Методы антропогенетики
 Скачать 1.9 Mb.
|
|
1 этап: Денатурация ДНК. Протекает при 93-95ºС в течение 30-40 сек (рис. 26). Рис. 26. Схема ПЦР (http://elementy.ru/lib/430350) 2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах соответствующего участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65 ºС. Время отжига составляет 20-60 сек. 3 этап: Достраивание цепи (элонгация). Комплементарное достраивание двух разных цепей ДНК происходит в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения прайме- ров, от 5’-конца к 3’-концу. Материалом для синтеза новых цепей служат до- бавляемые в раствор нуклеотиды. Синтез происходит при температуре 70-72ºС, время синтеза – 20-40 сек. Образовавшиеся в первом цикле амплификации цепи ДНК служат матрицами для нового цикла амплификации, в котором происхо- дит образование искомого специфического фрагмента ДНК (амплификона). В последующих циклах амплификации амплификоны служат матрицей для син- теза новых цепей. Таким образом, происходит накопление амплификонов в рас- творе по формуле 2 n , где n- число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась всего одна двухцепочечная мо- 56 лекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 10 в восьмой степени (10 8 ) молекул амплификона. Этого количества достаточно для досто- верной визуальной детекции амплификона методом электрофореза в геле. Про- цесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате - амплификаторе (рис. 27), который по заданной программе осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации. Рис. 27. Амплификатор Электрофорез фрагментов ДНК Электрофорез применяется для визуализации результатов ПЦР, ПДРФ и др. (рис. 28). Рис. 28. Камера для электрофореза в полиакриламидном геле. Образцы ДНК наносятся в специальные лунки в геле. В камеру заливается буферный соле- вой раствор, через который пропускается электрический ток. 57 Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение разных фраг- ментов ДНК в агарозном или полиакриламидном (ПААГ) геле. Фрагменты ДНК движутся с разной скоростью в геле, помещенном на стеклянной или пла- стиковой подложке в постоянном электрическом поле от отрицательного полю- са к положительному, в зависимости от размеров и заряда (чем больше относи- тельная молекулярная масса фрагмента и меньше заряд, тем медленнее он дви- жется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фраг- мент ДНК занимает определенное положение в виде отдельной полосы в кон- кретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем срав- нения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стан- дартными образцами ДНК или маркером. После окончания электрофореза ДНК необходимо окрасить для ее визуализации. Для этого используют флуоресцент- ные красители, например, растворимые соли серебра (AgNO 3 ) или этидиум бромид (рис. 29). Рис. 29. Агарозный гель окрашенный этидиум бромидом. В ультрафиолетовом свете видны полосы, соответствующие фрагментам ДНК разной длины. При окраске этидиум бромидом полосы, соответствующие фрагментам ДНК выявляются при ультрафиолетовом облучении геля (свечение в красной области спектра). При использовании ПЦР с последующим разделением фрагментов при по- мощи электрофореза можно обнаружить делеции и вставки в исследуемом гене. В случае делеций после ПЦР образуются фрагменты меньшей длины по срав- нению с нормальным геном, а в случае вставок (дупликаций) – большей. 58 Замены оснований не изменяют длину фрагментов, поэтому для их опреде- ления после ПЦР можно использовать метод анализа полиморфизма длины ре- стрикционных фрагментов и секвенирование. Общий принцип real-time PCR В настоящее время в практическое здравоохранение внедряется новая тех- нология ПЦР – это ПЦР в реальном времени(ПЦР-РВ, Real-Time PCR). Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Существует два основ- ных подхода к получению результатов ПЦР в реальном времени: с помощью красителей и на основе флуоресцентно-меченых зондов (рис. 30, 31). Рис. 30. Принцип работы красителей в real-time PCR. Рис. 31. Принцип работы флуоресцентных зондов типа Tag-Man в real-time PCR. Метод real-time PCR не требует стадии электрофореза и в последние годы успешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностиче- 59 ских и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее «классическом» варианте. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР синтеза ДНК (ПЦР-ПДРФ) Метод ПЦР-ПДРФ основан на способности ферментов – рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) расщеплять двухцепочечную ДНК в участках с опре- деленной нуклеотидной последовательностью – так называемых сайтах ре- стрикции. Изменения нуклеотидной последовательности в любой цепи ДНК в сайте рестрикции делает его неузнаваемым для рестриктазы. В настоящее время известно более 500 рестриктаз, что позволяет доста- точно часто использовать данный метод для диагностики точечных (SNP — single nucleotide polymorphism) мутаций и полиморфизмов. Значительное число нуклеотидных замен приводит к появлению в после- довательности ДНК новых участков узнавания для различных рестриктаз или исчезновению существовавших. В результате нормальный фрагмент ДНК и фрагмент с заменой нуклеотида будут разрезаться одной рестриктазой на раз- ное число фрагментов, отличающихся по длине. Примером может служить рестрикционный анализ промоторной области гена одного из белков сурфактанта легких человека SFTPB рестриктазой Bsc4I (рис. 32). ПДРФ маркер АС АС СС АС АС АС СС АА АА АС генотипы Рис. 32. Результаты электрофореза анализа ПДРФ промоторной области гена SFTPB (рестриктаза Bsc4I). Различной длины фрагменты легко выявляются при помощи электрофореза. Обратно-транскриптазная ПЦР (RT-PCR) Принципы ПЦР используют и для амплификации РНК.Выполнение дан- ной реакции требует дополнительного этапа — синтеза комплементарной ДНК (cDNA) на матрице мРНК. Данная реакция осуществляется за счет фермента 200 п.н. 100 п.н. 60 обратной транскриптазы, отсюда и метод амплификации РНК получил название полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией – ОТ-ПЦР (RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction). Инкубирование биологического материала с нуклеотидами (dATP - аденин, dTTP - тимин, dGTP - гуанин, dCTP - цитозин) и обратной транскриптазой про- исходит в буферном растворе, как правило, при 37°С в течение часа. Циклы ОT-PCRпроизводятся по стандартной методике ПЦР. ОТ-ПЦР ис- пользуют для диагностики генетических заболеваний и количественного опре- деления наследственного материала в клетках и оценки уровня экспрессии генов. Секвенирование Секвенирование– метод определения нуклеотидной последовательности ДНК. Метод применяется для изучения генома человека, как в норме, так и в патологии. При помощи секвенирования определяют аллельные варианты ге- нов, а также различные типы генных мутаций (чаще замены оснований). Существует несколько различных способов секвенирования ДНК. Пер- вым был предложен химический метод Максама-Гилберта, затем ферментатив- ный метод Сенгера, который в настоящее время в основном и применяется. В этой процедуре одноцепочечная молекула ДНК, последовательность которой определяется, служит матрицей для синтеза серии комплементарных цепей, обрывающихся в момент присоединения к растущей цепи специфиче- ских нуклеотидов. Для обрыва синтеза используют дидезоксинуклеотиды – ис- кусственно синтезированные нуклеотиды, лишенные 2' и 3'- гидроксильных групп и поэтому не способные присоединять к цепи следующий нуклеотид. Проба ДНК делится на 4 пробирки, в которые добавляют праймер, ДНК- полимеразу, смесь четырех дидезоксинуклеотидов (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) и небольшое количество одного из дидезоксирибонуклеотидов (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ). Во время синтеза ДНК-полимераза случайным обра- зом включает в цепь нормальные нуклеотиды и дидезоксинуклеотиды. При этом в каждой пробирке образуется набор фрагментов разной длины, заканчи- вающихся на один из дидезоксинуклеотидов. После этого проводится электрофорез, что позволяет разделить отлича- ющиеся на один нуклеотид фрагменты ДНК. В результате в геле образуется набор полос, напоминающих лестницу. Нуклеотидная последовательность ДНК читается в геле снизу вверх, согласно направлению 5'-3' цепи ДНК. Для опреде- 61 ления нуклеотидной последовательности больших фрагментов ДНК использу- ются автоматизированные машины (ДНК-секвенаторы). Современные методы полногеномного секвенирования Метод Сэнгера реализован к настоящему времени в ряде