Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
Ферменты вирусов. В отличие от прокариот и клеток всех других организмов, вирусы лишены ферментов, участвующих в многочисленных метаболических реакциях. Однако многие вирусы содержат в составе капсидов одну или две группы ферментов. К первой относятся ферменты репликации и транскрипции, ко второй — ферменты, участвующие в проникновении вирусной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе образовавшихся вирионов (нейрамини- даза, лизоцим, АТФ-аза). Ферменты вирусов подразделяют на в и р ионные ив и русин д у ц и ров ан н ы е . К первым относят ферменты транскрипции и репликации (ДНК- и РНК-полимеразы), обнаруженные у многих вирусов, обратная транскриптаза ретровирусов, а также эндо- и экзонуклеазы, АТФ-аза, нейраминидаза отдельных ви русов. Вирусиндуцированными считаются те ферменты, структура которых закодирована в вирусном геноме. Прежде всего это относится к РНК-полимеразам пикорна-, тога, орто- и парамиксовирусам, атак же ДНК-полимеразе покс- и герпесвирусов. Наряду с собственными вирусы используют клеточные ферменты, которые не являются вирусспецифическими. Однако их активность может модифицироваться в процессе репродукции вируса 5.2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ ХОЗЯИНА Взаимодействие вируса с клеткой хозяина это сложный многоступенчатый процесс, который начинается с адсорбции вирусных частиц на рецепторах клетки хозяина и продолжается после их проникновения внутрь клетки. В результате такого взаимодействия развивается либо продуктивная, либо абортивная, либо интегративная форма клеточной инфекции. При продуктивной форме происходит размножение, точнее, репродукция (лат. reproduce — воспроизводить) вируса, при абортивной ее нарушение на одном из этапов, при интегративной интеграция вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном. Продуктивная инфекция. Репродукция вирусов Как отмечалось выше, вирусы являются самореплицирую- щейся формой, неспособной к бинарному делению, в отличие от микроорганизмов с клеточной организацией. В х годах было установлено, что размножение, или репродукция, вирусов происходит путем репликации их нуклеиновой кислоты и биосинтеза белков с последующей самосборкой вириона. Этот процесс происходит в разных частях клетки — ядре или цитоплазме, вследствие чего получил название дизъюнктивного, те. разобщенного размножения. Вирусная репродукция представляет собой уникальную форму выражения чужеродной (вирусной) информации в клетках человека и животных, насекомых, растений и бактерий, которая состоит в подчинении клеточных матрично-генетических механизмов вирусной информации. 1-я стадия адсорбция рис. 5.3, 5 .4 )— характеризуется прикреплением вириона к клеточным рецепторам, представляющим собой гликопротеины клеточной мембраны, содержащей нейраминовую кислоту. Такие рецепторы имеются у ряда клеток, в частности эрит- АДСОРБЦИЯ И ПРОНИКНОВЕНИЕ Ад сор в ц ка і ярус і герпеса Про ни о ан ив и рус а герпеса на клетке хо а аи и а як летку хо а яма Рис. 5.3. Вирус герпеса (адсорбция и проникновение. ЭМ йШМЧ ДОМН И . . т г - ■ Вірус пр в і » . ш л т Рис. 5.4. Вирус герпеса (дезинтеграция в клетке. ЭМ роцитов, на которых адсорбируются многие вирусы. Для орто- и па- рамиксовирусов специфическими рецепторами являются гликолипиды, содержащие сиаловую кислоту (ганглиозиды), для других — белки или липиды клеточной мембраны. Рецепторами вирусов являются так называемые прикрепительные белки, располагающиеся в составе капсидов простых вирионов и суперкапсидов сложных вирионов. Они могут иметь форму нитей фибры у аденовирусов) или шипов (гликопротеиновые образования на внешней оболочке орто- и парамиксо-, рабдо-, арено- и буньявиру- сов). Первый этап адсорбции определяется неспецифическими силами межмолекулярного притяжения, второй — специфической структурной гомологией или комплементарностью рецепторов чувствительных клеток и вирусов. 