Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
his+ — гистидиновый ген, leu*+ — лейциновый ген и т.д. Гены, контролирующие резистентность к лекарственным препаратам, фагам, ядам, обозначают буквой г (resistent— резистентный. Например, резистентность к стрептомицину записывается знакома чувствительность str1. Фенотип бактерий обозначают теми же знаками, что и генотип, нос прописной буквы. Генотип микроорганизмов представлен совокупностью генов, определяющих его потенциальную способность к фенотипическому выражению записанной в них информации в виде определенных признаков. Условия окружающей среды способствуют проявлению (экспрессии) генов или, наоборот, подавляют их функциональную активность, выраженную в образовании определенных ферментов. У бактерий, имеющих определенный набор генов, функцию каждого из них определяют непрямым, а косвенным путем на основании изменения или утраты соответствующего признака при утрате какого-либо участка ДНК. Таким образом, заключение о функции гена делают на основании результатов сравнительного изучения признака присущего исходному генотипу и штамму с мутировавшим геном. В генетических исследованиях мутировавшие гены служат маркерами Рис. 6.1. Генетическая карта хромосомы Стрелками указано направление переноса хромосомы разных штаммов которые дают возможность судить об их передаче и функционировании. Сцепленность таких маркеров с другими генами устанавливается путем их передачи от донорных к реципиентным клеткам в опытах трансформации трансдукции и конъюгации. Это позволяет установить их локализацию на бактериальной хромосоме и составить генетическую карту (рис. 6.1). 6.2. ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ Внехромосомные факторы наследственности входят в состав многих микроорганизмов, особенно бактерий. Они представлены плаз мидами, транспозонами и последовательностями (англ. insertion — вставка, sequence — последовательность, которые являются молекулами ДНК, отличающимися друг от друга молекулярной массой, объемом закодированной в них информации, способностью к автономной репликации и другими признаками. Плазмиды, транспозоны и последовательности не являются генетическими элементами, жизненно необходимыми для бактериальной клетки, поскольку они не несут информации о синтезе ферментов, участвующих в пластическом или энергетическом метаболизме. Вместе стем они могут придавать бактериям определенные селективные преимущества, например резистентность к антибиотикам. Плазмиды физически либо не связаны с хромосомой (автономное состояние, либо встроены в ее состав (интегрированное состояние. И автономном состоянии они самостоятельно реплицируются. Транс- позоны и последовательности во всех случаях связаны с хромосомой и неспособны к самостоятельной репликации. Плазмиды Плазмиды несут две функции — регуляторную и кодирующую. Первая состоит в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, при интегрировании плаз миды в состав поврежденного бактериального генома, неспособного к репликации его функция восстанавливается за счет плазмидного реп- ликона. Кодирующая функция плазмид состоит во внесении в бактериальную клетку новой информации, о которой судят по приобретенному признаку, например образованию пилей (F-плазмида), резистентности к антибиотикам (R-плазмида), выделению бактериоцинов (Со- нлазмида) и т.д. Переход плазмиды в автономное состояние и реализация записанной в ней информации часто связаны с индуцирующими воздействиями внешней среды. В некоторых случаях продукты плазмидных генов могут способствовать выживанию несущих их бактерий. Самостоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохранению и распространению в потомстве. Встраивание плазмид, также как и профагов, происходит только в гомологичные участки бактериальной хромосомы, в то время как последовательностей и транс- позонов — в любой ее участок. В настоящее время описано свыше двух десятков плазмид, из которых будут рассмотрены следующие. F-плазмида, или половой фактор, представляет собой циркулярно замкнутую нить ДНК с молекулярной массой 60 ■ 106. Она контро- пирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. Данная плазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов. Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra- опероном F-плазмиды (от англ. transfer — перенос, обеспечивающим ее конъюгативность. F-плазмиду можно удалить (элиминировать) из клетки, обработав последнюю некоторыми веществами, например акридиновым оранжевым, в результате чего клетки теряют свойства донора. Сравнительно легкая элиминация и очень быстрая и эффективная передача п лазм и ды реципиентным клеткам дали основание считать, что она располагается в цитоплазме бактерий вне хромосомы. Однако F-плазм ида может встраиваться в бактериальную хромосому и находиться сне й в интегрированном состоянии. R-плазм иды . Известно большое количество R-плазмид, определяющих устойчивость бактерий-хозяев к разнообразным лекарственным препаратам. Передача R-плазмид от одних бактерий к другим привела к их широкому распространению среди патогенных и услов но-патогенных бактерий, что чрезвычайно осложнило химиотерапию вызываемых ими заболеваний. R-плазмиды имеют сложное молекулярное строение. В их состав входят г-ген, который может содержать более мелкие мигрирующие элементы — последовательности, транспозоны и /га-опероны. R-ген, ответственный за устойчивость бактерий к какому-либо антибиотику, контролирует синтез фермента, вызывающего его инактивацию или модификацию см. 8.3). Значительное число г-генов является транспозонами, которые могут перемещаться от плазмиды- носителя в другие репликоны . Водном гене может содержаться несколько транспозонов, контролирующих устойчивость к разным антибиотикам. Этим объясняется множественная лекарственная резистентность бактерий. 7га-оперон, обеспечивающий конъюгативность плазмиды, входит в состав R-плазмид грамотрицательных бактерий. Грамположительные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды, которые могут передаваться от одной бактерии к другой путем транс- дукции. П лазм иды патогенности. Данные плазмиды контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование. Они будут описаны в части Учение об инфекции см. Бак тер и о ц и ноге н н ы е плазмиды контролируют синтез особого рода антибактериальных веществ — бак тер и о ц и нов, способных вызывать гибель бактерий того же вида или близких видов. Бак териоцины обнаружены у кишечных бактерий (колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины) и др. Наиболее изучены колицины, продуцируе мые кишечными палочками, шигеллами и некоторыми другими энте робактериями. Колицины энтеробактерий (продуцируемые под контролем колици- ногенных плазмид) представляют собой вещества белковой природы. Известно более 25 типов колицинов, различающихся по своим физи ко-химическим и антигенным свойствами по способности адсорбиро- наться на определенных участках поверхности бактериальных клеток. Они обозначаются латинскими буквами А, ВСЕ, К и т.д. При обычных условиях культивирования и большинстве клеток бактериальной популяции, содержащей колициногенные особи, синтеза колицина не происходит. Примерно водной из 1000 клеток отмечается так называемая спонтанная продукция колицина. Однако количество колицинпродуцирующих клеток может быть резко увеличено при обработке бактерий УФ-лучами и некоторыми другими агентами. При этом погибают только сами клетки, продуцирующие колицины. В тоже нремя бактериальные клетки, несущие Col-плазмиды, резистентны к действию гомологического колицина также, как и лизогенные бактерии к действию гомологического фага. Таким образом, характерной чертой Col-плазмид является потенциальная летальность для клеток- иродуцентов, которая сближает их с профагами см. Механизм бактерицидного действия колицинов неодинаков. Показано, что после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов (ЕЗ) нарушает функцию рибосом, другой Е) является ферментом эндодезоксирибонуклеазой. Имеются колицины, действующие на цитоплазматическую мембоану бактерий. Колициногенные (Col) плазмиды находятся в клетках энтеробак- герий в автономном состоянии и передаются пои конъюгации без сцепления с хромосомой. Однако некоторые из них (ColV, ColB) могут нстраиваться в бактериальную хромосому и находиться в ней вин тегрированном состоянии. Они, также как и F-плазмиды, передаются путем конъюгации в реципиентные клетки, благодаря имеющемуся у них /гя-оперону. Широкое распространение бактериоциногении среди микрофлоры организма человека имеет экологическое значение как один из факторов, влияющих на формирование микробных биоценозов. Вместе стем колицины, продуцируемые кишечной палочкой — нормальным обитателем кишечника, могут губительно действовать на патогенные энтеробактерии, попавшие в кишечник, способствуя тем