Методы антропогенетики
 Скачать 1.9 Mb.
|
|
: дактилоскопия – изучение узоров на подушечках пальцев; пальмоскопия – изучение рисунка на ладонях; плантоскопия – изучение дерматоглифики подошвенной поверхности стопы. Гребни на коже пальцев рук соответствуют сосочкам дермы, поэтому их называют папиллярными линиями, рельеф этих выступов повторяет пласт эпи- дермиса. Межсосочковые углубления образуют бороздки. Закладка узоров про- исходит между 10 и 19 неделями внутриутробного развития. У 20 недельных плодов уже хорошо различимы формы узоров. Формирование папиллярного рельефа зависит от характера ветвления нервных волокон. Полное формирова- ние деталей строения тактильных узоров отмечается к шести месяцам, после чего они остаются неизменными до конца жизни. 44 Папиллярные линии подушечек пальцев могут иметь вид дуги, петли, за- витка (рис. 23). Дуга Петля Завиток Рис. 23. Разновидности пальцевых узоров: дуга, петля, завиток. Дактилоскопические исследования имеют важное значение в диагностике некоторых наследственных заболеваний, в судебной медицине, в криминали- стике для идентификации личности. Пальмоскопия В настоящее время определена наследственная обусловленность кожных узоров. Это доказано многими генетическими исследованиями, в частности, на монозиготных близнецах. Обширные исследования по изучению особенностей дерматоглифики проведены у нас в стране Т.Д. Гладковой (1996 г.), а по наследственной обу- словленности кожных узоров – И.С. Гусевой (1970 г.). На основании этих работ был сделан вывод, что количественные показатели гребневого рельефа кожи программируются полигенно. Гены гребней кожи проявляют свой морфогене- тический эффект, влияя на степень ветвления нервного волокна, и фенотипиче- ски определяют гребневую плотность. На характер пальцевого и ладонного узоров также оказывает влияние ма- теринский организм через механизм цитоплазматической наследственности. На формирование дерматоглифических узоров могут оказывать влияние некоторые повреждающие факторы на ранних стадиях эмбрионального развития. Дерматоглифические исследования используются при идентификации зи- готности близнецов. Сходство узоров менее чем на 7 пальцах из 10 - свидетель- ствует в пользу дизиготности близнецов, если более, то это указывает на моно- зиготность. 45 В качестве обобщенного показателя потенциальных возможностей чело- века спортсмены используют так называемый дельтовый индекс, зависящий от сложности пальцевых узоров. Наиболее простой рисунок – дуга оценивается в 0 баллов, петля – 1 балл, завиток – 2 балла. Максимальный показатель (исходя из суммы 10 пальцев) – 20 баллов. Низкий дельтовый индекс (до 10) характеризу- ет скоростно-силовые качества (рекомендуется заниматься легкой атлетикой). Средний (от 10 до 13) – показатель выносливости (рекомендуется лыжный спорт). Высокий (выше 13) – показывает на способности к сложной координи- рованной деятельности (занятия боксом). Ладонный рельеф очень сложный, в нем выделяют ряд полей, подушечек и ладонных линий. У правшей более сложные узоры встречаются на правой ру- ке, у левшей – на левой. Установлено, что у людей с синдромом Дауна наблюдаются специфиче- ские изменения не только рисунков пальцев и ладоней, но и ладонного угла, характера основных сгибательных борозд на коже ладоней (рис. 24). Рис. 24. Поперечная складка ладони и стопы у больного синдромом Дауна. Наблюдаются дерматоглифические особенности и при других хромосом- ных мутациях. Например, при синдроме Эдвардса часто обнаруживаются дуги на всех пальцах. При синдроме Шершевского-Тернера – завитки на всех паль- цах. Описаны специфические дерматоглифические отклонения при шизофре- нии, миастении, лимфоидной лейкемии. Самостоятельная работа Задание. Подсчитайте дельтовый индекс у себя и сделайте заключение. 46 БИОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД Биохимический метод применяется в основном при дифференциальной диагностики наследственных нарушений обмена веществ. Биохимический метод позволяет обнаружить нарушения в обмене ве- ществ, вызванные изменением генов и, как следствие, изменением активности различных ферментов. Наследственные болезни обмена веществ подразделяют- ся на болезни углеводного обмена (сахарный диабет), обмена аминокислот (фе- нилкетонурия), липидов, минералов и др. Многие наследственные заболевания, связанные с нарушениями обмена веществ, диагностируются с помощью биохимических методов. Они позволяют выявить либо аномальные белки-ферменты, либо промежуточные продукты обмена, свидетельствующие о наличии болезни. Сегодня установлено более 1 тыс. заболеваний и нарушений обмена веществ у человека, имеющих наслед- ственную природу. Все биохимические методы делят на качественные, количественные и по- луколичественные. Для исследования берутся кровь, моча или амниотическая жидкость. Качественные реакции позволяют обнаружить избыточные концен- трации субстратов блокированной ферментной реакции или их производных. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, отличаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов, а информация, полученная с их помощью, позволяет с высокой долей вероятности заподозрить патологию у пациента. Качественные методы менее трудоемкие, поэтому при- меняются для массового скрининга (например, исследование новорожденных в роддоме на фенилкетонурию). Все многообразие качественных биохимических методов делится на две группы: а) методы, основанные на выявлении определенных биохимических про- дуктов, обусловленных действием разных аллелей. Легче всего выявлять алле- ли по изменению активности ферментов или по изменению какого-либо биохи- мического признака; б) методы, основанные на непосредственном выявлении измененных нук- леиновых кислот и белков с помощью гель-электрофореза в сочетании с други- ми методиками (блот-гибридизации, авторадиографии). 47 Однако на результаты этих тестов влияет применение ряда лекарствен- ных препаратов и их метаболитов, а также некоторых пищевых добавок. Каче- ственные пробы бывают: универсальными (тест для мукополисахаридов) и спе- цифическими (для определения цистин-гомоцистина, метилмалоновой кислоты и др.). Наиболее распространены качественные тесты с мочой, вследствие до- ступности и простоты получения материала для исследования. Универсальность этих методов позволяет их использовать для дифферен- циальной диагностики с другой моногенной патологией, при которой измене- ние биохимических показателей является вторичным. Например, при прогрес- сирующей мышечной дистрофии Дюшенна-Бекера у носительниц этого гена повышен уровень креатин-фосфокиназы в крови. То же наблюдается у больных при некоторых других заболеваниях в развернутой стадии. Для диагностики ряда состояний используют комбинированные биохи- мические методы. Иммуно-гистохимический метод используется для выявле- ния белковой субстанции в какой-либо ткани при помощи специфичных анти- тел (именно так проводят дифференциальную диагностику прогрессирующих мышечных дистрофий и прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна- Бекера). Иммуногенетическое тестирование позволяет поставить или уточнить диагноз при врожденных иммунодефицитных состояниях, при подозрении на антигенную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп крови. Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочой (тест с цианид-нитропруссидом – при гомоцистинурии, ЦПХ-тест - при муко- полисахаридозах), так и с кровью (газы крови, глюкоза, ионы аммония, молоч- ная кислота, кетоновые тела и др.) и могут иметь различную степень сложно- сти. Наиболее простые из них, такие как измерение концентрации лактата, или кетоновых тел, или определение кислотно-щелочного равновесия, позволяют планировать дальнейшую тактику диагностики. Так метаболический ацидоз служит показанием для проведения газовой хроматографии. Определение кон- центрации кетоновых тел в крови является первым этапом для дифференциаль- ной диагностики митохондриальных болезней. В диагностике нарушений обмена веществ применяют сложные и высо- коточные количественные методы, такие как флуориметрические, спектрофо- тометрия, различные виды хроматографии. 48 Использование количественных биохимических методов позволяет вы- явить гетерозиготных носителей заболеваний. Например, фенилкетонурия (ФКУ) относится к болезням аминокислотного обмена. При ФКУ блокируется превращение незаменимой аминокислоты фенилаланин в тирозин, при этом фенилаланин превращается в фенилпировиноградную кислоту, которая выво- дится с мочой. Определение количества фенилпировиноградной кислоты в мо- че позволит выявить генотип и диагностировать заболевание. С каждым годом совершенствуются биохимические методы и становятся все более сложными, многоступенчатыми, а следовательно, дорогими. Исполь- зовать их для массового скрининга наследственных болезней, многие из кото- рых встречаются в популяциях человека со сравнительно низкой частотой, не- выгодно. 