Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
Молочнокислое брожение. Бактерии родов Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium способны образовывать из пирувата молочную кислоту. При этом в одних случаях происходит образование только молочной кислоты (гомоферментативное брожение, в других (смешанное брожение) наряду с молочной кислотой образуются побочные продукты спирт, ацетон и др, количество которых может превосходить содержание основного продукта. Муравьинокислое брожение. Этот тип брожения характерен для представителей семейства энтеробактерий. Одним из конечных продуктов данного типа брожения является муравьиная кислота. Наряду с ней образуются молочная, уксусная кислоты и другие продукты. Некоторые виды энтеробактерий (например, кишечная папочка) расщепляют муравьиную кислоту до Ни С 0 2. Признаки кислото- ига зообразования являются довольно стабильными и используются для идентификации бактерий на средах Гисса (пестрый ряд). Бактерии рода Enterobacter образуют из пирувата небольшое количество кислых продуктов и ацетилметилкарбинол (ацетоин). Последний определяют в реакции Фогес — Проскауэра с целью идентификации данных бактерий. Маслянокислое брожение. Одним из основных продуктов брожения является масляная кислота. При этом типе брожения образуются также уксусная кислота, Си Н. Некоторые виды клостридий наряду с масляной и другими кислотами образуют бутанол, ацетон и некоторые другие соединения. В данном случае они вызывают ацето нобутиловое брожение. Пропионовокислое брожение характерно для пропионобактерий, которые из пирувата образуют пропионовую кислоту. Многие бактерии при сбраживании углеводов наряду с другими продуктами образуют этиловый спирт. При этом он, как правило, не является основным продуктом 2. Фосфогликонатный, или гексозомонофосфатный (ГКМ), путь. Этот путь расщепления глюкозы характерен для многих микроорганизмов. Последовательность реакций ГМФ-пути у бактерий идентична той, которая присуща клеткам высших организмов. Основным функциональным назначением данного пути является подготовка углеводных компонентов (пентозофосфатов) для биосинтеза нуклеиновых кислота также основной массы НАДФ Н, необходимого для различных биосинтетических реакций. Кетодезоксифосфоглюконатный (КДФГ) путь (Энтнера — Дудорова). Данным путем расщепляют глюкозу некоторые гетеротрофы, у высших организмов КДФГ-путь отсутствует. Пировиноградная кислота образуется у этих микроорганизмов двумя путями при расщеплении 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовой кислоты и при окислении глицеринальдегид-3-фосфата также, как при гликолизе. При расщеплении глюкозы КДФГ -путем синтезируется по 1 молекуле АТФ, НАД Ни НАДФ Н без газообразования. Бактерии, расщепляющие глюкозу КДФГ-путем, не имеют ферментов, необходимых для образования из пировиноградной кислоты молочной, муравьиной и других кислот. КДФГ-путь функционирует в основному аэробных микроорганизмов, в связи с чем его называют аэробным, а метаболизм — окислительным. В противоположность этому гликолитический путь, присущий облигатными факультативным анаэробам, называют «бро дильным». Многие микроорганизмы помимо глюкозы усваивают другие моносахариды, а также ди-, три- и олигосахариды, которые после определенных катаболических превращений включаются в тот или иной путь расщепления глюкозы. Таким образом, при субстратном фосфорилировании из глюкозы или других источников углерода получают лишь незначительную часть інергии. Образующиеся при этом «неокисленные» продукты брожения не могут использоваться клеткой в анаэробных условиях и выводятся из нее. Так, например, в молочной кислоте, спирте сохраняются значительные количества энергии, имеющейся в исходном продукте. Полное освобождение энергии происходит только при окислении глюкозы до Си Н . 4.1.7.2. Получение энергии путем окислительного фосфорилирования Пируват, образующийся в процессе гликолиза, окисляется до яцетил-КоА (активированная уксусная кислота, который при взаимодействии с уксусной кислотой включается в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). В этой универсальной биохимической машине, присущей как аэробным, таки анаэробным микроорганизмам, происходит расщепление ацильных групп с освобождением 4 пар атомов Н, которые восстанавливают НАД, ФАД и НАДФ до НАД Н, ФАД Ни НАДФ Н. Не менее важная функция ЦТК состоит в образовании предшественников аминокислот, которые вовлекаются в реакции биосинтеза. Этим можно объяснить наличие большинства