2-я стадия — проникновение вируса в клетку хозяина — происходит несколькими путями Рецепторно-опосредованный эндоцитоз (рис. 5.5) характеризуется образованием вместе взаимодействия вириона с клеточным рецептором окаймленных пузырьков, в формировании которых принимают участие белки-клатрины. — Виропексис. Этим путем в клетку проникают сложноустроен ные вирусы. Он заключается в слиянии мембран — вирусного супер- капсида с клеточной или ядерной мембраной (рис. 5.6). Данный процесс происходит при помощи специального бека слияния — белка, который находится в суперкапсиде. В результате виропексиса капсид оказывается в клетке хозяина, а суперкапсид вместе с белком встраивается в ее плазматическую мембрану (вследствие чего клетка приобретает способность сливаться с другими клетками, что приводит к передаче вируса этим клеткам Фагоцитоз. Данным путем вирус проникает в фагоцитирую щие клетки, что приводит к незавершенному фагоцитозу. 3-я стадия — транспорт вируса внутри клетки. Он происходит с помощью внутриклеточных мембранных пузырьков, в которых вирус переносится на рибосомы, эндоплазматическую сеть или в ядро Рис. 5.6. Проникновение вируса в клетку хозяина путем слияния мембран (схема) ан вклаточный аирион _ вдсорбцнк З ш я ч ш в ни е клеточной оболочки і локализация аирусв а фвгосом* S проник яоаенна сардцааины аирионв а ц и топ л в ім у Рис. 5.5. Проникновение вируса в клетку хозяина путем рецепторного эндоцитоза (схема) с ер д ц а » » і м р иона ВмИТОЧ ив" ПрООТР ЙНСТВО 1 КЛАТКТ Х0ІЯІВ1 а у т вы слит мвмОрвв И Щ С - о у парка пси д — В и кл а ю ч а ы А он ко вирус, З, і — П0СЛВД01ВТВЛ1МЫВ ■ IB ПЫ СЛЄІ1НІ супер кап си да і и рус в ■ КЛЯТКІ 4-я стадия — раздевание вириона — заключается в их деп- ротеинизации и освобождении от суперкапсида и капсида, препятствующих репликации вирусной нуклеиновой кислоты. Раздевание вириона начинается сразу же после его прикрепления к клеточным рецепторами продолжается в эндоцитарной вакуоли и ее слиянии с лизосомами при участии протеолитических ферментов, а также в ядерных порах и околоядерном пространстве при слиянии с ядерной мем браной. 5-я стадия называется эклипс-фазой, которая характеризуется исчезновением вириона, поскольку он перестает обнаруживаться при электронной микроскопии. В эту стадию начинается синтез компонентов вириона, те. его репродукция. Она носит дизъюнктивный (раздельный) характер, поскольку компоненты вириона синтезируются в разных частях клетки белки на рибосомах, нуклеиновые кислоты в < * w w / w Рис. 5.7. Транскрипция и репликация вирусного ДНК-генома Рис. 5.8. Транскрипция и репликация РНК-геномных вирусов ядре или цитоплазме. Вирус использует для этого генетический аппарат клетки, подавляя необходимые ей самой синтетические реакции. Эта стадия начинается с транскрипции и репликации вирусного генома. Транскрипция вирусного генома двунитевых ДНК-содержа- щих вирусов происходит, также как и клеточного генома, по триаде ДНК иРН К белок (рис. 5.7). Различия касаются только происхождения фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы, необходимой для данного процесса. У вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина (например, вирус оспы, имеется собственная вирусспецифическая РНК-полимераза. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре (папова- и аденовирусы, вирусы герпеса, используют содержащуюся там клеточную РНК-полимеразу II или У РНК-содержащих вирусов транскрипция их генома осуществляется несколькими путями (рис. 5.8). 