исследование вымени коровы. курсач. "Методы исследования вымени и ранней диагностики субклинических маститов"
 Скачать 59.54 Kb.
|
Косвенные методы определения соматических клетокКосвенно соматические клетки определяют с помощью диагностических реактивов мастидина, димастина, мастоприма, пробы Уайтсайда, содержащих поверхностно-активные вещества (ПАВ). ПАВ разрушают мембраны клеток, высвобождают из ядер ДНК и вступают с ней в реакцию, образуя желе. По степени образования желеобразного сгустка косвенно судят о количестве соматических клеток в молоке. Реакцию молока с диагностическим реактивом проводят на молочно-контрольных пластинках ПМК-1 или ПМК-2, имеющих 4луночки, соответственно долям вымени коровы, определение соматических клеток с помощью диагностических реактивов проводят в молоке из отдельных долей вымени или удоя коровы для диагностики субклинического мастита и пробах сборного молока для определения в нем примеси анормального. Для диагностики мастита по молоку из каждой доли вымени используют диагностические реактивы малой концентрации: мастидин 2%,димастин 5%, мастоприм I%,в пробе Уайт-Сайда 4%раствор едкого натра. Для диагностики мастита у коров по молоку разового или суточного удоя используют 10% раствор димастидина и 20%димастина, а для определения примеси анормального молока в сборном -2,5% раствор мастоприма и маститодиагност (реактив Загаевского). Наличие в составе мастидина, кроме ПАВ, индикатора бромкрезолпурина, а в димастине фенолового красного, позволяет судить по изменению цвета смеси о величине рН исследуемого молока. При использовании этих реактивов для диагностики субклинического мастита основным диагностическим признаком является образование желеобразного сгустка, а изменение цвета смеси –ориентирующим. Проба с 2% раствором мастидина.Для приготовления 2% раствора мастидина к 100мл 10% раствора, выпускаемого отечественной промышленностью, прибавляют 400мл дистиллированной или прокипяченной воды. В луночки молочно-контрольной пластинки (ПМК-1, ПМК-2) из соответствующих долей вымени надаивают по 1мл молока и добавляют1мл приготовленного 2% раствора мастидина с помощью пипетки-автомата или дозатора жидкости. Смесь молока с реактивом перемешивают палочкой в каждой луночке ПМК-1 поочередно в течение 10-15 с. При использовании ПМК-2 смешивание молока с реактивом проводят одновременно во всех луночках, путем ротационного вращения пластинки в горизонтальной плоскости. Реакцию учитывают по густоте желе: отрицательная реакция (-) -однородная жидкость: сомнительная реакция (±) -следы образования желе; положительная реакция (+) -ясно видимый сгусток, который можно выбросить из луночки палочкой при перемешивании. На пластинке ПМК-2 при отрицательной реакции (-)образуется однородная смесь. При сомнительной реакции (±) во время вращения пластинки на дне луночки заметны тонкие нити (тяжи) без тенденции образования сгустка. Положительная реакция (+) -отчетливое появление слабого или быстро образующегося плотного сгустка, концентрирующегося при вращении пластинки в центре луночки. Определение рН молока по цвету: светло-сиреневый, дымчатый -рН молока нормальная (6,5-6,8); почти белый -повышенная кислотность молока (рН меньше 6,5); темно-сиреневый -повышенная щелочность молока (рН больше 8). Проба с 5% раствором димастина. Раствор димастина готовят на дистиллированной или прокипяченной теплой воде. Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2% раствором мастидина. Определения рН молока по цвету: оранжевый, оранжево-красный (красно-оранжевый) –нормальная реакция молока (рН 6,5-6,8); желтый -повышенная кислотность молока (рН меньше 6,5); красный -повышенная щелочность молока (рН больше 6,8); алый и малиновый -ярко выраженная щелочность молока (рН больше 7,0). Проба с I% раствором мастоприма. Препарат мастоприм представляет собой порошок желтоватого цвета, состоящий из смеси сульфанола (4части) с едким натром (1 часть). Раствор мастоприма готовят на дистиллированной воде. Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2%раствором мастидина. Проба Уайтсайда.Готовят 4%раствор едкого натра на дистиллированной воде, который добавляют по 2,5мл к молоку (по 1мл) в каждую луночку молочно-контрольной пластинки. Постановку пробы и учет реакции желеобразования проводят как при исследовании молока с 2%раствором мастидина. Спустя 30с. признаки желеобразования могут исчезнуть. Проба с 10% раствором мастидина. Диагностику мастита у коров по молоку разового или суточного удоя проводят при контрольных дойках и взятии проб для определения жира и других показателей молока. Молоко в количестве 1мл берут из молокомера или суточной пробы и выливают в луночку молочно-контрольной пластинки. Затем добавляют 1мл 10% раствора мастидина. Техника постановки пробы на пластинках ПМК-1 и ПМК-2 и учет реакции по образованию желе и цвету проводят как указано раньше. Для определения пораженной доли вымени от животных, давших положительную и сомнительную реакцию с 10%раствором мастидина, отбирают пробы молока из каждой четверти и исследуют с 2%раствором мастидина, или 5% раствором димастина, или 1%раствором мастоприма, или пробой Уайтсайда. Проба с 20% растворам димастина. Постановку пробы и учет реакции проводят как с 5% раствором. Соответствие количества соматических клеток (млн./мл), подсчитанных по методу Прэскотта-Брида, показаниям реакции молока из долей вымени коров с 2%раствором мастидина и 5%раствором димастина по данным А.И.Ивашуры, представлены в таблице 2: Таблица. 2. Соответствие количества соматических клеток показаниям реакции молока
