Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
Р і г і м п м іа ( ял ю 1 ДНК ■ ЛІГК-юш.іо* Р ис. Клонируемая последовательность ДНК с нужном специфичностью су А клонирован нес оста вене родственных пл а а мн да е гт о ров П Р И Н Ц И ПС ЭНД ВИЧ- ГИБРИДИЗАЦИИ ЫММПЙИ- введением е т кип н я а ц и яра дно и я ото л ы биотин и др вида специфических ДНК вон доя клонируют в составе и его мол о г и ч и ы х век ю ров пл а ім и дао н дм мм обили а о ван, другой несет метку, исп о ль ау ему ю для обнаружения. Искомая ДНК мишень, прм сут ст в у ю щ а я во бра з ц е , гибрид из и р у е т с я со бои ми а он дам нс образованием с э и д в и ч - гиб р н да. который обнаруживается на твердой фа а е благодаря наличию метки б р м д Рис. добавляют к нуклеиновой кислоте выделенной из исследуемого материала. После этого проводят гибридизацию. При наличии искомого гена происходит его гибридизация с праймером. После добавления ДНК-полимеразы и нуклеотидов начинается достраивание ДНК. Весь цикл многократно повторяется, в результате чего происходит амплификация генов, которые легко обнаруживаются. ПЦР в настоящее время широко применяется для диагностики большинства бактериальных и вирусных инфекций. Наряду с ПЦР для генетической идентификации применяют нуклеиновые зонды. Зонд представляет собой плазмидную ДНК с интегрированным в нее фрагментом ДНК, меченным контрастным веществом или радиоактивной меткой. Меченый зонд вместе с исследуемым материалом наносится на мембранный фильтр, после чего определяется степень 1 -і ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ Разделеяне ц та ДНК ■ Уд. □ ресоед и н ен и е прайм еров. М|Ш 1111 ПТТТП изучаемого праймеров И “ K O D l t ф рвпм ап ДНК Ш ГГТГПТ ГГПТГТ птттттт ш ш ш : птттп шли тгтттт І Н Ш І Д обе с конечности П Ц Р - циклический процесс, ■ каждом цикле число молекул ДН К-миш еяи удваивается. Цстш в каждом дугикжсе ДНК -м иш еяи разделяются при нагревании, потом при оклаж дсяин сними связываются прайьсф ы . Затем ДНК- полимераза наращивает прай меры, присоединяя к ним нукж отиды. В результате образуются копии ;------ л ------------ л " * г ш г ----------- Рис. его гомологии и исследуемой ДНК. Данный метод дает возможность быстро определить в исследуемом материале ДНК тех или других микроорганизмов и поставить диагноз заболевания. МИКРОБНЫЕ СООБЩЕСТВА В естественных условиях микроорганизмы не существуют в качестве одиночных изолированных клеток, а находятся в составе микробных сообществ, к которым относятся микробные колонии. Однако и они не остаются изолированными образованиями, а объединяются за счет внеклеточного вещества в б и оп лен к и . Одни из них — колониеподобные сообщества — образуются при размножении бактерий одного вида, другие — смешанные микробные сообщества (СМС) — формируются при размножении бактерий разных видов. Они сравнительно устойчивы к факторам окружающей среды и встречаются у разных представителей грамотрицательных и грамположительных бактерий. В микробных сообществах бактерии обладают неизвестными ранее свойствами, проявляя признаки многоклеточных организмов. Сообщества покрыты поверхностной пленкой, основу которой составляет элементарная мембрана. Она покрывает всю поверхность сообщества с наружной и внутренней стороны и состоит из белков и полисахаридов. В СМС наружная мембрана является общей для разных микроорганизмов. Внутри микробного сообщества бактерии объединены в целостную структуру за счет межклеточных контактов двух типов. К первому относятся цитоплазматические мостики — тончайшие мембранные трубочки, соединяющие цитоплазмы различных клеток. Второй тип характеризуется тесным слипанием бактериальных клеток, при котором на определенных участках бактерии имеют общую клеточную стенку. Наличие подобных контактов обеспечивает бактериям передачу различных молекул, имеющих небольшую массу. Это обусловливает возможность генерирования общих ответов на внешние воздействия даже в том случае, если они достигли малого числа клеток. Значение микробных сообществ состоит в том, что они выполняют защитную функцию, обеспечивая более высокую устойчивость к воздействию внешних факторов. В организме человека бактерии также существуют в виде микробных сообществ. Это касается как нормальной микрофлоры, таки патогенов. В процессе колонизации они образуют сообщества, которые постепенно объединяются в биопленки. Выживаемость бактерий в таких сообществах весьма высока в присутствии антибактериальных препаратов. При этом различные антибиотики и химиотерапевтические препараты обладают индивидуальной способностью проникать сквозь оболочки микробных сообществ, что имеет существенное практическое