ферментов ЦТК у облигатных анаэробов. У прокариот, также как и у эукариот, в ЦТК вовлекаются продукты катаболизма аминокислот и жирных кислот через ацетил-КоА (см. схему У всех аэробных и факультативно-анаэробных бактерий дыхательная цепь локализована на цитоплазматической мембране. Перенос электронов на молекулярный кислород осуществляется комплексом никотинамидных дегидрогеназ либо хинонов и цитохромов. При этом дыхательная цепь в зависимости от видовой принадлежности бактерий различается по составу промежуточных переносчиков и природы конечного акцептора электронов. У бактерий распространены системы окисления субстрата, связанные нес цитохромами, ас флавинзависимыми оксидазами, которые опосредуют взаимодействие субстрата с 0 2. При этом водород ФАД Н может непосредственно передаваться 0 2 с образованием Н 2, которые аэробные бактерии расщепляют с помощью каталазы. Накопление перекиси водорода у анаэробов, не имеющих каталазы, приводит к задержке их роста и гибели. У факультативных анаэробов в качестве конечного акцептора электронов в анаэробных условиях могут использоваться нитраты с образованием N 0 3 и N 0 2. Этот процесс называется нитрификацией. Вместо цитохромоксидазы у них функционирует нитратредуктаза. 4.2. ПИГМЕНТЫ Многие микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности синтезируют пигменты, различающиеся по цвету, химическому составу и растворимости. Жирорастворимые каротиноидные пигменты красного, оранжевого или желтого цветов образуют сарцины, микобактерии туберкулеза, некоторые актиномицеты. Эти пигменты предохраняют их от действия УФ-лучей. Нерастворимые вводе и даже сильных кислотах пигменты черного или коричневого цвета — меланины — синтезируются облигатными анаэробами Bacteroides niger и др. К пирроловым пигментам ярко-красного цвета относится продигиозин, образуемый некоторыми серациями. Водорастворимые фенозиновые пигменты, например пиоцианин, продуцируются синегнойными бактериями (Pseudomonas aeruginosa). При этом питательная среда с нейтральным или щелочным pH окрашивается в сине-зеленый цвет. Цвет пигмента используется в качестве теста для идентификации пигментообразующих бактерий. СВЕТЯЩИЕСЯ И АРОМАТООБРАЗУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ Некоторые бактерии, вибрионы и грибы обладают способностью светиться (люминесцировать. Они вызывают свечение тех субстратов, например чешуи рыб, высших грибов, гниющих деревьев, пищевых продуктов, на поверхности которых размножаются. Большинство светящихся бактерий относятся к галофильным видам, способным размножаться при повышенных концентрациях солей. Они обитают в морях и океанах и редко — в пресных водоемах. Все светящиеся бактерии являются аэробами. Механизм свечения связан с освобождением энергии в процессе биологического окисления суб страта. Свечение пищевых продуктов, вызванное бактериями, не приводит к их порче. Более того, оно свидетельствует об отсутствии в этих продуктах процесса гниения, поскольку свечение прекращается при развитии гнилостных микроорганизмов. Некоторые микроорганизмы вырабатывают летучие ароматические вещества, например уксусноэтиловый и уксусно-амиловый эфиры, которые придают аромат вину, пиву, молочнокислыми другим пищевым продуктам, вследствие чего применяются в их производстве. РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ Под ростом клетки понимают координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее в конечном итоге к увеличению массы клетки. Термином размножение обозначают увеличение числа клеток в популяции. Большинство прокариот размножаются поперечным делением, некоторые почкованием. Грибы размножаются путем спорообразования. При размножении микробной клетки наиболее важные процессы происходят в ядре (нуклеоиде), содержащем всю генетическую информацию в двунитевой молекуле ДНК. Репликация ДНК происходит полуконсервативным способом, обеспечивающим равномерное распределение генетического материала между дочерними клетками. І Іадежноеть процесса репликации и правильность расхождения (сегрегация) дочерних цепей обеспечивается связью ДНК с цитоплазматической мембраной. Репликация начинается в определенной точке (локус) ДНК и происходит одновременно в двух противоположных направлениях. Синтез дочерних нитей ДНК идет ступенчато, короткими фрагментами, равными 1-2 тыс. нуклеотидов, которые сшиваются специальным ферментом лигазой. Параллельно с репликацией ДНК начинается образование межклеточной (поперечной) перегородки. Вначале с обеих сторон