Проба с 2,5% раствором мастоприма. Примесь анормального молока в сборном определяют на молокоперерабатывающих предприятиях. В луночки молочно-контрольной пластинки ПМК-1вносят 1 мл тщательно перемешанного молока и добавляют к нему 1мл 2,5%раствора мастоприма. Молоко с реактивом перемешивают в течение 10 -15с и учитывают реакцию. На пластинке ПМК-1 при отрицательной реакции жидкость однородная, желе не образуется. Такое молоко не имеет примеси анормального молока или примесь незначительная (2-З%). Положительная реакция -образуется желеобразный сгусток, степень которого оценивается в крестах. Один крест (+) -слабое желе, смесь молока с реактивом тянется за палочкой в виде нити, на дне уже заметна небольшая выемка. Такое молоко содержит в среднем 4-б%анормального молока и до500тыс./мл соматических клеток. Два креста (++) -более выраженный желеобразный сгусток, при перемешивании которого хорошо видна выемка, но желе из луночки еще не удается выбросить. Такое молоко содержит в среднем 9-10% анормального молока и от 500тыс. до 1млн./мл соматических клеток. Три креста (+++) -хорошо сформированный желеобразный сгусток, который легко можно выбросить палочкой из луночки пластинки. Такое молоко содержит выше 15%анормального молока и свыше1млн./мл соматических клеток. Проба с маститодиагностом (реактив Загаевского). Для приготовления маститодиагноста 300г сульфанола и 50г триполифосфата натрия растворяют в 1л дистиллированной воды при температуре 70-75°С. После полного растворения смеси и охлаждения до 20-25°С добавляют 0,2г бромтимолового синего и 3мл 1% спиртово-водного раствора розоловой кислоты и тщательно перемешивают в течение 3-5мин, после чего реактив фильтруют через ватный фильтр. Срок хранения приготовленного реактива - 3-3,5месяца при температуре 5°С. Для исследования берут 2 мл тщательно перемешанного сборного молока, вносят в луночку молочно-контрольной пластинки ПМК-1, добавляют 1мл маститодиагноста и перемешивают палочкой в течение5-10с. Учет реакции проводят по изменению консистенции и цвета смеси молока с реактивом. Гомогенная смесь молока с реактивом (-) -отсутствие примеси анормального молока в сборном. Наличие единичных слизистых тяжей и хлопьев (±) -примесь анормального молока 1-5%. Умеренное содержание жидкой слизи и хлопьев (+) - примесь анормального молока 5-10%. Наличие слизи жидкой консистенции (++) -примесь анормального молока 10-15%. Умеренный сгусток в виде белка куриного яйца (+++) -примесь анормального молока 20-25%. Плотный желеобразный сгусток, зеленоватого цвета (++++)-примесь анормального молока свыше 25%. Примесь более 10% анормального молока к сборному влияет на его технологическую переработку, качество изготовляемых из него кисломолочных продуктов и сыров. Биохимические методы исследования: Определение азотсодержащих веществ. Азотсодержащие вещества в молоке представлены синтезированными высокомолекулярными соединениями, а также промежуточными и конечными продуктами азотистого обмена веществ, количество которых существенно изменяется в зависимости от функционального состояния молочной железы, что используется при оценке качества молока и диагностике патологических процессов в молочной железе. а) Общего белка методом Кьельдаля Метод предназначен для проведения государственных испытаний приборов, а также для разработки ускоренных методов определения общего белка. Метод основан на сжигании органических компонентов пробы молока в колбе Кьельдаля в присутствии серной кислоты, а освобождавшийся при этом азот определяют титрованием и по его количеству вычисляют содержание общего белка Подготовка к анализу: 1)Приготовление раствора натрия гидроокиси. 500г натрия гидроокиси растворяют в 1000мл дистиллированной воды. При применении в качестве катализатора красной окиси ртути в раствор натрия гидроокиси добавляют 12г сульфата натрия(Nа2S•9Н2О). 2)Приготовление двойного индикатора. 2г метилового красного и 1г метилового голубого растворяют в 1000мл 96%этилового спирта. Проведение анализа: 1)В колбу Кьельдаля помещают последовательно несколько стеклянных бусинок или кусочков фарфора, 10г калия сернокислого,0,5г окиси ртути или 0,04г сернокислой меди. В бюксу отмеривают5мл молока, взвешивают с точностью до 1мг, по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы устанавливают массу взятого молока. В колбу добавляют 20мл серной кислоты, закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое. 2)Колбу ставят в нагревательный прибор под углом 45°и осторожно нагревают до тех пор, пока не прекратится пенообразование и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы. Периодически содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок. Нагревают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и практически бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при катализаторе сернокислой меди). 