значение в химиотерапии инфекционных заболеваний. Вопросы для самоконтроля. Какие источники углерода, азота и электронов используют хемосинте зирующие микроорганизмы и на какие группы их подразделяют по типу питания. Каким образом питательные вещества проникают в микробную клетку. Расскажите об индуцибельных и конститутивных ферментах микробной клетки и о механизме индукции. Каковы пути биосинтеза аминокислот, углеводов и липидов в микробных клетках. Какими путями микроорганизмы получают энергию и какие катаболи- ческие реакции присущи только им. Каким путем размножается бактериальная клетка и каков механизм равномерного распределения генетического материала в дочерних клетках на молекулярном уровне. Расскажите о фазах развития бактериальной популяции в жидких питательных средах. Какие питательные среды используют для выделения бактерий. Какие питательные среды используют для дифференциации бактерий. Какие питательные среды используют для культивирования бактерий. Какие методы культивирования бактерий используют в биотехнологии. Как культивируют анаэробных бактерий. Какие тесты используются для идентификации бактерий. В чем заключаются генотипические методы идентификации бактерий (ПЦР, генетические зонды, сэндвич-гибридизация)? ГЛАВА ОБЩАЯ ВИРУСОЛОГИЯ Современная вирусология представляет собой бурно развивающуюся отрасль естествознания, оказывающую большое влияние на развитие многих медико-биологических и клинических дисциплин. Изучение механизмов репродукции вирусов показало возможность их воспроизведения только из одной нуклеиновой кислоты -ДНК или РНК. Открытие и последующее изучение явлений лизогении и вирогении, свидетельствующих о возможности сохранения вирусной информации и передаче ее потомству в составе клеточного генома, потребовало пересмотра сложившихся понятий о механизмах формирования персистирующих инфекций и онкологических заболеваний. Открытие нового вируса иммунодефицита человека ВИЧ доказало возможность образования новых видов, вызывающих определенные нозологические формы инфекций человека в современных условиях. Вместе стем в области общей вирусологии продолжает оставаться ряд нерешенных проблем, связанных с происхождением, генетикой и молекулярной биологией вирусов, изысканием путей химиотерапии вирусных инфекций и т.д. 5.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСОВ Стремительные темпы развития вирусологии во второй половине XX в. позволили получить важнейшие сведения о структуре и химическом составе разных вирусов, в том числе их генома, а также о характере взаимодействия с клетками хозяев. Полученные материалы свидетельствуют о том, что вирусы существуют в двух качественно разных формах внеклеточной в и р ион ив нут р и клеточной вирус. Вирион наиболее простого вируса представляет собой нуклеопротеид, в состав которого входит вирусный геном, защищенный белковой оболочкой — кап си дом. В тоже время внутриклеточный вирус есть самореплицирующаяся форма, неспособная к бинарному делению Таблица Некоторые таксономические признаки представителей важнейших семейств вирусов человека и животных Таксономический признак Семейство Важнейшие представители. ДНК-содержащие вирусы Двунитевая ДНК. Отсутствие внешней оболочки Аденовирусы Аденовирусы Паповирусы Вирусы папиломы, полиломы и бородавок человека Однонитевая ДНК. Отсутствие внешней оболочки Парвовирусы Аденоассоциированные вирусы Двунитевая ДНК. Наличие внешней оболочки Герпесвирусы Вирусы простого герпеса, цитомегалии, ветряной оспы Гепаднавирусы Вирус гепатита В Поксвирусы Вирусы натуральной оспы, осповакцины II. РНК-содержащие вирусы Плюс-однонитевая РНК. Отсутствие внешней оболочки Пикорнавирусы Вирусы полиомиелита, Коксаки, ECHO, вирус гепатита А Калицивирусы Вирусы гастроэнтерита детей (Норфолк) Двунитевая РНК. Отсутствие внешней оболочки Реовирусы Реовирусы, ротавирусы, орбивирусы Наличие обратной транскриптазы Ретровирусы ВИЧ, вирусы лейкоза, онковирусы Плюс-однонитевая РНК. Наличие внешней оболочки Тогавирусы Вирусы омской геморрагической лихорадки, краснухи Плюс-нитевая РНК (позитивным геном) Флавивирусы Вирусы клещевого энцефалита, лихорадка денге, желтой лихорадки Минус-однонитевая РНК Буньявирусы Вирусы Буньямвера, крымской геморрагической лихорадки Аренавирусы Вирусы лимфоцитарного хориоменингита, болезни Лассо Рабдовирусы Вирусы бешенства, везикулярного стоматита Двунитевая РНК. Наличие внешней оболочки Парамиксовирусы Вирусы парагриппа, паротита, кори, РСВ Ортомиксовирусы Вирусы гриппа человека, животных, птиц Тем самым в определение вируса закладывается принципиальное различие между клеточной формой микроорганизмов, размножающихся бинарным