Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
rough — неровный) — характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип колоний (англ. sm ooth— гладкий имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, те. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает водном направлении от S- к форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний. Обратный переход R- в S- форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии її некоторые другие, которые растут в R-форме. В процессе диссоциации одновременно с изменением морфоло- | ии колоний меняются биохимические, антигенные см. главу 13), патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическими химическим факторам внешней среды Мутации, которые приводят к S -R -диссоциации, относятся к ин- сертационным, поскольку они возникают после встраивания внехро- мосомных факторов наследственности, в том числе и умеренных фагов в бактериальную хромосому. Если эта мутация приводит к утрате генов, контролирующих образование детерминантных полисаха ридных звеньев ЛПС у грамотрицательных бактерий, то образуются мутанты. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S -R -диссоциация связана сих лизогенизацией соответствующими бактериофагами. При этом формы образуют токсин. У других бактерий формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или последовательностей. формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций. Биологическое значение S -R -диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются вводе, молоке. Вместе стем -диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например дизентерии Зонне, эшерихиоза, вызванного Е. coli 0124 и др. МУТАГЕНЫ К мутагенам относят химические вещества или физические факторы (УФ-лучи, радиация, вызывающие предмутационные повреждения в отдельном фрагменте или фрагментах ДНК, которые переходят в мутацию в результате ошибок в работе репарирующих ферментов см 6.6) или в процессе репарации. По механизму действия на ДНК микробных клеток мутагены отличаются друг от друга. Действие одних приводит к изменениям первичной структуры ДНК, путем замены пар оснований (АТ на ГЦ или наоборот. Так, аналог тимина — 5-бромурацил, отличающийся от него лишь наличием атома Вг на месте СН3-группы, спаривается нес аденином, как тимина с гуанином. При воздействии азотистой кислоты, вызывающей дезаминирование азотистых оснований, цитозин превращается в урацила аденин в гипоксантин. Поскольку в последующем урацил спаривается с аденином, а нес гуанином, как цитозин, происходит замена ГЦ на АТ. Другие мутагены, например акридиновые красители, непосредственно комплексируются с ДНК, вызывая выпадения или вставки оснований Третьи мутагены — нитрозосоединения (нитрозогуанин, нитрозо- мочевина и др) — обладают множественным эффектом, вызывая при пом высокую частоту мутаций, за что получили название супермута- ICHOB. Из физических факторов для индукции мутаций у микроорганизмов чаще всего используют УФ-облучение, которое приводит к образо- нннию тиминовых димеров в ДНК, те. весьма прочных связей между соседними тиминами водной и той же цепи, которые препятствуют работе ДНК-полимеразы, нарушая тем самым процесс репликаци ДНК. Мутагены не обладают специфическим действием, так как они могут вызвать изменение в любом гене, содержащемся в геноме микробной клетки. К мутагенам, увеличивающим естественный фон му- I аций в разных биотопах организма человека, можно отнести некоторые продукты микробного метаболизма (перекиси и др.). Некоторые химиотерапевтические препараты, например производные нитрофуранового ряда, также обладают мутагенным действием. Антибиотики сами по себе не являются мутагенными. Однако при иоздействии на метаболизм нуклеиновых кислот бактерий некоторые ич них могут вызывать предмутационные повреждения. РЕПАРАЦИИ Клеточный геном (ДНК) не является пассивной мишенью, подвергаемой действию мутагенных факторов. В исследованиях с бактериями было установлено, что они обладают специальными системами, восстанавливающими повреждения генетического материала. Эти системы получили название репарационных асам процесс восстанов- иения клеточного генома (ДНК) — репараций Способность бактериальных клеток к репарациям обусловливает относительную стабильность их ДНК. Репарация поврежденной ДНК осуществляется