3)После осветления раствора нагревание продолжают в течение1,5ч, затем дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 мл дистиллированной воды и несколько кусочков свежеприготовленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают 4)В коническую колбу отмеривают 50мл борной кислоты, добавляют 4капли индикатора и .перемешивают. Коническую колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резиновой трубки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в конической колбе. 5)Колбу Кьельдаля соединяют с холодильником при помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеривают 80мл раствора натрия гидроокиси, и через делительную или капельную воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора закрывают кран делительной воронки во избежание потерь образующегося аммиака. Содержимое колбы осторожно смешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. При этом избегают пенообразования. Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет вскипать толчками. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем дополнительной перегонки в новую порцию борной кислоты (20мл) в течение 5мин. Окраска раствора борной кислоты, должна оставаться без изменений. При перегонке не допускается нагревание раствора борной кислоты в конической колбе. Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа оказался под поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2мин. Прекращают нагревание, отсоединяют аллонж, в коническую колбу омывают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа небольшим количеством дистиллированной воды. 6)Титруют дистиллят 0,1н раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в фиолетовый. Параллельно проводят контроль анализа так же,как и основной, применяя 5мл дистиллированной воды вместо молока. Обработка результатов Массовую долю общего белка (X)в процентах вычисляют с точностью до третьего десятичного знака по формуле 1,4х 0,1К (V1-Vо)х6,38 Х=-------------------------------------- m где, 1,4 -количество азота, эквивалентное 1мл 0,1н раствора соляной кислоты, мл; 0,1 -нормальность раствора соляной кислоты; К -коэффициент поправки раствора соляной кислоты; V1 -объем 0,1н НСl, израсходованной на титрование дистиллята в основном анализе, мл; V0 -объем 0,1н НС1,израсходованной на титрование в контрольном анализе, мл; 6,38 -коэффициент перевода массовой доли общего азота на массовую долю общего белка; m -масса молока, взятого для анализа, г. За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 0,03%. б) Общего белка пробой с нейтрализованным формалином и едким натром Подготовка к анализу: 1)Нейтрализация формалина. На 100мл 36-40% раствора формалина добавляют 0,5мл 2%раствора фенолфталеина и по каплям вносят раствор щелочи (30-40%), а в конце нейтрализации -0,1н раствор едкого натра до появления слабо-розовой окраски. Лучше нейтрализовать небольшую порцию формалина и использовать ее для анализа в течение одного дня. Как недостаточная, так и излишняя нейтрализация формалина приводит к ошибке. Формалин хранят в темном месте при температуре б-9°С. При долгом хранении формалина в условиях низкой температуры появляется осадок. Пользоваться таким формалином можно после фильтрации его через бумажный фильтр. 2)Приготовление сернокислого кобальта.2,5г сернокислого кобальта вносят в мерную колбу емкостью100мл и доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора сернокислого кобальта -не больше б месяцев. Проведение анализа: В химический стакан отмеривают 20мл молока, добавляют 2,5мл 2% спиртового раствора фенолфталеина и нейтрализуют 0,1н раствором едкого натра (без учета количества его) до появления розовой окраски, совпадающей с цветом эталона. Для получения эталона в стакан такой же емкости отмеривают 20мл того же молока и 1 мл раствора сернокислого кобальта. Затем в стакан с молоком вносят 4мл 36-40% раствора нейтрализованного формалина, перемешивают круговыми движениями и через1мин титруют из бюретки 0,1н раствором едкого натра до появлений розовой окраски, которая должна совпадать с цветом эталона. Количество децинормального раствора едкого натра отсчитывают с точностью до 0,05мл. Делают не менее двух параллельных определений, расхождения между которыми не должны быть более 0,05мл щелочи. Обработка результатов: Количество 0,1н раствора едкого натра, затраченного на титрование пробы молока после добавления формалина, умножают на коэффициент 0,959и округляют до 0,001.