуцироваться в этих клетках только благодаря присутствию в них онкогенного вируса Фенотип и чес кое смешивание наблюдается при смешанном заражении клеток в том случае, если часть потомства одного вируса приобретает фенотипические признаки обоих родителей, хотя их генотип остается неизменным. Например, при заражении клеток вирусами полиомиелита и Коксаки в потомстве происходит образование вирионов, содержащих РНК одного партнера, заключенную в капсид другого. Данный феномен получил название «транскапсидация». 6.11. ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ УЧЕНИЯ О ГЕНЕТИКЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Развитие молекулярной генетики явилось мощным стимулом для исследований, посвященных изучению молекулярно-генети ческих основ патогенности и иммуногенности микроорганизмов, механизмов образования новых биологических вариантов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, распространением антибиоти- ко-резистентных штаммов на фоне расширяющегося арсенала химиотерапевтических средств. Последние, являясь мощными селективными факторами, способствуют накоплению предшествующих в популяции резистентных форм бактерий и формированию лекарствен но-устойчивых популяций с измененными патогенными и другими свойствами см. Вместе стем изменения иммунологической реактивности макро организма в результате разнообразных воздействий факторов окружающей среды, а также всевозможных лекарственных препаратов оказывают существенное влияние на фенотипическое выражение патогенных генотипов. Все это отражается на наблюдаемых в настоящее время изменениях в патогенетических и клинических особенно г гях инфекционных заболеваний и распространении внутрибольнич ных инфекций. Достижения генной инженерии позволяют создать новые генетические элементы из нуклеотидных последовательностей, несущие заданную информацию, способы их переноса в клетки про- и эукариотов. Новые генетические элементы представляют собой рекомбинантные молекулы ДНК, которые включают два компонентам с кто р - переносчики клонированную чужеродную ДНК. Вектор должен обладать свойствами репли- кона и обеспечить репликацию вновь созданной рекомбинантной мо- нскулы. Поэтому в качестве вектора используют такие репликоны, как плазмиды, умеренные фаги, вирусы животных, имеющие циркулярную замкнутую структуру ДНК. Клонируемая ДНК — это фрагмент ДИК, несущий необходимый ген, контролирующий синтез нужного продукта. В настоящее время разработаны различные технологические приемы создания рекомбинантных молекул. Наиболее простой принцип сводится к обработке выделенных молекул ДНК вектора и М К, несущей нужный ген, ферментами рестриктазами (эндонуклеа- и рестрикции), атакующими взятые молекулы ДНК в строго опреде- 'ІСПНОМ участке. Некоторые рестриктазы расщепляют молекулы ДНК Э образованием однонитевых комплементарных друг другу концов к называемых липких концов. Таким образом, первым этапом «нияется разрезание молекул ДНК с помощью эндонуклеаз рест рикции. Второй этап состоит в обработке полученных линейных молекул ферментом полинуклеотидлигазой, которая сшивает двери шые молекулы в одну рекомбинантную, третий — во введении рекомбинантных молекул методом трансформации в клетки Е. coli или іругих микроорганизмов, например дрожжей. Вопросы для самоконтроля. Какие молекулярно-генетические закономерности были установлены при пучении бактерий и вирусов. Какие механизмы лежат в основе модификационной изменчивости герий? 3. Дайте характеристику мутациями репарациями их молекулярным мшизмам, функционирующим у бактерий. Какие формы генетических рекомбинаций присущи бактериям Каков н' механизм. В чем состоит механизм R -диссоциации бактерий. Какие внехромосомные факторы наследственности присущи бактериям. Какие механизмы лежат в основе популяционной генетики бактерий? К. Каковы генетические механизмы изменчивости вирусов? Ч. В чем состоят основные принципы генной инженерии. Каково практическое значение учения о генетике микроорганизмов 11. В чем состоят различия между плазмидами, транспозонами и элементами. Дайте характеристику мутациям а) по молекулярным механизмам, б) по происхождению, в) по количеству мутировавших генов, г) по фенотипи ческим проявлениям. Каковы механизмы репарации. Каково эволюционное значение мутаций и репараций. Каковы механизмы генетических рекомбинаций у бактерий. В чем состоят различия между трансформацией, трансдукцией и конъюгацией. Каковы причины и механизмы гетерогенности микробных популяций. В чем состоят различия между генетическими рекомбинациями вирусов, их комплементацией и фенотипическим смешиванием. В чем состоят различия между плазмидами, транспозонами и элементами ГЛ А B A ОСНОВЫ ОБЩЕЙ И МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБНОЙ ЭКОЛОГИИ (МИКРОЭКОЛОГИЯ) 7.1. ВВЕДЕНИЕ В МИКРОЭКОЛОГИЮ Термин экологическая микробиология был впервые введен в 1945 г. С.Н. Виноградским (1856-1953) для объединения разрозненных разделов общей и прикладной микробиологии, занятых изучением взаимосвязей макроорганизмов и микроорганизмов. Однако экология микробов (микроэкология) как научное направление начала формироваться значительно раньше — еще в конце прошлого века. Ее фундаментом стали труды С.Н. Виноградского, который открыл специализированные формы почвенных бактерий и доказал их причастность к определенным процессам трансформации веществ в почве. На примере сообществ почвенных микрорганизмов он первым сформулировал положение о постоянной (аутохтонной) и непостоянной ( шмогенной или аллохтонной) микрофлоре в конкретной экологической нише. Этот принцип оказался универсальным для микробных сообществ водоемов, растительных и животных организмов. Уместно вспомнить, что еще в конце XX в. И.И. Мечников создал первую гипотезу трофической роли микрофлоры кишечника животных и человека. Им же был научно обоснован и предложен практический метод подавления отрицательной роли гнилостных бактерий при помощи регулярного употребления простокваши с лактобак- гериями. Глобальная роль микроорганизмов в создании основ живой материи впервые была масштабно показана выдающимся русским натуралистом В.И. Вернадским (1863-1945), создавшим учение о биосфере Он впервые сформулировал идею о биосфере как наивысшем уровне экологической интеграции. Экологическая микробиология использует те же термины, что и общая экология, предметом которой является изучение взаимоотношений организмов со средой обитания. При этом следует учитывать как воздействие биотических и абиотических факторов среды на организмы, таки влияние организмов на среду обитания Экологическая микробиология изучает отношения внутри микробных сообщества также взаимоотношения микроорганизмов и мак |