ферментами, образование которых контролируется специальными генами. Функции многочисленных репаративных ферментов заключаются в установлении места повреждения ДНК, его вырезании, синтезе поврежденных фрагментов на матрице сохранившейся нити ДНК, ее встраи- нании в молекулу репарируемой нити ДНК (рис. 6.2, 6.3, Одна из систем, восстанавливающая повреждения ДНК, вызванные УФ-лучами, названа системой фото реактива ц и и . Ферменты, обеспечивающие фотореактивацию, действуют в присутствии нидимого света и осуществляют расщепление тиминовых димеров, превращающей их в мономерные формы. Активность другой системы, иыполняющей эти же функции, обеспечивается ферментами действующими в отсутствии видимого света. Она названа системой гем новой репарации, которую условно подразделяют на дорепликативную и пострепликативную. кона лама я та р к ы ан у кл е от н дн ы а пары у кл і д і в д і р в - ф ос ф в г і у кл во і к д и о і о - ф ос ф в і с і вводный д и ф ос ф в т Рис. 6.3. Репарация ДНК-1 Отбор нуклеотидов осуществляется ДНК-полимеразой, ведущей синтез ДНК в 2 стадии 1 — расщепление нуклеотидтрифосфата до монофосфата; 2 — присоединение монофосфата к растущей нуклеотидной цепи. Если полимераза связала некомплементарный нуклеотид, он может быть отвергнут до образования ковалентных связей. Этот процесс называют редакторской правкой». и Рис. 6.2. Репликационная вилка. Репликационная вилка цепи ДНК похожа на застежку разъединенной молнии. Молекулы ДНК-полимеразы, присоединенные к двум родительским цепям ДНК, работают в противоположных направлениях, синтезируя на каждой из них дочерние нити. На одной цепи ДНК фермент сдвигается к репликационной вилке, на другой новые молекулы полимеразы должны связываться вблизи вилки, чтобы синтезировать вторую нить ДНК между точкой раздвоения и участком связывания предыдущей молекулы фермента. Рис. 6.4. Репарация ДНК-2. «Редакторская правка осуществляется ферментом экзонуклеазой, ассоциированной с ДНК-полимеразой. Экзонуклеаза удаляет нуклеотиды, только что ошибочно присоединенные к синтезируемой ДНК. При образовании некомпле ментарной ошибочной пары замедляется включение следующего нуклеотида, и у экзонуклеазы появляется время для исправления ошибки, после чего полимераза делает новую попытку присоединить к цепи ДНК комплементарный нуклеотид Процесс дорепликативной репарации схематически представляется следующим образом) обнаружение и надрезание поврежденного фрагмента ДНК >ндонуклеазой; 2) удаление вырезанного фрагмента ДНК-полимеразой I; 3) синтез нуклеотидов по матрице второй сохранившейся нити либо ДНК-полимеразой I, либо ДНК-полимеразой III; 4) сшивание восстановительного фрагмента ДНК с основной нитью, осуществляемое лигазой. Мутанты, утратившие способность к темновой репарации, обладают резко повышенной чувствительностью не только к летальному, но и к мутагенному действию УФ-лучей. Они репарируются системой пострепликативной репарации путем рекомбинаций. При этом дефекты ДНК застраиваются фрагментами неповрежденных нуклеотидов. Повреждения ДНК, вызванные химическими мутагенами, также репарируются ферментами бактериальной клетки. SOS-репарация является индуцибельным процессом, который происходит при множественных изменениях в ДНК. В данном процессе участвует около 20 новых белков. репарация имеет несколько систем активации. Низкая и средняя системы активации происходят быстро. Однако в этих случаях происходят ошибки. При высокой степени активации наолюдается разрушение хромосомы, амплификация плазмид и переход интегративной фаговой инфекции в продук- | ивную. В этом случае происходит гибель клетки, но осуществляется спасение маркеров для бактериальной популяции в целом. Репарирующие системы присущи клеткам млекопитающих и че- повека. Они способны восстанавливать повреждения клеточного генома, вызванного радиацией. Дефекты этих систем являются причиной ряда заболеваний человека. Так, например, наследственное заболевание человека с летальным исходом Xeroderma pigmentosum связано с отсутствием системы, восстанавливающей повреждение ДНК, вызванное УФ-лучами. В результате этого при УФ-облучении у і аких людей возникает рак кожи. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РЕКОМБИНАЦИИ Микроорганизмам, как и клеткам высших организмов свой- I гвенны генетические рекомбинации, которые имеют свои особенности. Они определяются прежде всего способом размножения и закономерностями передачи генетического материала. Известно, что генетические рекомбинации у клеток эукариот совершаются входе процессов, сопровождающих половое размножение путем реципрокного (взаимного) обмена фрагментами хромосом. При таком обмене генетическим материалом из двух рекомбинирующих родительских хромосом образуются две рекомбинантные хромосомы. Применительно к данным клеткам это означает, что в результате рекомбинаций возникают две рекомбинантные особи. Прокариотам несвойственно половое размножение. Рекомбинация у них происходит в результате внутригеномных перестроек, заключающихся в изменении локализации генов в пределах хромосомы, или при проникновении в клетку реципиента части ДНК донора. Последнее приводит к формированию неполной зиготы — мерозиго- ты. В результате рекомбинаций в мерозиготе образуется только один рекомбинат, генотип которого представлен в основном генотипом реципиента с включенным в него фрагментом ДНК донора. Вследствие этого реципрокность генетических рекомбинаций у бактерий не может быть выявлена. Рекомбинации подразделяют наз а конные и незаконные. Законная рекомбинация требует наличия протяженных, комплементарных участков ДНК в рекомбинируемых молекулах. Она происходит только между близкородственными видами микроорганизмов. Незаконная рекомбинация не требует наличия протяженных комплементарных участков ДНК. Впервые она была описана Л.Б. Бори совым в 1965 г. между неродственными коли-фагами, лизирующими энтеропатогенные эшерихии серогрупп 0ІІІ и 026. Незаконная рекомбинация происходит при участии элементов, которые имеют липкие концы, обеспечивающие их быстрое встраивание в бактериальную хромосому. Существенное практическое значение имеют запрограммированные внутригеномные рекомбинации, при которых происходит только изменение локализации имеющихся генов. Они играют важную роль в изменении антигенной структуры микроорганизмов и тем самым эффективно противостоят факторам иммунной защиты. Это относится к боррелиям, трипаносомам, малярийному плазмодию и другим микробам. Для бактерий предложены специальные методы генетического анализа, позволяющие установить относительное расположение генов на хромосоме и их тонкую структуру. Однако в некоторых случаях, когда анализу могут подвергнуться оба рекомбинирующих генома, реципрокность генетического обмена характерна и для бактерий, например при рекомбинациях между плазмидной и хромосомной ДНК. Генетические рекомбинации происходят при участии ряда ферментов в пределах отдельных генов или групп сцеплений генов. Существуют специальные геогены, детермирующие рекомбинационную способность бактерий. Передача генетического материала (хромосомных генов) от одних бактерий к другим происходит путем трансформации, трансдукции и конъюгации, а плазмидных генов — путем трансдукции и конъюгации. Трансформация Трансформация — непосредственная передача генетического материала (фрагмента ДНК) донора реципиентной клетке. Впервые воспроизведена Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с авирулент- ным бескапсульным штаммом пневмококка, который приобрел вирулентные свойства при одновременном введении в брюшную полость белых мышей с убитыми капсульными вариантами этих же бактерий. В дальнейшем было показано, что вирулентные свойства передаются in vitro при обработке авирулентных бескапсульных пневмококков экстрактом убитых капсульных пневмококков. В 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леод и К. Мак-Карти установили, что активным началом, содержащимся в экстракте убитых пневмококков, является ДНК, которая определяет его генетические свойства и является носителем генетической информации. Феномен трансформации воспроизводится в опытах с разными патогенными и непатогенными бактериями стрептококками, менингококками и др. С донорной ДНК в реципиентную клетку обычно передается только один ген. Это связано с протяженностью трансформирующего фрагмента ДНК, который может проникнуть в реци пиентную клетку. Обычно он не превышает ‘/ 100 длины бактериальной хромосомы, те. включает один или несколько сцепленных генов. Эффективно трансформация происходит в опытах с бактериями одного итого же вида, имеющих разный генотип. Так, например, в опытах трансформации можно заместить гены