исследование вымени коровы. курсач. "Методы исследования вымени и ранней диагностики субклинических маститов"
 Скачать 59.54 Kb.
|
|
. Проведение анализа: Обезжиривание молока. Для этого его центрифугируют 20 мин при 4000-5000об/мин, верхний слой (жир) удаляют, а оставшуюся часть сливают в пробирку, закрывают резиновой пробкой и хранят в холодильнике. В центрифужную пробирку вносят 0,8мл дистиллированной воды,0,2мл обезжиренного молока и 1мл 10% раствора ТХУ. Перемешивают и оставляют на 10-20мин. Центрифугируют 15-20мин при 3000об/мин. В чистую пробирку вносят 0,5мл прозрачной надосадочной жидкости и 5мл цветного реактива. Пробирку закрывают резиновой пробкой, обернутой алюминиевой фольгой, выдерживают в кипящей водяной бане 80мин (точно) и охлаждают под струёй горячей воды. Измерение проводят на ФЭК при длине волны 500-600нм (зеленый светофильтр) против контроля в кювете с толщиной слоя 1см не позднее чем через 15мин после охлаждения. Контроль ставят, как и опытную пробу, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5мл дистиллированной воды. Одновременно определяют мочевину в стандартной пробе. Стандартную пробу обрабатывают аналогично опытной, но вместо обезжиренного молока берут 0,2мл стандартного раствора мочевины. Обработка результатов: Расчет проводят по формуле. Е оп Х = ------------- х 25, Е ст где Х -концентрация мочевины, мг% Еоп -экстинция опытной пробы; Ест -экстинция стандартной пробы; 25 -концентрация мочевины в стандартном растворе, мг% В молоке клинически здоровых коров содержание мочевины составляет 20-40мг%,в молозиве первого удоя - 15-20мг%, молозиве 5-го дня —18-24 мг%. е) Электрофоретическое определение сывороточных белков. В щелочных буферных растворах большая часть белков ведет себя как кислота и движется к аноду. Скорость движения различных белков в электрическом поле различная. Сывороточные белки молока путем электрофореза можно разделить на четыре основных группы: сывороточный альбумин, бета-, альфа-лактоглобулины, иммунные глобулины. При рН 7,9все эти белки в электрическом поле движутся к аноду, так как они при этом становятся отрицательно заряженными. Наиболее быстро движется сывороточный альбумин, затем бета-лак-тоглобулин, за ним альфа-лактоглобулин, наконец, иммунные глобулины. Оборудование: Прибор для электрофореза на бумаге. Центрифуга. 3)Холодильник. 4)Потенциометр (рН-метр). 5) Пипетки и микропипетки. Реактивы: Приготовление 20% раствора уксусной кислоты. 200 мл ледяной уксусной кислоты вносят в мерную колбу объемом 1л и доливают до метки дистиллированной водой. Приготовление веронал-оксалатного буфера рН 7,9. Раствор № 1: 36,8г веронала и 24мл 30% раствора едкого натра растворяют в дистиллированной воде, доводя общий объем до 2 л. Раствор № 2: 4,5г щавелевой кислоты растворяют в дистиллированной воде, доводя объем до 1л. Раствор № 3: 1560мл раствора № 1смешивают с 480мл раствора № 2.Если рН ниже 7,9,добавляют несколько капель щелочи, при более высоком рН -щавелевокислую кислоту. 3) Приготовление раствора красителя. 100мг кислотного сине-черного красителя растворяют в 450 мл этилового спирта, добавляя в него 50мл ледяной уксусной кислоты, или0,2г бромфенолового синего и 1г хлористой ртути растворяют в 100мл 2% раствора уксусной кислоты, или2г хлористого аммония, 10г каломеди, 1г бромфенолового синего растворяют в 1л дистиллированной воды. Профильтровать и использовать через сутки. 4)Растворы для отмывания электрофореграмм. 100мл ледяной уксусной кислоты и 40г перегнанного фенола доводят дистиллированной водой до 1л, или50мл ледяной уксусной кислоты доводят дистиллированной водой до 1л. 5)0,1н едкий натр Проведение электрофореза: Для исследования берут 30-40 мл молока, подогревают до 40°С и центрифугируют при 1500-2000об/мин в течение 10мин. Молоко помещают в холодильник на 10-15мин, после чего пипеткой или шпателем снимают жир. Следы жира (0,2-0,З%), оставшиеся в молоке, не мешают дальнейшему анализу. Для отделения казеина к обезжиренному молоку добавляют по каплям 20% уксусную кислоту, доводя реакцию молока до рН 4,6 (изоэлектрическая точка казеина). При этом происходит более полное осаждение казеина. Реакцию молока проверяют потенциометром или универсальным индикатором. Выпавший осадок отделяют фильтрованием. Казеин отделяют в день взятия пробы молока, так как при хранении в холодильнике в течение 1-2суток изменяется соотношение фракций белка. Молочную сыворотку используют для электрофоретического анализа. Перед проведением электрофореза кюветы камеры заполняют буфером, доводя до одинакового уровня. Электроды полностью помещают в буферный раствор. Для электрофореза используют хроматографическую фильтровальную бумагу № 4,выпускаемую Санкт-Петербургской фабрикойим. Володарского. Полоску бумаги