49 МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ Биологическое моделирование наследственных болезней представляет собой большой раздел экспериментальной биологии и генетики. Теоретическую основу биологического моделирования в генетике дает закон гомологических рядов наследственной изменчивости, открытый Н.И. Вавиловым. Согласно за- кону «генетически близкие виды и роды характеризуются сходными рядами наследственной изменчивости». Исходя из этого положения, можно предви- деть, что у некоторых животных, можно обнаружить мутации, вызывающие та- кие же изменения фенотипических признаков, как и у человека. Для моделирования определенных наследственных аномалий человека подбирают и изучают мутантные линии животных, имеющих сходные наруше- ния. Были описаны и изучены многие генные мутации у животных, имеющих сходство с соответствующими наследственными аномалиями человека. Напри- мер, гемофилия А и В встречается у крыс, и обусловлена как и у человека, ре- цессивными генами, локализованными в Х-половой хромосоме. У собак обна- ружены патологические мутации, проявляющиеся как гемофилия, сахарный диабет, ахондроплазия, мышечная дистрофия. Эпилептические припадки встречаются у крыс под воздействием сильного звукового раздражителя. Используется метод и для создания моделей наследственных болезней человека с помощью трансгенных животных. Мутантные линии животных путем возвратного скрещивания привели к генетическому сходству, в результате получили линии, различающиеся только по аллелям одного гена. Это дало возможность уточнить механизм развития многих наследственных аномалий. Мутантные линии животных не являются точным воспроизведением наследственных болезней человека. Однако, даже частичное моделирование, то есть воспроизведение не всего заболевания в це- лом, а только патологического процесса или даже его фрагмента, позволяет в ряде случаев обнаружить механизмы первичного отклонения от нормы у чело- века. 50 ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД Иммуногенетический метод включает использование серологических проб (ИФА, РНГА), иммуноэлектрофореза (ИЭФ), которые используют для изучения групп крови, белков и ферментов сыворотки крови и тканей. С его помощью можно установить иммунологическую несовместимость индивидуу- мов, выявить иммунодефицитные состояния, зиготность близнецов. Важным разделом иммуногенетики является генетика групп крови. В настоящее время известно более 200 основных систем групп крови. Из них наиболее изучены системы АВ0 и резус-фактор. Система крови «резус-фактор» В генотипе человека есть три гена (C, D, E), определяющих образование в организме особого белка, называемого резус-фактором. Наиболее иммуноген- ным является ген, обозначаемый D (d). Человек, гомозиготный DD или гетерозиготный Dd по данному гену, яв- ляется резус-положительным Rh+, т.е. имеет этот белок в эритроцитах крови. А в случае гомозиготности по рецессивному аллелю dd (rh-) резус-фактор в крови отсутствует. И если он попадает в кровь такого человека (при переливании кро- ви), в его организме развивается защитная реакция – как на любой чужеродный белок, и образуются специфические антитела. В браках резус-отрицательных женщин с резус-положительными гомози- готными мужчинами, вследствие доминирования резус-положительности, плод является резус-положительным и в крови появляется резус-фактор. Против ре- зус-фактора в организме матери вырабатываются антитела, разрушающие кро- ветворную систему плода. В результате резус-конфликта страдает как организм матери, так и организм плода. У ребенка развивается гемолитическая желтуха новорожденных. В браке резус-отрицательной женщины с резус-положительным мужчи- ной, гетерозиготным по этому признаку плод может оказаться резус- отрицательным и резус-положительным. В случае если плод окажется резус- отрицательным, тогда конфликт с организмом матери не возникает. Помимо вероятности возникновения самой ситуации резус-конфликта, определяемой исключительно генотипами родителей, важное значение имеет и 51 степень тяжести развивающейся реакции. В некоторых случаях резус-конфликт протекает почти незаметно, в других может стать причиной гибели ребенка. Обычно более тяжелые последствия наблюдаются при второй и последующих беременностях. Статистика показывает, что среди европейцев примерно 85% людей ре- зус-положительные и только 15% резус-отрицательные. Самостоятельная работа Задание. Определите, по возможности, наследование резус-фактора в своей семье и сделайте прогноз потомства. 