делением, и реплицирующейся формой, воспроизводящейся только из вирусной нуклеиновой кислоты. Однако качественное отличие вирусов от про- и эукариот не ограничивается только одной этой стороной, а включает ряд других 1) наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) отсутствие клеточного строения и белоксинтезирующих систем) возможность интеграции в клеточный геном и синхронной с ним репликации. Вместе стем вирусы отличаются от обычных репликонов, какими являются молекулы ДНК всех микроорганизмов и любых других клеток, а также плазмид и транспозонов см. 6.2.2), поскольку упомянутые репликоны являются биомолекулами, которые нельзя отнести к живой материи. Классификация и таксономия вирусов. Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства — р ибо вирусы и де з о кси р ибо вирусы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются народы. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, также как и обозначение разных видов. В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биоло гическим признакам двунитевая, однонитевая, сегментированная, несегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, полученные в результате элек тронно-микроскопических и иммунологических исследований морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоплазматическая локализация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, pH, детергентами т.д. В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств (табл. 5.1). Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кислоты, ее структурой, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы. 5.1.1. Морфология и структура вирионов Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах от 15-18 до 300-400 нм. Они имеют разнообразную форму палочковидную, нитевидную, сферическую форму параллелепипеда, сперматозоидную (рис. Структура простого вириона — нуклеокапсида — свидетельствует о том, что вирусная нуклеиновая кислота — ДНК или РНК — надежно защищена белковой оболочкой — кап си дом. Последний имеет строго упорядоченную структуру, в основе которой лежат Рис. 5.1. Упаковка морфологических а, б, в) и структурных (г) субъединиц по кубическому типу симметрии икосаэдрического вириона (I) и по спиральному типу симметрии у палочковидного вириона (принципы спиральной или кубической симметрии. Капсиды палочковидных и нитевидных вирионов СОСТОЯ из структурных субъединиц, уложенных в виде спирали вокруг оси. При таком расположении субъединиц образуется полый канал, внутри которого компактно уложена молекула вирусной нуклеиновой кислоты. Ее длина может во много раз превышать длину палочковидного вириона. Например, длина вируса табачной мозаики (ВТМ) 300 нм, а его РНК достигает величины 4000 нм, или 4 мкм. 11ри пом РНК настолько связана с капсидом, что ее нельзя освободить, не повредив последний. Подобные капсиды встречаются у некоторых бактериальных вирусов и у вирусов человека (например, вируса гриппа). Сферическая структура вирио нов определяется капсидом, построенном по принципам кубической симметрии, в основе которой лежит фигура икосаэдра — двадцатигранника. Капсид состоит из асимметричных субъединиц (полипептидных молекул, которые объединены в морфологические субъединицы — кап соме р ы . Один капсомер содержит 2, 3 или 5 субъединиц, расположенных по соответствующим осям симметрии икосаэдра. В зависимости от типа перегруппировки и числа субъединиц число капсомеров будет равным 30, 20 или На рис. 5.1 представлены возможные типы простых вирионов, состоящих из определенного количества капсомеров, изображенных в виде шариков, а также капсомеров увеличивающегося объема Рис. 5.2. Аденовирус. Электронная микроскопия. Ув. 250 ООО: а — негативный контраст б — ультратонкий срез Вирионы со сложным капсидом, построенным более чем из 60 структурных субъединиц, содержат группы из 5 субъединиц — пен тамеры, или из 6 субъединиц гексамеры. Ну кл е ока пси д сложноорганизованных вирионов, называемый сердцевиной, покрыт внешней оболочкой — супер кап си- дом. Химический состав вирионов В состав простых вирионов входит один тип нуклеиновой кислоты — РНК или ДНК — и белки. У сложных вирионов в составе внешней оболочки содержатся липиды и полисахариды, первые получают из клеток хозяина, вторые в виде гликопротеидов закодированы в геноме вируса. Вирусные ДНК. Молекулярная масса ДНК разных вирусов колеблется в широких пределах (1 • 106- 1 • 108). Она примерно враз меньше молекулярной массы ДНК бактерий. В геноме вирусов содержится до нескольких сотен генов. По своей структуре вирусные ДНК характеризуются рядом особенностей, что дает возможность подразделить их на несколько типов. К ним относятся