размером 3х40см или 4х32см помещают в камеру за 1-1,5ч до нанесения сыворотки для увлажнения. Сыворотку молока в количестве 0,08мл наносят дробно в 4 приема на полоску, отступя от катодного конца 10см. Электрофорез проводят в следующем режиме: напряжение 300В, сила тока - 0,3мА/см, градиент потенциала - 5В/см, время - 6 ч. По окончании электрофореза прибор выключают. Электрофореграммы сушат при 100°С 10мин в горизонтальной плоскости. Окрашивают раствором кислотного сине-черного или бромфенолового синего в течение 15мин. Для удаления красителя, с безбелковых участков электрофореграммы промывают от кислотного сине-черного красителя 10% раствором уксусной кислоты с перегнанным фенолом;бромфенолового синего –5% раствором уксусной кислоты. 11) Для установки соотношений белковых фракций сыворотки молока электрофореграмму разрезают на отдельные выявленные фракции. Кусочек бумаги, соответствующий каждой фракции, измельчают, помещают в пробирку с 5-10мл 0,1н едкого натра и элюируют в течение1ч. Для элюирования бета-лактоглобулиновой фракции берут вдвое больший объем 0,1н едкого натра. Оптическую плотность раствора красителя в элюиате измеряют на ФЭКе при красном светофильтре (длина волны 630нм). Контролем служит эталон элюиата из участка электрофореграммы, не содержащего белка. Обработка результатов: Процентное содержание каждой фракции белка вычисляют по соотношению между показателями оптической плотности данной фракции и суммы показателей оптической плотности всех фракций, которую принимают за 100,с учетом двукратного увеличения показателя для фракции бета-лактогобулинов. На стартовой линии выявляют неидентифицированную фракцию в виде одной иди двух полос (неподвижная фракция).Неподвижную фракцию выделяют в самостоятельную, так как она закономерно выявляется на всех электрофореграммах. Пример. Показания ФЭК для сывороточного альбумина составляют 0,07,бета-лактоглобулина - 0,238х 2 = 0,476,альфа-лактоглобулина - 0,196,иммунных глобулинов - 0,262и неподвижной фракции -0,096.Сумма показателей оптической плотности - 1,100,а процентное соотношение фракций белка соответственно: сывороточный альбумин - 0,070 - 6,4% бета-лактоглобулин - 0,476 - 43,3% альфа-лактоглобулин - 0,196 - 17,8% иммунные глобулины - 0,292 - 23,8% неподвижная фракция - 0,096 - 8,7% 1,100 -100% В сыворотке молока больных маститом коров увеличивается содержание сывороточного альбумина и иммунных глобулинов по сравнению со здоровыми животными. Определение лактозы Лактоза (молочный сахар)образуется в молочной железе и ее количество изменяется в зависимости от функционального состояния органа, что используется при оценке качества молока и диагностике патологических процессов в молочной железе. Используют датский электронный прибор «Милко-Скан 203». В молоке здоровых коров количество лактозы составляет 4,6-4,9%, в молозиве - 3,0-4,I%.При воспалительном процессе в молочной железе количество лактозы снижается. Определение концентрации водородных ионов (рН). Изменение рН молока происходит как при физиологической перестройке функции молочной железы (различные сроки лактации, период сухостоя), так и при патологических процессах, протекающих в этом органе. Повышение щелочности (рН больше 6,8)является ориентирующим признаком при постановке диагноза на мастит. Концентрацию водородных ионов (рН) определяют с помощью приборов -рН метров и различных индикаторов. а) Определение рН-метром Используют рН-метр-милли-вольтметр ЛПМ-60 М, рН-метр-милли-вольтметр рН-340, рН-метр для молока и молочных продуктов рН 222,1и др. В стаканчик наливают 2/3объема исследуемого молока, опускают в него измерительные электроды и по отклонению стрелки милливольтметра устанавливают по шкале величину рН. б) Проба с бромтимоловым синим Приготовление раствора бромтимолблау: 0,5г бромтимолблау растворяют в 50мл этилового спирта и добавляют 50мл дистиллированной воды. Проведение анализа: 1)Проба на стекле. На поверхность предметного стекла наносят 1каплю исследуемого молока и добавляют 1каплю раствора бромтимолового синего. Учитывают цвет смеси. 