современных ав- томатических секвенаторов. Последние отличаются по типу проводимого элек- трофореза (на гелевых пластинах или в капиллярах) и по количеству детектиру- емых красителей: один, два или четыре. Капиллярные секвенаторы выпускают только в варианте, использующем детекцию четырех флюоресцентных красок. В качестве красителей используют флюоресцеиновые и родаминовые соедине- ния (рис. 33). Рис. 33. Принцип метода секвенирования по Сенгеру (www.dia-m.ru) 62 Таким образом, молекулярно-генетические методы часто используются для выявления генных мутаций. Около 1% новорожденных заболевают вслед- ствие генных мутаций, из которых часть вновь возникшие. Темп мутирования различных генов в генотипе человека неодинаков. Известны гены, которые му- тируют с частотой 10 на гамету в поколении. Однако большинство генов мути- руют с частотой, в сотни раз меньшей (табл. 8). Таблица 8. Примеры наиболее частых генных мутаций у человека № Типы и названия мутаций Частота мутаций Аутосомно-доминантные 1. Поликистоз почек 65 – 120 2. Нейрофиброматоз 11 – 100 3. Множественный полипоз толстой кишки 10 – 50 4. Аномалия лейкоцитов 9 – 27 5. Синдром Марфана 4 – 6 Аутосомно-рецессивные 1. Микроцефалия 27 2. Ихтиоз (не сцепленный с полом) 11 Рецессивные, сцепленные с полом 1. Мышечная дистрофия Дюшена 43 – 105 2. Гемофилия А 37 – 52 3. Гемофилия В 2 – 3 4. Ихтиоз 24 В настоящее время мутационный процесс у человека характеризуется тем, что протекает на фоне повышенной концентрации мутагенных факторов, созданной производственной деятельностью самого человека. Важнейшая зада- ча сегодняшнего дня – выявление мутагенных свойств загрязнителей, особенно новых химических веществ (лекарств, пестицидов, пищевых добавок, различ- ных видов топлива и т.д.), и разработка методов технологии, позволяющих предотвратить возникновение опасных концентраций этих агентов. Одним из сильнейших мутагенов является радиация (ионизирующие из- лучения). Доказано, что не существует пороговой дозы ионизирующих излуче- ний. Другими словами, индукция мутаций может быть достигнута при действии 63 любых доз, а при увеличении дозы пропорционально растет число мутаций. Мутагенным действием на клетки человека обладают и некоторые вирусы, причем даже в ослабленной форме, которая используется для приготовления вакцин. Известно также, что большинство мутагенов обладают и канцероген- ными свойствами, то есть они могут индуцировать развитие злокачественных опухолей. В то же время существуют внешние факторы, которые снижают частоту мутаций – антимутагены. К антимутагенам относятся некоторые витамины – антиоксиданты (например, витамин Е, ненасыщенные жирные кислоты), серо- содержащие аминокислоты, а также различные биологически активные веще- ства, которые повышают активность репарационных систем. Примеры наиболее распространенных наследственных заболеваний человека На сегодняшний день описано около 10 000 наследственных заболеваний человека. Среди них моногенные и мультифакториальные. Галактоземия Характеризуется невозможностью усваивать молочный сахар (галактозу). Аутосомно-доминантный тип наследования заболевания. Обусловлено недоста- точной активностью фермента, обеспечивающего превращение галактозы в глюкозу. У гетерозигот Аа активность указанного фермента составляет 50% от нормы, а у гомозигот аа – 10% нормы. При этом заболевании наблюдаются по- ражение печени и селезенки, диспепсические расстройства, катаракта и ум- ственная отсталость. Частота заболевания составляет 1:50000 новорожденных; частота гетерозиготных носителей – 1:100. Диета, не содержащая молочного сахара, предотвращает развитие симптомов. Алкаптонурия Заболевание развивается при неполном окислении гомогентизиновой кислоты в организме. Аутосомно-рецессивный тип наследования заболевания. Проявляется в виде артритов конечностей и позвоночника. Сопутствующим признаком является появление «мышиного» запаха мочи у больных людей. Это первое заболевание, для которого была доказана молекулярно-генетическая природа возникновения (А. Гаррод, 1909). 