двунитевые и однонитевые ДНК, которые могут иметь линейную или кольцевую форму. Хотя в каждой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, на ее концах имеются прямые или инвертированные (повернутые на 180°) повторы. Они представлены теми же нуклеотидами, которые располагаются в начальном участке ДНК. Нуклеотидные повторы, присущие как однонитевым, таки двунитевым вирусным ДНК, являются своеобразными маркерами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транскрибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном. Вирусная РНК. У РНК-содержащих вирусов генетическая информация закодирована в РНК таким же кодом, как в ДНК всех других вирусов и клеточных организмов. Вирусные РНК по своему химическому составу не отличаются от РНК клеточного происхождения, но характеризуются разной структурой. Наряду с типичной однони- тевой РНК у ряда вирусов имеется двунитевая РНК. При этом она может быть линейной и кольцевой. В составе однонитевых РНК имеются спиральные участки типа двойной спирали ДНК, образующиеся вследствие спаривания комплементарных азотистых оснований. Однонитевые РНК в зависимости от выполняемых ими функций подразделяют на две группы. К первой относят РНК, обладающие способностью транслировать закодированную в ней информацию на рибосомы клетки хозяина, те. выполнять функцию иРНК. Ее называют плюс-нить и обозначают знаком «+» (позитивный геном. Ко второй группе относят вирусные одноцепочечные РНК, которые немо гут функционировать как иРНК, атак же как ДНК служат лишь матрицей для ее образования. Такие РНК называют минус-нить, обозначают знаком «-» (негативный геном. РНК плюс-нитевых вирусов в отличие от минус-нитевых имеют характерные модифицированные концы в виде шапочки, которые необходимы для специфического узнавания рибосом. Вирусные РНК состоят из нескольких фрагментов (например, РНК вируса гриппа) или представлены нефраг- ментированной молекулой (РНК парамиксовирусов). У двунитевых как ДНК, таки РНК-содержащих вирусов информация обычно записана водной цепи. Однако существуют вирусы, у которых информация может быть частично закодирована и во второй цепи. Таким образом, достигается экономия генетического материала. В тоже время это указывает на то, что проведение оценки количества генетической информации по молекулярной массе ДНК или РНК может оказаться недостоверной. Вирусные белки, также как и белки клеточных организмов, подразделяют на структурные и функциональные Первые входят главным образом в состав вирусного капсида, вторые представляют собой ферменты, участвующие в процессе репродукции вирусов. Структурные белки у простых вирионов, лишенных суперкапси- да, представлены капсидными белками, которые образуют футляр, защищающий нуклеиновую кислоту. Кроме того, в их состав входят белки, несущие адресную функцию, заключающуюся в узнавании специфических рецепторов клеток хозяина. Они могут участвовать также в адсорбции вирусов на этих клетках и проникновении в них. У сложных вирионов, имеющих внешнюю оболочку, капсидные белки также выполняют защитную функцию. Однако они не принимают прямого участия в адсорбции вируса и проникновении к клетку хозяина. У многих сложных вирионов в составе капсидных белков содержатся ферменты, участвующие в репликации и транскрипции вирусных РНК или ДНК. Кроме того, в составе вирионов имеются так называемые внутренние гистоноподобные белки, связанные с вирусной нуклеиновой кислотой. Они образуют рибо- или дезоксири- бонуклеопротеиды, которые обладают определенными антигенными свойствами. Существенной особенностью капсидных белков является строго упорядоченная структура, обеспечивающая построение капсида из субъединиц-капсомеров, состоящих из идентичных полипептидных цепей способных к самосборке. Таким образом достигается экономия генетического материала вируса. В противном случае, для синтеза разных капсидных белков потребовалась бы информация, закодированная в гораздо большем количестве генов. Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков, которые входят в состав гликопротеидов и гликолипидов. У многих вири онов они распространяются в виде шиповидных отростков на поверхности суперкапсида. Гликопротеидные шипы обладают антигенными свойствами. Многие из них ответственны за адсорбцию на специфических рецепторах клетки и принимают участие в слиянии с клеточной мембраной, обеспечивая тем самым проникновение вири она в клетку хозяина. Наряду с упомянутыми соединениями в составе суперкапсида имеются гликолипиды. Липидный и углеводный состав вириона определяется клеткой хозяина, но модифицируется суперкапсидными белками. Липиды стабилизируют структуру сложных вирионов. |