самым нормализации его естественного микробиоценоза. Способность продуцировать различные типы колицинов исполь- іуется для типирования бактерий с целью эпидемиологического анализа вызываемых ими заболеваний. Такое типирование осуществляется путем определения типа Col-плазмиды ( коли ц и ноге ноги пиров ан и е ) или типа колицина, образуемого патогенными бактериями ( коли ц и нот и пиров ан и е ) , выделенными от больных, контактирующих сними лица также из окружающей среды. Плазмиды биодеградации. Данные плазмиды несут информацию об утилизации некоторых органических соединений, которые бактерии используют в качестве источников углевода и энергии. Они мо- іут играть важную роль в экологии патогенных бактерий, обеспечивая им селективные преимущества вовремя пребывания в объектах окружающей среды ив организме человека. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины. Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации ряда сахаров (лактоза, сахароза, рафиноза и др) и образовании протеолитических ферментов. Транспозоны Транспозоны представляют собой нуклеотидные последовательности, включающие от 2000 до 20 500 пар нуклеотидов, которые несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции. При включении в бактериальную ДНК они вызывают в ней дуплика ции, а при перемещении — делеции и инверсии. Транспозоны могут находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, неспособной к репликации. Она реплицируется только в составе бактериальной хромосомы. При этом новые копии транспозонов могут мигрировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции. Таким образом, важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. Кроме того, некоторые транс позоны, также как и плазмиды, выполняют регуляторную и кодирующую функции. В частности, они могут нести информацию для синтеза бактериальных токсинов, а также ферментов разрушающих или модифицирующих антибиотики. Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать их от других фрагментов ДНК. Это позволило обнаружить их не только у бактерий и дрожжей, но ив клетках растений, насекомых, позвоночных животных и человека. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают удивительное сходство с провирусами см. 5.2.2), находящимися в составе их хромосом. Is-последовательности Is-последовательности (англ. insertion — вставка, sequence — последовательность) представляют собой транспозируемые элементы, которые также называются вставки последовательностей оснований. Это фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов и более. В последовательностях содержится информация, необходимая только для их транспозиции, те. перемещения в различные участки ДНК Вследствие такого рода перемещений последовательности могут выполнять ряд функций. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и умеренных фагов как между собой, таки с хромосомой бактериальной клетки и обеспечивать их рекомбинацию. Вызывать инактивацию гена, в которой произошла интеграция последовательности (выключение гена, либо, будучи встроенными в определенном положении в бактериальную хромосому, служить промотором (участками ДНК, регулирующих экспрессию подлежащих структурных генов бактерий-реципиентов), который включает или выключает транскрипцию соответствующих генов, выполняя регуляторную функцию. Индуцировать мутации типа делеций или инверсий при перемещении и дупликации в 5-9 парах нуклеотидов при включении в бактериальную хромосому. В свободном состоянии последовательности не обнаружены, что свидетельствует об их неспособности реплицироваться самостоятельно. Умеренные и дефектные фаги Факторами изменчивости бактерий могут быть умеренные или дефектные фаги см. 5.4), которые напоминают по своим свойствам плазмиды бактерий. Встраиваясь в хромосому, эти фаги вызывают ли- югенизацию бактерий, которые могут приобретать новые признаки. Изменчивость лизогенных бактерий связана либо с приобретением генов, переносимых данными фагами от их предыдущих хозяев (бактерий-доноров), либо с экспрессией молчащих генов бактерий- реципиентов. В последнем случае фаговая ДНК, встраиваясь вблизи поврежденного промотора, заменяет его. При этом синтезируются определенные продукты, например протоксины дифтерийных бактерий, ряда клостридий и др. см. 10.2). 