1. Вирусы с негативным геномом (минус-нитевые), к которым относятся орто, парамиксо- и рабдовирусы (см. табл. 5.1), имеют в своем составе вирусспецифическую РНК-полимеразу или транскрип- тазу. Они синтезируют кРНК на матрице геномной РНК. Подобный фермент отсутствует в нормальных клетках, но синтезируется клетками, зараженными вирусами. Он находится в составе как однонитевых, таки двунитевых РНК- содержащих вирусов. У вирусов с положительным геномом (плюс-нитевые), к которым относятся пикорна-, тогавирусы и др, функцию иРНК выполняет сам геном, который транслирует содержащуюся в нем информацию на рибосомы клетки хозяина. Особняком стоит группа РНК-содержащих ретровирусов, в составе которых имеется обратная транскриптаза, или ревертаза. Уникальность этого фермента состоит в его способности переписывать информацию с РНК на ДНК. Этот процесс называется обратной транскрипцией (рис. Как отмечалось выше, количество генов в вирусном геноме весьма ограничено. Поэтому для увеличения количества вирусной инфор- ■■рус а шт о али м аж кобра титр нс і р і а а і і » » РТ ДНК и ша вУ во»тор •п овто р (Л ІТ Ом о ї в « см до і и ела с п РЕТРО ВИРУСЫ ОБРАТНАЯ ТРАНС КРИП Ц И ЯР и с . 5.9. Жизненный цикл ретровируса (схема) мации существует своеобразный трансляционный механизм, функционирующий через мРНК, который передает значительно больше информации, чем записано в вирусной нуклеиновой кислоте. Это дос- 1 -игается разными путями, например при транскрипции информации с переписывающихся участков ДНК на мРНК путем с пл ай си на (вырезание бессмысленных кодонов и сшивание концов, а также при считывании антикодонами /иРНК одной и той же молекулы мРНК с разных нуклеотидов. При этом образуются новые триплеты, увеличивающие количество транслируемой информации. Регуляция транскрипции осуществляется клеточными и вирусспе- цифическими механизмами. Она заключается в последовательном считывании информации с так называемых ранних и поздних генов. В первых закодирована информация для синтеза вирусспеци- фических ферментов транскрипции и репликации, во вторых — для синтеза капсидных белков. Вирусспецифическая информация транслируется на рибосомы клетки хозяина, которые предварительно освобождаются от клеточных белков и собираются в вирусспецифические полисомы. Репликация вирусных геномов заключается в синтезе молекул ДНК или РНК, которые накапливаются в фондах этих нуклеиновых кислот, использующихся при сборке вирионов. Репликация вирусной ДНК происходит на обеих нитях при участи клеточной ДНК-полимеразы. У однонитевых вирусов вначале образуется вторая нить (репликативная форма). Репликация вирусных РНК происходит только при участии того же вирусспецифического фермента, который катализирует транскрипцию вирусного генома. У плюс-нитевых вирусов репликация РНК практически не отличается от их транскрипции. У минус-нитевых вирусов репликация отличается от транскрипции длиной образовавшихся дочерних молекул РНК. При репликации они полностью соответствуют по своей протяженности материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК. У ретровирусов репликация, также как и транскрипция ДНК, происходит в составе клеточного генома при участии клеточной ДНК- полимеразы. 6-я стадия — сборка вириона — состоит прежде всего в образовании нукпеокапсидов. Поскольку синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков в клетке происходит в разных ее структурах, необходима транспортировка составных частей вириона водно место сборки. При этом вирусные белки и нуклеиновые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизвольно соединяться друг с другом. В основе самосборки простых вирионов лежит способность вирусных полипептидов соединяться в капсомеры, которые, располагаясь вокруг осей симметрии, образуют многогранник. В других случаях полипептиды в виде спирали окружают вирусную нуклеиновую кислоту. Многие простые вирионы собираются на репликативных комплексах — мембранах эндоплазматического ретикулума. У сложных вирионов сборка нуклеокапсида начинается на репликативных комплексах, а затем продолжается на плазматической мембране, с наружной стороны которой располагаются суперкапсидные