клетки происходит врастание двух слоев цитоплазматической мембраны. Затем между ними синтезируется пептидогликан. Этот процесс чувствителен к действию некоторых антибиотиков (пенициллинов), ингибирующих синтез пептидогликана. В период репликации ДНК и образования перегородки микробная клетка непрерывно растет. Наряду с пептидогликаном синтезируются биополимеры, входящие в состав цитоплазматической мембраны, рибосом и цитоплазмы. На последней стадии дочерние клетки отделяются друг от друга. В этом периоду грамотрицательных бактерий синтезируется наружная мембрана, которая встраивается между двумя слоями пептидогликана межклеточной перегородки. В том случае, когда разделившиеся бактериальные клетки сохраняют межклеточные связи, образуются цепочки, состоящие из клеток шаровидных или палочковидных форм (стрептококки и стрептобактерии). Подавляющее большинство актиномицет размножается путем фрагментации нитевидных клеток с образованием палочковидных или кокковидных форм. Облигатные внутриклеточные паразиты риккетсии и хламидии размножаются неодинаковыми способами. Риккетсии размножаются также, как и бактерии, путем бинарного деления (см. рис. 3.9). Хламидии проходят определенный цикл развития. Элементарные тельца, попадая в вакуоль чувствительной клетки, преобразуются в вегетативные формы инициальные или ретикулярные тельца, которые способны к делению. После нескольких делений они преобразуются в промежуточные формы, из которых формируется новое поколение элементарных телец (см. рис. 3.10). После разрыва стенки вакуоли и разрушения клетки хозяина элементарные тельца освобождаются, и весь цикл повторяется в других клетках. Продолжительность цикла составляет 40-48 ч. У микоплазм основными репродуцирующимися морфологическими единицами являются мелкие элементарные тела сферической или овоидной формы величиной 130-220 нм, которые размножаются путем фрагментации или почкования. У некоторых видов микоплазм отмечается образование сравнительно крупных шаровидных тел, от которых отпочковываются дочерние клетки. Клетки микоплазм могут размножаться также поперечным делением, если оно происходит синхронно с репликацией ДНК. При нарушении синхронности образуются мононуклеоидные нитевидные клетки, которые в последующем делятся на кокки. Размножение бактерий на жидких и плотных питательных средах. Фазы развития бактериальной популяции Бактерии, как правило, характеризуются высокой скоростью размножения по сравнению с другими прокариотами. Скорость их размножения, помимо видовой принадлежности, зависит от состава питательной среды, pH, температуры, аэрации и других факторов. На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток, называемые колониями. Внешний вид колоний у многих бактерий настолько характерен, что может служить одним из дифференциальных признаков для их идентификации. Колонии разных видов отличаются по своим размерам, форме, поверхности, окраске, прозрачности и др. (рис. 4.1). Однако эти признаки могут изменяться в зависимости от условий культивирования. На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения, либо осадка. Размножение бактерий определяется временем генерации, те. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов. КО ЛОНИИ РАЗНОГО СТРОЕНИЯ кругл* я Яка ра*р««« Рис. 4.1. Разные типы колоний бактерий Рис. 4.2. Фазы (А, Б) и скорость (В) роста бактерий объяснение в тексте) В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах от 20 мину кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем их колонии образуются через 18-20 ч либо через 3-6 недель соответственно. При выращивании бактерий в жидкой питательной среде наблюдается последовательная смена отдельных фаз в развитии популяции, отражающая общую закономерность роста и размножения бактериальных клеток. Динамика развития бактериальной популяции представлена на рис. 4.2. I — исходная стационарная фаза начинается после внесения бактерий в питательную среду. В течение данной фазы число бактериальных клеток не увеличивается (рис. 4.2, I). II — лаг-фаза, или фаза задержки размножения (см. рис. 4.2, II), характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой. Две первые фазы можно назвать периодом адаптации бактериальной популяции, продолжительность которого определяется возрастом культуры, а также количеством и качеством питательной среды — лог-фаза, или логарифмическая (экспоненциальная) фаза (см. рис. 4.2, III), отличается максимальной скоростью размножения клеток и увеличением численности бактериальной