6.3. МОДИФИКАЦИИ Фенотипические изменения какого-либо признака или нескольких признаков микроорганизма называют модификациями отличие от мутаций они, хотя и находятся под контролем генома, не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются. Модификации возникают как адаптивные реакции отдельных микробных клеток или всей популяции в целом в ответ на изменяющиеся условия окружающей среды. Такого рода изменчивость позволяет микробным популяциям быстро адаптироваться к окружающей среде и сохранять на должном уровне свою жизнеспособность см. Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и многих других признаков с последующей их реверсией к первоначальному фенотипу после устранения действия фактора, вызвавшего их образование, поскольку исчезает потребность в сохранении данной модификации. Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов, заключающийся в индукции и репрессии соответствующих структурных генов, контролируемых регуляторными генами. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее ферментации. Стафилококки только в присутствии пенициллина синтезируют фермент, разрушающий данный антибиотик. К модификациям можно отнести включение молчащих генов без их перестройки) некоторых микроорганизмов, в результате чего происходит смена их антигенов см. 13.3) входе инфекционного за болевания. К модификациям можно отнести также запрограммированные изменения генетической информации, в основе которых лежат миграции гена на хромосоме и встраивание его с разной частотой в определенные локусы, в результате чего происходит изменение признаков. Существует и механизм возврата гена к исходной локализации, что приводит к восстановлению этого признака. К модификациям такого рода относятся изменения антигенной структуры гонококка, трепонемы сифилиса, боррелий возвратного тифа, холерного вибриона. Модификации могут возникать под непосредственным действием антибиотиков, например пенициллина. Образующиеся при этом L- формы бактерий, лишенные клеточной стенки, могут сохраняться и даже размножаться внутри клеток хозяина и вновь реверсировать к исходной форме после прекращения действия пенициллина. При выращивании многих бактерий на питательной среде с суббактерио- статическими концентрациями антисептиков также можно получить их модификации, характеризующиеся изменением морфологических или других признаков. МУТАЦИИ Мутации представляют собой изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какого-либо признака (признаков). Мутации можно классифицировать по происхождению, характеру изменений в первичной структуре ДНК, фенотипическим последствиям для мутировавшей бактериальной клетки и другим при- ■накам. По происхождению мутации можно условно подразделить нас по н та н н ы е и индуцированные. Первые составляют естественный, или спонтанный, фон, величина которого колеблется в іависимости от типа мутации и вида микробной популяции. Они появляются в микробных популяциях in vitro ив естественных биотопах организма человека) под влиянием самых разнообразных причини событий, например ошибок в работе репарирующих ферментов см. 6.6), или ДНК-полимеразы вовремя репликации ДНК. Мутации происходят в результате ошибочного включения в синтезируемую дочернюю цепь вместо одного азотистого основания другого, некомплементарного имеющегося в родительской цепи, например иместо аденина, комплементарного тимину, гуанина или цитозина. Причиной изменения естественного фона могут быть инсертаци- онные мутации (англ. insertion — вставка, которые возникают при пстраивании в хромосому микробной клетки последовательностей, і ранспозонов и плазмид. При этом фенотип мутации зависит от места их интеграции если она происходит вблизи промотора, то нарушается функция регуляторного гена, а вблизи структурного гена — і интез закодированного в нем продукта. При наличии у бактерий шнов-мутаторов частота мутаций увеличивается в 100 и более раз. Индуцированными называют мутации, которые получают в эксперименте под влиянием каких-либо мутагенов. По количеству мутировавших генов различают генные их ром ос ом н ы ему та ц и и . Первые затрагивают один ген и чаще всего являются точковыми, вторые распространяются на несколько генов. Т очковые мутации представляют собой замену или нставку пары азотистых оснований в ДНК, которая приводит к изменению одного кодона, вследствие чего вместо одной аминокислоты кодируется другая либо образуется бессмысленный кодон, не кодирующий ни одну из аминокислот. Последние называют нонсенс мутациями Мутации со вставками или выпадениями одной пары азотистых оснований ведут к изменению всех последующих кодонов. Такие мутации называются мутациями со сдвигом сч и тына ни я. Они также затрагивают один ген. У микроорганизма, несущего точковую мутацию водном гене, может возникнуть вторичная мутация в этом же гене, в результате которого произойдет восстановление дикого фенотипа. При этом пер- иичную мутацию, которая привела к.