Биология. Методы изучения эукариотической клетки
 Скачать 2.57 Mb.
|
|
Тема: Методы изучения наследственности человека Цель занятия: - выделить особенности человека как объекта генетических исследований; - разобрать методику проведения и возможности генеалогического, близнецового, цитогенетического и биохимических методов изучения наследственности человека, - сформулировать показания к использованию этих методов; - рассмотреть возможности популяционно-статистического метода для анализа генетической структуры популяций; - дать понятие о современных молекулярных методах изучения наследствен- ности человека. Вопросы для устного собеседования: 1. Особенности человека как объекта генетических исследований. 2. Цитогенетический метод изучения наследственности человека. Методика приготовления микропрепаратов для кариотипирования, возможности метода. Метод определения полового хроматина. 3. Генеалогический метод изучения наследственности человека. Этапы работы и возможности метода. 4. Близнецовый метод изучения наследственности человека. Причины рождения монозиготных и дизиготных близнецов, их генетические и фенотипические особенности. 5. Использование популяционно-статистического метода для анализа генетической структуры популяций. Закон Харди-Вайнберга. 6. Биохимические и молекулярно-генетические методы: возможности и показания к использованию. Самостоятельная аудиторная работа I . Цитогенетические методы Цитогенетический метод является основополагающим методом современной генетики человека, который позволяет выявить различные нарушения геномного и хромосомного уровней организации наследственного 100 материала. При подозрении на наличие у больного наследственного заболевания в большинстве случаев рекомендуется провести анализ его кариотипа, и в этих случаях не имеет значение биологический возраст объекта – это может быть плод, новорожденный, ребенок в пубертатном периоде или взрослый. К цитогенетическим методам, используемым в медицинской генетике относятся определение полового хроматина (Х-хроматина и Y-хроматина) в интерфазных ядрах клеток различных тканей, определение морфологических особенностей хроматина интерфазных клеток, а также исследование мета- фазных хромосом для определения кариотипа. Цитогенетические методы позволяют: - определить генетический пол организма; - диагностировать геномные или хромосомные нарушения кариотипа; - составлять генетические карты хромосом. Показания к использованию: - подозрение на хромосомное заболевание; - множественные пороки развития у плода или новорожденного; - проблемы роста и развития в раннем возрасте; - бесплодие; - несколько неблагополучных исходов беременности (спонтанные аборты, мертворождения); - онкологические заболевания (лейкозы); - оценка мутагенных воздействий факторов среды. Работа 1. Метод определения полового хроматина Используется как экспресс-метод для определения содержания в кариотипе Х-хромосом. Приготовьте предметное и покровное стекла: протрите их ваткой, смоченной в спирте. Возьмите шпатель, протрите один конец его спиртом. Проведите ребром шпателя по внутренней поверхности щеки, стремясь снять 101 эпителий слизистой оболочки. Соскоб эпителия размажьте на предметном стекле. На мазок нанесите каплю красителя – ацеторсеина, накройте каплю покровным стеклом и слегка придавите его пальцем. Изучите приготовленный препарат при увеличениях микроскопа 7 х 8 и 7 х 40. При изучении следует обратить внимание на наличие на ядерной мембране плотного образования, его форма и размеры у разных индивидуумов может быть различной. Это инактивированная Х-хромосома или половой хроматин (или тельце Барра). Зарисуйте в альбом клетку, содержащую в ядре половой хроматин. II . Клинико-генеалогический метод Генеалогический метод (метод родословных) является простым, но при этом достаточно информативным методом изучения наследственности человека. Его суть заключается в прослеживании передачи определенного признака среди лиц, которые объединены родственными связями. Это могут быть как нормальные признаки человека (форма нома, цвет глаз, ямочки на щеках и т.