52 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Молекулярно-генетические методы (МГМ) анализа ДНК позволяют уста- новить молекулярную причину патологии человека или проявления генных му- таций. МГМ направлены на определение структурных и функциональных осо- бенностей одного или нескольких генов, или всего генома в целом. Определе- ние структурных особенностей генов основано на определении последователь- ности нуклеотидов в интересуемом фрагменте ДНК. Применение методов МГМ Клиническая лабораторная диагностика: определение вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит, половые и др.), установление генных болезней (выявление мутаций) Судебная медицина: идентификация личности, определение отцовства Фундаментальная наука и практика: секвенирование (определение нуклеотидной последовательности), клонирование генов, генная инженерия (создание трансгенных животных и растений), генная терапия, направленный мутагенез. Первым этапом любого молекулярно-генетического исследования являет- ся выделение нуклеиновых кислот. Выделение нуклеиновых кислот Для выделения ДНК пригодны любые ядросодержащие клетки организма. Чаще всего на практике используется периферическая кровь (лейкоциты). Для выделения ДНК применяется обработка крови солевыми растворами различной концентрации для разрушения плазматической мембраны и ядерной оболочки, инкубирование с протеиназами для расщепления белков, связанных с ДНК и очистка препаратов, например, смесью фенола и хлороформа (рис. 25). 53 Рис. 25. Схема выделения ДНК. В большинстве случаев для анализа (например, для диагностики болезни) достаточно исследования небольшого фрагмента генома. Для этого исследуе- мый фрагмент необходимо получить в большом количестве копий. Амплифи- цировать фрагмент ДНК можно при помощи методов молекулярного клониро- вания и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Клонирование ДНК Клонирование ДНК - это размножение отдельных фрагментов ДНК путем включения их через бактериальные плазмиды в генетический материал микро- организмов. Это позволяет получать большое количество определенных фраг- ментов ДНК для проведения их анализа или получения различных функцио- нально активных белков человека и использовать их для терапии некоторых за- болеваний. 54 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Метод ПЦР – амплификации (увеличение количества копий) ДНК in vitro позволяет в течение нескольких часов получить большое количество копий ис- следуемой ДНК. Возможность осуществления репликации ДНК в пробирке давно интере- совала ученых. Особенно интересной представлялась возможность накопления большого количества копий ДНК для последующих исследований. Этот про- цесс стал возможным после открытия термостабильной Tag-полимеразыДНК из термофильных бактерий Thermis aquaticus. Принцип метода ПЦР был разра- ботан Кэри Мюллисом (США, 1983 г.) и в настоящее время используется как для научных целей, так и для диагностики наследственных болезней в практи- ческом здравоохранении. В основе метода ПЦР лежит комплементарное достраивание ДНК- матрицы, осуществляемое в пробирке с помощью фермента ДНК-полимеразы (т.е. осуществляется репликация). Обычная ДНК-полимераза не может работать при высоких температурах. Оптимум работы Tag-полимеразы находится в об- ласти 70-72ºС, что позволило сделать процесс репликации циклическим. При многократном повторении циклов синтеза происходит многократное увеличе- ние числа копий специфического фрагмента ДНК, что позволяет из небольшого количества анализируемого материала получить достаточное количество копий ДНК для идентификации их методом электрофореза. Комплементарное достраивание цепи начинается не в любой точке по- следовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК можно направлять процесс синтеза новой цепи только в этом участке, а не по всей длине цепи. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки – праймеры. Прай- меры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. Состав и параметры ПЦР реакции Для проведения амплификации в пробирку необходимо поместить сле- дующие компоненты: деионизированную воду, буфер, содержащий ионы маг- ния, два праймера, смесь из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, Tag- полимеразу и матрицу – молекулу ДНК, которую необходимо копировать. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различ- ных температурных условиях. |