возникновению мутантного фенотипа, называют прямой, а мутацию, обусловившую возврат к дикому фенотипу, — обратной. Это может произойти, если прямое мутационное изменение состоит в простой замене пары оснований в первично мутировавшем гене. Так, если прямая мутация — результат замены пары АТ на ГЦ, то обратная мутация — результат замены пары ГЦ на АТ. При истинной реверсии восстанавливается не только фенотип, но и генотип. Восстановление одного фенотипа может произойти ив результате супрессии, те. подавления мутантного фенотипа, которое выражается в исправлении мутационного изменения. Так, например, если при первой мутации произошла вставка или выпадение пары нуклеотидов водном из участков ДНК одного итого же гена, а в другом мутация противоположного рода (выпадение или вставка, то правильность считывания информации восстанавливается. Такая суп рессия называется внутригенной. При внегенной супрессии вторичные мутации, подавляющие выражение первичного мутационного изменения, локализованы в так называемых генах-супрессорах, кодирующих синтез транспортных РНК (РНК. Мутации в таком виде могут привести к изменению тРНК, в результате чего в синтезируемый полипептид доставляется нужная аминокислота. При этом происходит восстановление фенотипа, ноне генотипа. Х ром ос ом н ы ему та ц и и носят характер крупных перестроек в отдельных фрагментах ДНК. Они возникают в результате выпадения меньшего или большего числа нуклеотидов (делеция, либо поворота участка ДНК на 180° ( инверсия, либо повторения какого-либо фрагмента ДНК ( д у пли ка ц и я ) . Один из механизмов образования хромосомных мутаций связан с перемещением последовательностей и транспозонов из одного участка ДНК в другой или из репликона в репликон (из хромосомы в плазмиду и наоборот). В результате возникает мутация, так как функция гена при включении транспозируемого элемента нарушается. При перемещении они могут вызывать делеции или инверсии генетического материала, а при включении в новый участок ДНК — дупликации в -9 пар нуклеотидов. По фенотипическим последствиям мутации подразделяют на нейтральные, условно-летальные и летальные. Нейтральные мутации фенотипически не проявляются какими-либо изменениями признаков, поскольку они заметно не отражаются на функциональной активности синтезируемого фермента. Мутации, которые приводят к изменению, ноне к утрате функциональной активности фермента, называют условно- летальными. В зависимости от условий окружающей среды микроорганизмы могут сохранять свою жизнеспособность или, наоборот, утрачивать ее. Так, например, мутанты (температурочувствительные) бактерий сохраняют способность к синтезу ферментов функционирующих при С, но утрачивают этот признак при СВ тоже время у бактерий дикого типа соответствующие ферменты активны при обеих температурах. Л е таль н ы ему та ц и и характеризуются полной утратой способности синтезировать жизненно важный для бактериальной клетки фермент или ферменты. Чаще всего эти мутации возникают при обширных делециях, захватывающих группу генов, или при других видах хромосомных мутаций. К ним относятся также мутации в генах, несущих информацию о синтезе ДНК-полимераз. Мутации проявляются в фенотипе в виде утраты или изменения морфологических и биохимических признаков, например жгутиков, пилей, капсулы, клеточной стенки способности ферментировать ка кие-либо углеводы, синтезировать определенные аминокислоты, витамины и другие соединения, возникновении устойчивости к лекарственным или дезинфицирующим веществами т.д. Мутанты, нуждающиеся в определенных аминокислотах, азотистых основаниях, ростовых факторах, называются ау к сотр о ф - н ы ми. Они могут сохранять способность к росту лишь в том случае, если утрата соответствующего фермента (ферментов) компенсируется наличием в среде готового продукта, образуемого при его непосредственном участии. R -S -ДИССОЦИАЦИИ Своеобразной формой изменчивости является R -S -диссоци- пция бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. ( дин тип — колонии (англ. |