Методика. Методика ИФА принцип. Метод иммуноферментного анализа (ифа) основывается на двух принципиальных научных открытиях
 Скачать 102.5 Kb.
|
|
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) основывается на двух принципиальных научных открытиях. Первое заключается в способности энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свою функциональную активность, т.е. расщеплять субстрат (ферменты) и связывать антигены/антитела; второе базируется на создании комплекса антитело-фермент (Аb-F) в виде конъюгата, сохраняющего свою биологическую активность в растворе. Аb-F-конъюгаты характеризуются высочайшей специфичностью и чувствительностью, достигающей 97-99%. Существует несколько модификаций ИФА: 1. ELISA (enzyme linked immunoadsorbent assay) - метод определения с помощью иммуносорбентов, связанных с ферментами; 2. EIA (enzyme immunoassay) - метод на основе фермент-иммуноопределения; 3. EMIT (enzyme multiplied immunoassay technique) - способ, основанный на связи с ферментами. Первые две модификации (ELISA и EIA) - это методы гетерогенного или твердофазного анализа (тИФА), а третья разновидность (EMIT) является гомогенным ИФА. Метод ИФА незамедлительно нашел свое самое широкое применение в области иммуногистохимии, иммунологии, медицины и ветеринарии. В настоящее время метод тИФА используется для определения широкого класса веществ: гормонов, онкомаркеров, лекарственных препаратов в крови больного (так называемый, мониторинг лекарственных препаратов), наркотиков, бактерий, вирусов и антител против них. Методами ИФА возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность), а также идентификация лимфоцитов (субпопуляций). В настоящее время практическому здравоохранению стал доступен тИФА благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности, что привело к тому, что данный метод лабораторного исследования перешёл в разряд стандартных, «рутинных» анализов. Казалось бы, врач получил в свои руки надежный и точный инструмент для безошибочной диагностики и точной оценки эффективности терапии, другими словами – возможность объективизации лечебно-диагностического процесса. Однако, к сожалению, тривиальность толкования (интерпретации) результатов лабораторных исследований не всегда возможна. Цель данного пособия представить опыт практического использования и правильной интерпретации результатов, полученных методом тИФА. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА тИФА Определение антител Рассмотрим принцип определения специфических Ab методом тИФА, суть которого не зависит от биологического субстрата организма, в котором проводят анализ [ 1 ]. На рис. 1а показана общая схема метода, состоящего из трех стадий, соединенных на рисунке знаком плюс. Во время каждой стадии в систему добавляется очередной компонент, инкубируется некоторое время, необходимое для образования иммунного комплекса. Затем ячейка промывается для удаления не связавшихся компонентов. После этого переходят к следующей стадии реакции, которая обозначена следующим знаком плюс на схеме. Рассмотрим подробнее процесс образования иммунного комплекса, который представлен на рис. 1а. На твердой поверхности пластиковой лунки, изображенной на рисунке слева, сорбирован Ag любого инфекционного агента (фрагмент вируса, бактерии, простейшего и т.п.). В эту лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся Ab к инфекционному агенту (на рисунке обведены), то они закрепляются на соответствующих Ag и остаются связанными при промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная — "специфическая" стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса. На второй стадии анализа в лунку вносят Ab с заранее прикрепленным к ним ферментом, способные связаться с Ab человека, закрепившимися на инфекционном агенте. Это так называемый конъюгат. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то возникает “молекулярная цепочка”, на конце которой находится фермент. На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества — хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом То есть, если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс (рис. 16). Если на первой стадии анализа иммунных комплексов не образовалось (рис. 1в), то отсутствует и вся последующая часть “молекулярной цепочки”, вследствие чего хромоген не окрашивает раствор. В нашем случае ключевым элементом является специфическое Ab из сыворотки крови больного к инфекционному агенту. По сути, мы анализируем способность некоторых из Ab в исследуемом материале, связаться с интересующим нас Ag. Рис.1. Определение Ab методом твердофазного иммуноферментного анализа    Хотелось бы особо подчеркнуть, что положительный результат теста показывает только наличие в исследуемом образце (обычно сыворотке крови больного) Ab, способных связываться с поверхностными Ag, сорбированными на твердой фазе. Результат анализа может существенно зависеть от свойств самой тест-системы и от особенностей иммунного ответа больного. Тест-системы на основе моноклональных-Ab позволяют достигать более высокой чувствительности и избирательности. Однако чрезмерно узкая избирательность может приводить к ложноотрицательным результатам при некоторых особенностях иммунного ответа организма больного. Многое зависит от того, какого рода Ag используется для сорбции на твердой фазе. Важна и степень очистки, и количество различных Ag, доступных для ё образования иммунных комплексов, и многое другое. Разумеется, все сказанное относится к полностью пригодным для использования тест-системам и безошибочному проведению процесса анализа ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ Для обнаружения самих инфекционных агентов, а точнее — их Ag, применяется другая модификация метода тИФА, которая представлена на рис. 2а. В этом случае на поверхности планшета (твердой фазе) сорбируются Ab к искомому агенту. Образующаяся в ходе анализа цепочка выглядит так: Ab, инфекционный агент, а далее, как и в предыдущем случае, следует комплекс Ab-F. То есть, если в исследуемом образце присутствует искомый Ag, то образуется иммунный комплекс. В ячейке присутствует фермент, который способен расщеплять хромоген с образованием окрашен-ного продукта (рис. 26). Это возможно только при наличии полной цепочки. Если в исследуемом образце искомый Ag (обведен на рис. 2а) отсутствует, то цепочка не образуется, и окрашивания не происходит (рис. 2в). Рис.2. Определение Ag методом твердофазного иммуноферментного анализа    Ключевым элементом, от которого зависит, сформируется цепочка или нет, является искомый агент, точнее, его Ag, способные связываться с соответствующими Ab диагностической тест-системы. Так же, как и в предыдущем случае, не следует забывать, что мы определяем только наличие Ag, которые могут быть связаны в такой системе. Например, целую (не разрушенную) бактерию, Ag которой мы ищем, нельзя обнаружить в подобном тесте. Она слишком велика для того, чтобы ее можно было удержать в подобной молекулярной системе. Все особенности, о которых говорилось применительно к предыдущему варианту анализа, сохраняют свою актуальность и в этом случае. Кроме того, имеются дополнительные особенности, обусловленные необходимостью связывания диагностических Ab c различными поверхностными Ag исследуемого объекта. Все эти особенности необходимо учитывать при анализе результатов, получаемых с помощью ИФА. Только понимание того, что именно на самом деле определяет тест, позволяет правильно трактовать результат. Кроме того, необходимо учитывать динамику изменений этих показателей. Они, в общем, адекватноотражают течение инфекционного процесса, но не всегда синхронны с ним и не во всех деталях совпадают. |