гликопротеиды. Затем гликопротеидные и примыкающие к ним с другой стороны нук- леокапсидные участки выпячиваются через клеточную мембрану, образуя почку, как это имеет место у орто- и парамиксовирусов, раб- довирусов. После отделения почки, содержащей нуклеокапсид и су перкапсидные белки, образуются свободные вирионы. Они либо через клеточную плазматическую мембрану проходят во внеклеточное пространство, либо через мембрану эндоплазматического ретикулума проникают в вакуоль эндоплазматической сети. При этом мембранные липиды обволакивают почку, вытесняя из нее белки. Многие ДНК- содержащие вирусы, например вирус герпеса, собираются в ядре клетки на ее мембране, где образуются нуклеокапсиды. Затем они отпочковываются в перинуклеарное пространство, приобретая внешнюю оболочку. Дальнейшее формирование вириона происходит в мембранах цитоплазматического ретикулума ив аппарате Гольджи, откуда вирус транспортируется на поверхность клетки. 7-я стадия — выход вирусных частиц из клетки — происходит двумя путями. Простые вирусы, лишенные суперкапсида, например пикорнавирусы, аденовирусы и др, вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие вирусы, имеющие липопротеидную внешнюю оболочку, выходят из клетки путем почкования, в результате чего в течение длительного времени она сохраняет свою жизнеспособность. Такой путь характерен для вируса гриппа и др. Интегративная инфекция. Интеграция (встраивание) вирусной нуклеиновой кислоты в клеточный геном Данный путь взаимодействия между вирусом и клеткой хозяина неодинаков для ДНК- и РНК-содержащих вирусов. В первом случае вирусная ДНК в кольцевой форме интегрирует в клеточный геном. При этом место интеграции определяется гомологичными нуклеотидными последовательностями, имеющимися в определенных участках — ДНК сайтах при участии ряда ферментов рестриктаз, эндонуклеаз, лигаз. Вирус, интегрированный в клеточный геном, называют провирусом Провирус может реплицироваться в составе клеточного генома пропорционально делению клетки. При этом каждая дочерняя клетка получает копию провирусного генома. В другом случае амплификация провирусной ДНК с увеличением числа копий провируса без его выщепления из клеточного генома может привести к встраиванию провируса в другую хромосому. Выщепление провируса из клеточного генома и его проникновение в новую клетку может вызвать продуктивную инфекцию. В случае РНК-содержащих вирусов включение РНК в клеточный геном происходит путем обратной транскрипции (см. рис. 5.7). Механизм обратной транскрипции состоит в первоначальном образовании ДНК-транскрипта на матрице РНК при обязательном участии обратной транскриптазы. Этот транскрипт представляет собой одну нить ДНК, являющуюся матрицей для образования второй нити. Затем образовавшийся двунитевой ДНК-транскрипт замыкается в кольцо и встраивается в клеточный геном. Данный процесс объединения вирусной нуклеиновой кислоты с хромосомой клетки хозяина называется в и роге ни ей. В интегрированном состоянии вирусная ДНК может транскрибироваться в составе клеточного генома при участии клеточных РНК-полимераз. Биологический смысл интегративного типа взаимодействия между вирусом и клеткой хозяина можно видеть прежде всего в сохранении вирусной информации в составе клеточного генома и ее передаче потомству. Вместе стем это в определенной степени отражается и на эволюции некоторых вирусов (например, бактериофагов, которые при выщеплении из состава клеточной хромосомы могут захватывать отдельные ее гены см. 6.8.2). С другой стороны, подобный тип взаимодействия может отразиться на судьбе клеток хозяина в зависимости от расположения локуса, в котором происходит интеграция вирусного генома, вплоть до расстройства регуляции синтеза белка и неконтролируемого деления клетки см. 10.3). Это может привести к онкогенной трансформации клеток хозяина и развитию разнообразных