дикого на мутиро- навшие или произвести замену обратного порядка. Трансформирующему воздействию ДНК поддаются не все, а только часть клеток бактериальной популяции. Клетки, способные воспринимать донорную ДНК, называются компетентными. Состояние компетентности непродолжительно. Оно возникает в определенный период роста бактериальной культуры, чаще всего совпадающий с концом югарифмической фазы. В состоянии компетентности клеточная стенка бактерий становится проницаемой для высокополимерных фрагменте ДНК. По-видимому, это связано стем, что трансформируемый фрагмент ДНК связывается с белком, образуя трансформасому, в которой он переносится в бактериальную клетку. Вместе стем в транс- формосоме он защищен от клеточных нуклеаз. Трансформирующей активностью обладают двунитевые фрагмен- п ДНК с молекулярной массой не менее 0,5-1 ■ 106. Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз) адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте; 2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента; 3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией. После проникновения внутрь клетки трансформирующая ДНК деспирализуется. Затем происходит физическое включение любой из двух нитей ДНК донора в геном реципиента. Эффективность спаривания трансформирующей ДНК с соответствующим участком хромосомы реципиента зависит от степени гомо логичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, что определяет конечный результат трансформации, те. количество формирующихся рекомбинантов (трансформантов). Отсюда ясно, почему межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая. Трансдукция Передача генетического материала от одних бактерий другим с помощью фагов называется трансдукцией. Этот вид генетического обмена открыт Н. Циндером и Дж. Ледер- бергом в 1951 г. Различают три типа трансдукции: неспецифическую или общую, специфическую и абортивную. Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора, как это показано на рис. 6.5. При этом фаг может утратить часть своего генома и стать дефектным. Такие дефектные трансдуцирующие фаги составляют примерно 0,3% всего потомства. При неспецифи ческой трансдукции в клетки реципиентного штамма вместе с фаго вой ДНК могут быть перенесены любые гены донора, например гены, контролирующие способность синтезировать аминокислоты, пурины, пиримидины, гены резистентности к антибиотикам или др. Принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора способен включаться в гомологическую область ДНК клетки-реципиента путем рекомбинации. Таким образом, при неспецифической трансдук ции трансдуцирующие фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим, поскольку сама фаго вая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов (трансдуктантов). Специфическая трансдукция характеризуется способностью фага переносить определенные гены от бактерии-донора к бактерии- реципиенту. Это связано стем, что образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-до нора рядом с профагом. Например, трансдуцирующий фаг лямбда (Я) переносит ген gal, контролирующий ферментацию галактозы, или гену Рис. 6.5. Схема образования трансдуцирующего фага Р, несущего ген th r (синтез триптофана. Последующая передача этого гена ауксотрофному хозяину приводит к формированию прототрофных рекомбинантов hio, ответственный за синтез биотина. При выщеплении бактериальных генов вместе с ДНК профага из состава хромосомы часть фаго- иых генов утрачивается, в результате чего формируется дефектный фаг d, несущий ген gal клетки-донора. Он обозначается є dgal. В том случае, когда он несет ген bio, его обозначают є При взаимодействии трансдуцирующих фагов с клетками реци- пиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента. Бактерии, лизогенированные дефектным фагом, невосприимчивы, как инее лизогенные клетки, к последующему заражению гомологичным нирулентным фагом. Абортивная трансдукция. При абортивной трансдукции принесенный фагом фрагмент ДНК бактерии-донора не включается в хромосому бактерии-реципиента, а располагается в ее цитоплазме и может н таком виде функционировать. Вовремя деления бактериальной клетки трансдуцированный фрагмент ДНК-донора может передаваться только одной из двух дочерних клеток, те. наследоваться одноли нейно ив конечном итоге утрачиваться в потомстве 6.8.3. Конъюгация |