64 Муковисцидоз Относится к наиболее тяжелым наследственным заболеваниям человека. Характеризуется аутосомно-рецессивным типом наследования. Называется также кистозный фиброз поджелудочной железы. В среднем один из 20 представителей европеоидов является гетерозигот- ным носителем аллеля гена муковисцидоза. Частота среди новорожденных – 1:2000. Ежегодно рождается около 3500 детей с этим тяжелым, часто ведущим к летальному исходу заболеванием. В последнее время удельный вес этих больных в популяциях возрастает. Дефект гена определен множеством вариан- тов мутаций, одна из которых возникает в результате делеции трех нуклеотидов и приводит к утрате одной аминокислоты в регуляторном трансмембранном белке. Муковисцидоз проявляется в кишечной форме, легочной и смешанной. Гиперхолестеринемия Это заболевание связанно с нарушением обмена холестерина. Избыток холестерина откладывается на стенках сосудов в виде атеросклеротических бляшек, что приводит к развитию ишемической болезни. Холестерин необходим нашему организму. Он является компонентом клеточных мембран, на его основе синтезируются стероидные гормоны, желч- ные кислоты. В среднем 1000 мг холестерина синтезируется у человека в клет- ках печени в сутки, а 500 мг поступает с животной пищей. Но при нарушениях холестеринового обмена типа гиперхолестеринемии в кровеносных сосудах накапливается избыток холестерина, приводя к атеросклерозу. Наследование мультифакториальное. Фенилкетонурия Заболевание вызывает нарушение высшей нервной деятельности. Тип наследования заболевания - аутосомно-рецессивное. Частота встречаемости среди новорожденных – 1:10000, частота носителей патологического аллеля ге- на – 1:50. Обусловлено разными мутациями в гене, контролирующем метаболизм аминокислоты фенилаланина. При мутации гена фенилаланин превращается не в тирозин, а в фенилпировиноградную кислоту. В результате нарушается мие- линизация нейронов головного мозга, что приводит к слабоумию, микроцефа- лии. При своевременном выявлении этого заболевания и назначении диеты с 65 пониженным содержанием фенилаланина симптомы патологии значительно ослабляются. Гемоглобинопатии Вызывают нарушение структуры гемоглобина. В результате измененный гемоглобин не может нормально выполнять свои функции (переносчика О 2 , СО 2) . К формам гемоглобинопатий относятся талассемия, серповидно- клеточная анемия. Тип наследования заболевания – аутосомно-рецессивный. Известно, что в состав молекулы гемоглобина человека входят две α– цепи и две β–цепи. α – цепь закодирована геном, локализованным в 16 паре хромосом, β–цепь закодирована геном, локализованным в 11 паре хромосом. В состав α–цепи входит 146 аминокислот, при этом в норме шестое положение занимает глутаминовая кислота (закодирована триплетом ГАА). При участии нормальной α–цепи образуется нормальный гемоглобин – HbA. В участке ДНК, кодирующего α–цепь, в результате мутации происходит замена триплета ГАА на триплет ГТА, и тогда на месте глутаминовой кислоты в молекуле гемогло- бина появится валин, в соответствии с генетическим кодом. нормальный гемоглобин HbA: …вал-гис-лей-тре-про-глу-глу-лиз-… измененный гемоглобин HbS:…вал-гис-лей-тре-про-вал-глу-лиз-… В итоге вместо гемоглобина HbA появится новый гемоглобин – HbS. То есть замена всего лишь одного нуклеотида и одной аминокислоты приводит к развитию тяжелого заболевания – серповидно-клеточной анемии. Патология в полной мере проявляется у гомозигот. На клеточном уровне эта болезнь проявляется в том, что эритроциты приобретают форму серпа и теряют способность к нормальному транспорту кислорода (рис. 34). Рис. 34. Нормальные и изменные эритроциты в крови больного серповидно-клеточной ане- мией. 66 Гомозиготы HbS/HbS умирают в раннем детстве, гетерозиготы HbA/HbS характеризуются слабо измененными эритроцитами. HbS не употребляют ма- лярийные плазмодии, поэтому изменение гемоглобина значительно повышает устойчивость лиц с гетерозиготным генотипом к малярии. В регионах Земли, где распространена малярия (например, в Африке), селективный отбор дей- ствовал в пользу гетерозигот и эта мутация чаще встречалась. Таким образом, серповидноклеточная анемия – это пример относительности «полезности» и «вредности» мутаций. Известны десятки молекулярно-генетических причин, ведущих к наруше- нию структуры гемоглобина: точковые мутации, делеции, нарушения процес- синга мРНК. В странах Южной Европы широко распространены гемоглобино- патии под общим названием талассемия. Различают легкие и тяжелые формы этих заболеваний. |