2)Проба на молочно-контрольной пластинке. В луночки ПМК-1, ПМК-2, УОКМ-1 (устройство для определения качества молока) из соответствующих долей вымени надаивают по 1мл молока и добавляют по 1-2капли раствора бромтимолового синего. Учитывают цвет молока на месте контакта с индикатором. Оценка результатов: желтый, желто-зеленый -рН молока 6,3-6,8; беловато-желтый, белый -рН молока меньше 6,3; зеленый, синий -рН молока щелочная, больше 6,8. Определение кислотности по Тернеру. Кислотность является в основном показателем свежести и степени загрязненности молока. В конце лактации и при воспалении молочной железы кислотность молока (секрета) снижается. Проведение анализа: В коническую колбу вносят 10мл исследуемого молока, 20 мл дистиллированной воды и 3капли I%спиртового раствора фенолфталеина, перемешивают и титруют из бюретки 0,1н раствором едкого натра (или кали) до появления не исчезающего в течение 30с. слабо-розового окрашивания. Обработка результатов: Расчет ведут по формуле Х =А х 10, где х -количество молока вградусах Тернера; А - количество мл 0,1н раствора едкого натра (или калия), пошедшего на титрование 10мл молока; 10 -коэффициент пересчета в градусы Тернера (количество мл 0,1н раствора едкого натра или калия, пошедшего на титрование 100мл молока). Кислотность свежего молока от здоровых коров составляет в среднем 16-19°Т, молозива первого удоя -45-55°Т, седьмого дня -19.5°Т. Определение кетоновых (ацетоновых) тел реактивом Лестраде. Кетоновые (ацетоновые) тела состоят из ацетона, ацетоуксусной кислоты, которые являются промежуточными продуктами обмена веществ в организме и могут увеличиваться при его нарушении не только в крови, моче, но и в молоке. Проводят определение как общего количества кетоновых тел, так и раздельно. Приготовление реактива Лестраде: 1г натрия нитропрусида, 20г натрия углекислого безводного и 20г аммония сульфата смешивают и растирают в ступке до получения мелкого однородного порошка. Хранят в темной посуде с плотно притертой пробкой. Проведение анализа: На фильтровальную бумагу наносят 0,2г реактива Лестраде и смачивают его 2-3каплями исследуемого молока. Через 40-60с учитывают цвет смеси. Оценка результатов: В молоке (молозиве) здоровых коров сумма кетоновых тел (бета-оксимасляная, ацетоуксусная кислоты, ацетон) составляет не более 8мг%. Окраска смеси молока с реактивом Лестраде в сиреневый цвет свидетельствует о наличии в молоке (молозиве) более 10% кетоновых тел. Определение пигментов крови В молоке здоровых животных встречаются лишь единичные эритроциты. Увеличение их количества может быть следствием ушибов, травм, воспалительных процессов молочной железы, а также послеродового отека вымени, особенно у первотелок. Химические пробы по обнаружению пигментов крови основаны на гемолизе эритроцитов и освобождении гемоглобина, который способен отнимать водород от гвояковой смолы, бензидина, пирамидона и других органических соединений и переносить его на перекись водорода с образованием окрашенных соединений. а) Проба с гвояковой смолой Приготовление раствора гвояковой смолы. 5г смолы растворяют в 95мл 90% этилового спирта. Проведение анализа: Готовят смесь 5% спиртового раствора гвояковой смолы (1мл) с перекисью водорода (0,5мл), которую осторожно наслаивают на исследуемое молоко, предварительно налитое в пробирку объемом 5 мл. Оценка результатов: При содержании в молоке гноя или пигментов крови на границе соприкосновения жидкости через 2-3мин образуется синее или темно-синее кольцо. При встряхивании вся жидкость окрашивается в темно-синий цвет. Б)Пробасбензидином Проведение анализа: К смеси из 5мл 3% раствора перекиси водорода добавляют 2мл насыщенного раствора бензидина в ледяной уксусной кислоте. Смесь тщательно взбалтывают и прибавляют в нее 2-10капель исследуемого молока. Оценка результатов: При наличии в молоке гноя или пигментов крови жидкость окрашивается сначала в зеленый цвет, а через 0,5-1мин -в темно-синий. При отрицательной реакции жидкость будет светлая с беловатым хлопьевидным осадком. в) Проба с пирамидоном Проведение анализа: В пробирку с 5мл молока прибавляют 1мл 50%-ного раствора уксусной кислоты, взбалтывают и добавляют 0,5мл 5%-ного спиртового раствора пирамидона, 6-8капель перекиси водорода. Оценка результатов: При положительной реакции жидкость окрашивается в светло-фиолетовый (аметистовый) цвет, что указывает на наличие пигментов крови. Определение жира. Жир молока является продуктом синтеза альвеолярного эпителия, и его количество определяется функциональной активностью секреторных клеток. К концу лактации и при воспалении молочной железы количество жира в молоке (секрете) снижается. 1)Стандартный сернокислый способ Способ основан на свойстве белков молока растворяться в серной кислоте, освобождения жира и образования амилово-серного эфира в присутствии изоамилового спирта. Проведение анализа: В молочный жирометр (бутирометр) наливают с помощью пипетки автомата 10мл серной кислоты плотностью 1,81-1,82(при 20°С), затем пипеткой медленно приливают 10,77мл молока и 1мл изоамилового спирта (плотность при 20° С - 0,811-0,812).При этом избегают смачивания горлышка жиромера. Жиромер плотно закрывают резиновой пробкой и встряхивают до полного растворения белка, на что указывает отсутствие белых крупинок. При встряхивании применяют меры предосторожности или специальные штативы. После полного растворения белка жиромер ставят пробкой вниз в водяную баню при температуре 65° С на 5 мин |