популяции в геометрической прогрессии. Логарифмическая фаза у бактерий с коротким временем генерации продолжается несколько часов — фаза отрицательного ускорения (см. рис. 4.2, IV) характеризуется меньшей активностью бактериальных клеток и удлинением периода генерации. Это происходит в результате истощения питательной среды, накопления в ней продуктов метаболизма и дефицита кислорода. Максимальная стационарная фаза (см. рис. 4.2, V) характеризуется равновесием между количеством погибших, вновь образующихся и находящихся в состоянии покоя клеток. Графически максимальная стационарная фаза изображается в виде прямой линии, параллельной оси абсцисс. При этом количество живых бактерий в популяции обозначают каких максимальную (М) концентрацию в единице объема питательной среды. Данный признак является достаточно стабильным для определенного вида бактерий в стандартных условиях — фаза логарифмической гибели бактерий (см. рис. 4.2, VI) происходит в постоянной скоростью и сменяется VII—VIII фазами уменьшения скорости отмирания клеток. Принципы культивирования и идентификации бактерий Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточных паразитов риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метабо лизма. Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний, в на учно-исследовательской работе ив микробиологическом производстве вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов микробной жизнедеятельности. Условия культивирования также зависят от свойств соответствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре Св течение 1 2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша в 2-3 сутках, а микобактерии туберкулеза — в 3—4 неделях. Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания используют метод глубинного культивирования, который заключается в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотехнологии. Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами в герметизированных термостатах — анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуци рующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др, уменьшающие окислительно-восстановительные потенциал. В диагностической практике особое значение имеют чистые культуры бактерий, которые выделяются из исследуемого материала, взятого у больного или объектов окружающей среды. С этой целью используют искусственные питательные среды, которые подразделяют на основные, дифференциально-диагностические и элективные самого разнообразного состава. Выбор питательной среды для выделения чистой культуры имеет существенное значение при бактериологической диагностике. В большинстве случаев используют твердые питательные среды, предварительно разлитые в чашки Петри. На поверхность среды петлей помещают исследуемый материал и растирают шпателем, чтобы получить изолированные колонии, выросшие из одной клетки. Пересев изолированной колонии на скошенную агаровую среду в пробирку приводит к получению чистой культуры. Для идентификации, те. определения родовой и видовой принадлежности выделенной культуры, чаще всего изучают фенотипичес кие признаки: а) морфологию бактериальных клеток в окрашенных мазках, либо нативных препаратах; б) биохимические признаки культуры по ее способности ферментировать углеводы (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, маннит и др, образовывать индол, аммиак и сероводород, являющиеся продуктами протеолитической активности бактерий. Для более полного анализа применяют газово-жидкостную хро мографию и другие методы. Наряду с бактериологическими методами для идентификации чистых культур широко используют иммунологические методы исследования, которые направлены на изучение антигенной структуры выделенной культуры. С этой целью используют серологические реакции агглютанации, преципитации иммунофлюоресценции, связывания комплемента, иммуноферментный, радиоиммунный методы и др. В настоящее время все более широкое применение в медицинской микробиологии находят генотипические методы, основанные на определении гомологии ДНК искомого микроорганизма в исследуемом материале, с эталонной ДНК. С этой целью используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (рис. 4.5) и генетические зонды (рис. 4.3), сэндвичгибридизацию (рис. 4.4). Для постановки ПЦР ДНК-прай- мер — короткую однонитевую последовательность нуклеотидов, комплементарную начальному и конечному участку ДНК, — в избытке Принкнм метода ДПК-гвбриля нмин И ж ш п a o u t i v i t T t i u M l t ДНК -том дИк'Ч^шгпк |