Полученное произведение показывает содержание общего белка в молоке в процентах. в) общего белка с помощью приборов Используют датские электронные приборы «Промилк МК 2», «Милко-Скан 100», «Милко-Скан 203», «Милко-Скан 300 “. В молоке клинически здоровых коров количество общего белка составляет 3,3-4,I%в зависимости от породы. При воспалительном процессе в молочной железе количество общего белка возрастает. г) азота и аммиака реактивом Несслера. Приготовление реактива Несслера: 30г ртути двуйодистой, 26г калия йодистого растирают в ступке с 30мл дистиллированной воды и переносят в мерный цилиндр со 160мл 50% раствора едкого натра. По окончании бурной реакции ступку ополаскивают, содержимое цилиндра доводят дистиллированной водой до 1л. Реактив выдерживают 3-4суток в темном месте, после чего он готов к употреблению. Проведение анализа: 1) Определение общего азота. Пробу молока разводят дистиллированной водой 1:100.К 0,25 мл разведенного молока добавляют 0,5мл 10% раствора серной кислоты и подогревают для минерализации. Когда раствор значительно потемнеет, добавляют по каплям перекись водорода до посветления и подогревают 3-5мин. для окончательной минерализации. После охлаждения приливают 3,5мл дистиллированной воды и 1,5мл реактива Несслера. Сразу после добавления реактива определяют оптическую плотность на приборе «Спекол» при длине волны 470нм. Обработка результатов: Полученную цифру оптической плотности умножают на 10 000. 2)Определение азота сыворотки молока К 10мл обезжиренного центрифугированием (при 6тыс. оборотах в 1мин) в течение 10мин молока добавляют 400 мг сульфосалициловой кислоты, хорошо перемешивают и ставят в холодильник на 1ч. Осадок отцентрифугируют в течение 5мин при 3тыс. оборотах в 1 мин. Подученную сыворотку разводят в 20раз дистиллированной водой. Затем проводят минерализацию и определяют оптическую плотность как при определении общего азота. Обработка результатов: Полученную цифру оптической плотности умножают на 200. 3) Определение остаточного азота. К 1мл сыворотки молока, полученной на предыдущем этапе, добавляют 1мл дистиллированной воды и 2мл 10%раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и выдерживают в холодильнике 2ч. После чего отцентрифугируют при 3тыс. оборотах в 1мин. в течение 5мин. Затем проводят минерализацию и определяют оптическую плотность как при определении общего азота. Обработка результатов: Полученную цифру оптической плотности умножает на 100. 4)Определение аммиака Анализу подвергают молоко не ранее чем через 2ч после окончания доения. В стакан отмеривают 20мл молока, нагревают в водяной бане до 40-45°С, добавляют 1мл 10%уксусной кислоты, оставляют для осаждения казеина на 10мин. Пипеткой отбирают 2мл отстоявшейся сыворотки, переносят в пробирку, добавляют 1мл реактива Несслера и содержимое сразу же перемешивают, наблюдая при этом в течение не более 1мин изменение окраски смеси. Обработка результатов: Чувствительность метода составляет 6-9мг% аммиака. Появление лимонно-желтой окраски смеси указывает на присутствие аммиака, характерного для молока. Появление оранжевой окраски различной интенсивности указывает на наличие аммиака выше его естественного содержания. д) мочевины по цветной реакции с диацетилмонооксимом. Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в молоке. Подготовка к анализу: Реактивы. 1)Приготовление 25% раствора диацетилмонооксима. 250 мг вещества растворяют в 9,75 мл дистиллированной воды. Реактив стоек. 2)Приготовление основного раствора хлорного железа. 5 г хлорного железа растворяют и доводят дистиллированной водой до 100 мл, затем прибавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. 3)Приготовление рабочего раствора хлорного железа. 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл дистиллированной водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85% ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель. 4) Приготовление раствора тиосемикарбазида. 250 мг тиосемикарбазида или 320 мг тиосемикарбазида соляно-кислого растворяют соответственно в 97,5 и 96,8 мл дистиллированной воды, получают 0,25% и 0,32% растворы. 5)Приготовление цветного реактива. К 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 25% раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25% раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением. 6)Приготовление стандартного 0,025% раствора мочевины. Берут 250мг мочевины, в сушильном шкафу при температуре 105°С доводят до постоянного веса, а затем растворяют в 1л дистиллированной воды. В качестве растворителя можно использовать 0,2% раствор бензойной кислоты (0,2г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100мл дистиллированной воды при интенсивном помешивании и нагревании на водяной бане).Стандарт, приготовленный на растворе бензойной кислоты, более стабилен, чем водный. При работе на ФЭК оба раствора должны давать небольшое количество экстинции. В противном случае готовят новый стандартный раствор. 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) Оборудование: 1.Фотоэлектроколориметр. 2.Центрифуга. 3.Водяная баня. 4.Центрифужные пробирки. 5. Алюминиевая фольга |