опухолей. Дефектные вирусы Дефектные вирусы — вирусы, утратившие в процессе репродукции часть своего генома. Их делят на 4 группы дефектные интерферирующие частицы, интегрированные геномы, вирусы-спутни ки и псевдовирионы. Дефектные интерферирующие частицы представляют собой ви рионы, содержащие только часть генетической информации исходного вируса. Они репродуцируются только при участии родственного им вируса-помощника. Вирусы-спутники отличаются от предыдущих тем, что для своей репродукции требуют участия любого вируса-помощника, необязательно родственного исходному вирусу. Например, вирус гепатита D дельта) репродуцируется только в присутствии вируса гепатита В. Интегрированные геномы представляют собой провирусы, те. вирусные геномы, встроенные (интегрированные) в хромосому клетки хозяина при интегрированной инфекции, которые потеряли способность превращаться в полноценный вирус. Псевдовирионы. Вирионы, имеющие нормальный капсид, содержащий часть собственной нуклеиновой кислоты и фрагменты нуклеиновой кислоты своего хозяина, либо часть хромосомы клетки хозяина и часть нуклеиновой кислоты другого вируса. Значение дефектных вирусов состоит в их способности переносить генетический материал из клетки донора в клетку реципиента. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ На первом этапе развития вирусологии единственным методом, доказывающим наличие фильтрующихся инфекционных агентов в исследуемом материале, служило заражение лабораторных животных. В 1931 г. в вирусологической практике стали использоваться куриные эмбрионы для репродукции вирусов с диагностическими целями, а также для производства вирусных вакцин. Позднее были разработаны культуры клеток, приготовленные из неперевиваемых, перевиваемых и полуперевиваемых линий нормальных или злокачественных клеток людей и животных. Они нашли широкое применение для диагностических, научных и производственных целей. Неперевиваемые— первичные клетки неспособны размножаться ш vitro, вследствие чего они годятся только для однократного исполь- ювания. Полуперевиваемые культуры представляют собой диплоидные клетки человека, способные к размножению in vitro в течение 50 пассажей (до 1 года. Они, как правило, не претерпевают злокачественного перерождения. Перевиваемые культуры фшокачественных или нормальных клеток длительно размножаются in vitro. Они могут сохраняться в течение длительных сроков (десятилетиями, например культура клеток llela и др. Недостаток клеточных культур состоит в возможности их контаминации неизвестными вирусами и микоплазмами. О репродукции вирусов в культурах клеток судят по их ц и топ этическому действию (ЦПД), которое носит разный характер в зависимости от вида вируса (рис. 5.10), по бляшкообра- юванию на клеточном монослое, покрытом тонким агаровым слоем рис. 5.11), гемадсорбции эритроцитов и другим тестам. а Рис. 5.10. Цитопатическое действие аденовируса в культуре клеток а — незараженная культура б — зараженная культура Рис. 5.11. Бляшки вируса полиомиелита в культуре клеток почки обезьяны Таким образом, индикация вирусов производится микроскопически по наличию ЦПД, бляшкообразованию на клеточном монослое, ге- мадсорбции эритроцитов, добавленных к клеточной культуре вируса, а также в реакции гемагглютинации с исследуемым вируссодержащим материалом. Реакцию гемагглютинации вызывают вирусы, содержащие в составе своего капсида или суперкапсида гемагглютинин. 5.4. ВИРУСЫ БАКТЕРИЙ (БАКТЕРИОФАГИ, ИЛИ ФАГИ) В 1917 г. французский микробиолог Д ’Эррель, изучая возбудителя дизентерии, наблюдал лизис бактериальной культуры привнесении в нее фильтрата испражнений больных людей. Лизирующее начало сохранялось при многократном пассирова нии культуры дизентерийных бактерий и даже становилось более активным. Агент, растворяющий бактерии, автор называл бактериофагом (пожиратель бактерий от лат. |