исследование вымени коровы. курсач. "Методы исследования вымени и ранней диагностики субклинических маститов"
Скачать 59.54 Kb.
|
Прямые методы подсчета соматических клетокК ним относят метод подсчета на стекле по Прэскотту-Бриду, камерные методы по Н.М.Хилькевичу, И.И.Архангельскому и др. в модификации В.И.Слободяника, подсчет с помощью электронного прибора «Фоссоматик», электронных счетчиков частиц: целлоскоп, «Культер-Каунтер», пикоскель, гемоцитометр кондуктометрический марки ГЦМК-3 и др. Метод Прэскотта-Брида. Чистое предметное стекло кладут на лист бумаги, расчерченный на квадраты со стороной 1см. Пробу молока тщательно перемешивают и с помощью микропипетки наносят на 3-4квадрата предметного отекла по 0,01см3. Нанесенную каплю молока равномерно распределяют по площади квадрата стеклянной палочкой или препаровальной иглой. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют и одновременно обезжиривают нанесением сначала метилового спирта на 10-15мин, а затем спирт-эфирной смеси до высыхания. Окрашивают мазок рабочим раствором краски Романовского-Гимза (3-4мл продажного раствора на 100мл дистиллированной воды) методом подслаивания иди при вертикальном положении стекла в течение 20-30мин. После окрашивания мазок промывают водой и высушивают при комнатной температуре. Подсчет соматических клеток ведут под микроскопом с иммерсионным объективом. В каждом мазке просматривают 100полей зрения. Подсчитанное число клеток умножают на коэффициент с учетом значений объектива и окуляра и определяют их количество в 1см3молока. Для выведения коэффициента с помощью объект-метра определяют диаметр поля зрения микроскопа и вычисляют площадь одного поля зрения по формуле πR2. Затем вычисляют, сколько полей зрения микроскопа размещаются на площади 1см2. Полученный результат переводят на объем. Пример: определение коэффициента пересчета при окуляре 7 и объективе 90.В поле зрения размещается 17делений объект-метра. Величина одного деления - 0,01мм. Диаметр поля зрения - 0,01мм х 17 = 0,17 мм,радиус - 0,085мм. Площадь одного поля зрения -3,14 x 0,0852 = 0,023мм2или 0,00023см2. Площадь 100полей зрения будет равна 0,00023см2х 100 = 0,023ом2. На площади 1см2 таких участков будет: 1 : 0,023 = 43,48.Взятый объем молока 0,01 см3в 100раз меньше 1см3. Коэффициент в данном случае будет равен 4348 (43,48х100). За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Метод Н.М.Хилькевича.В пробирку наливают 0,4мл разведенной краски Романовского-Гимза. (1мл дистиллированной воды и 5 капель краски) и 20мм3исследуемого секрета вымени, получают разведение1:20.Через 15-30мин заполняют камеру Горяева. Лейкоциты подсчитывают в 1большом квадрате и результат умножают на 5000. Метод И.И.Архангельского и др.Сначала готовят солюбилизирующий раствор по следующей прописи. К 0,9%раствору натрия хлорида, содержащего 1%формалина и 12,5% этилового спирта, добавляют 1%солюбилизатора и нагревают при 60°С в течение 20мин. В качестве солюбилизатора используют синтанол ДС-10 (оксиэтилированные жирные спирты фракции С10-С16с 10молями окиси этилена) или ПП-40 (полиоксиэтилированное производное пентола с 40молями окиси этилена).После растворения солюбилизатора к раствору добавляют I%насыщенного спиртового раствора основного фуксина и фильтруют через бумажный фильтр. Краску к солюбилизирующему раствору добавляют непосредственно перед опытом. Для подсчета соматических клеток в пробирку, содержащую 10 мл солюбилизирующего раствора с красителем, добавляют 0,1 мл тщательно перемешанного молока и прогревают в водяной бане при 80°С 30мин. После остывания содержимое пробирки перемешивают и вносят каплю жидкости под покровное стекло счетной камеры :Горяева, Фукс-Розенталя или др. Подсчет клеток ведут под микроскопом (окуляр 7или 10,объектив 8или 10)во всей камере или в определенном ее объеме. Расчет количества соматических клеток в 1см3проводят по формуле: 1000 х С х А Х= --------------------------, V где Х -количество соматических клеток в 1см3молока; А -количество подсчитанных соматических клеток; С -разведение; 1000 -множитель, приводящий результат к объему 1см3; V -объем, в котором подсчитаны клетки. Метод И.И.Архангельского и др. в модификации В.И. Слободяника.Модификация метода И.И. Архангельского и др. заключается в том, что насыщенный спиртовой раствор основного фуксина добавляют к солюбилизирующему раствору в количестве не I%,а0,25%.и используют готовый красящий раствор в количестве не 10 мл, а 5. Это позволяет готовить полностью красящий раствор заблаговременно и использовать его в течение 15дней после приготовления. Расчеты ведут по вышеизложенной формуле с учетом сделанного разведения пробы молока. Подсчет на приборе «Фоссоматик». Принцип работы прибора основан на том, что ядра соматических клеток молока окрашивают флюорохромовыми красителями и равномерно распределяют образец на вращающемся барабане. С помощью электронного устройства учитывается количество флюоресцирующих точек и полученный результат с помощью самописца фиксируется на ленте. Производительность работы прибора составляет 180проб молока в1ч. Подсчет на электронных счетчиках частиц: целлоскопе «Культер-Каунтере», пикоскеле, гемоцитометре кондуктометрическом марки ГЦМК-3 и др.Принцип действия этих приборов основан на изменении электрического сопротивления частиц, подлежащих подсчету. При прохождении соматических клеток через капиллярное отверстие скачкообразно повышается сопротивление, это служит импульсом, который регистрируется и подсчитывается электронным путем. Счетчики снабжены дискриминатором -устройством, которым подсчитывают только частицы определенной величины. |