д.), так и патологические – наследственные заболевания, нару- шения индивидуального развития, непереносимость пищевых продуктов, аллергические состоянии. В медицинской практике этот метод называют клинико-генеалогическим, поскольку анализируется не только факт переда- чи заболевания от родителей, но и оценивается степень тяжести заболева- ния, для чего используются дополнительные лабораторные методы исследования. Одна из основных задач генеалогического метода – установление наследственного характера признака или заболевания. Подавляющее большинство признаков организма генетически обусловлены, формирование и степень выраженности признаков зависит от наличия соответствующих генов. Одни признаки контролируются одной парой аллельных генов (наследуются моногенно), другие – наследуются по типу полимерии (количественные признаки). В ряде случаев появление признака является 102 результатом возникновения генеративной мутации у одного из родителей. В этой ситуации признак следует признать спорадическим – впервые возникшим. Как пример можно привести хромосомные болезни человека, обусловленные изменением числа хромосом: у больных с синдромом Дауна родители имеют нормальный кариотип, а передача данного заболевания последующим потомкам крайне маловероятна. Поэтому наиболее часто анализируются признаки (заболевания) с моногенным характером наследования. Работа 2. Анализ родословных Используя таблицы и практикум Ю.К.Богоявленского, зарисуйте в альбом условные обозначения для составления родословных. Проанализируйте родословные и дайте обоснованные ответы на следующие вопросы: 1. Является ли данный признак (заболевание) наследственным? 2. Какой тип наследования имеет место? 3. Приведите примеры признаков (заболеваний) с таким же типом наследования. Родословная 1 103 Родословная 2 III . Близнецовый метод Близнецы – уникальный биологический объект, предоставленный генетикам, на котором лучше всего изучать взаимодействие генотипа и внешней среды. Большинство признаков организма формируются как результат взаимодействия генотипа и факторов среды. Однако конкретный вклад наследственности и среды на появление и степень выраженности разных признаков может быть различным. Некоторые признаки исклю- чительно зависят от воздействия каких-либо факторов среды, например, инфекционные заболевания. Хотя проникновение вирусов или бактерий в организм человека не во всех случаях приводит к проявлению клинических признаков заболевания. Это зависит, прежде всего, от активности иммунной системы человека, которая в свою очередь контролируется индивидуальным генотипом человека. В тоже время есть признаки, которые всецело определяются генотипом, например, группы крови. С учетом громадного количества признаков у человека, как нормальных, так и патологических, вопрос о роли наследственности и среды в их развитии имеет значение не только для генетиков. Интеллектуальные и психологические особенности, 104 спортивные достижения, склонность к правонарушениям, предраспо- ложенность к неинфекционным заболеваниям – эти темы всегда интересны для дискуссии в кругу образованных людей. Близнецы – потомство, родившееся от обычно одноплодной особи. Рождение близнецов у человека – отклонение от нормы. В некоторых учебниках до сих пор можно встретить термины «однояйцевые и двуяйцевые (разнояйцевые) близнецы». Эти определения не оправданы, поскольку новый организм развивается не из яйца, а из диплоидной клетки – зиготы. Поэтому лучше разделять близнецов на две группы – монозиготные и дизиготные. Причина рождения дизиготных близнецов – одновременное оплодотворение двух яйцеклеток двумя сперматозоидами, при этом образуются две зиготы, которые дают начало развитию двум независимым эмбрионам. Во время овуляции может произойти выход из яичника не только двух овоцитов, но и трех, четырех и более клеток. И каждая из них может быть объединиться со сперматозоидом и сформировать самостоятельную зиготу. Рис. 11. Механизм развития дизиготных близнецов 1 – стадия зиготы; 2 – стадия дробления; 3 – стадия бластоцисты; 4 – развитие эмбрионов в матке Частота рождения дизиготных близнецов значительно отличается в зависимости от географии страны и расовых особенностей: в Европе пары близнецы рождаются с частотой 8 случаев на 1000 родов (тройни – 1:7500), в странах Африканского континента близнецы составляют 4% от новорожденных. В целом отмечается определенная зависимость – 105 вероятность рождения близнецов увеличивается с возрастом матери, при этом пик рождаемости близнецов приходится на 35-39 лет. Пол дизиготных близнецов может быть одинаковым, а может быть – разным. Фенотипические различия такие же, как у детей, родившихся от одних родителей, но в разное время. Это есть наглядное проявление комбинативной изменчивости: разные генотипы зигот (50% общих генов) приводят к различным фенотипическим проявлениям. Монозиготные близнецы изначально развиваются из одной зиготы. Однако нарушения начальных этапов эмбрионального развития приводят к образованию не одного эмбриона, а двух или более. В зависимости от того, на какой стадии произошло нарушение, выделяют несколько типов развития монозиготных близнецов. 1.Дихориальные и диамниотические близнецы. На вторые сутки после образования зиготы начинаются ее митотические деления – стадия дробления. Последовательно образуются 2, 4, 8 бластомеров; вокруг них сохраняется оболочка оплодотворения, которая обеспечивает контакт между клетками. Несмотря на то, что различия между клетками появляются уже с первых делений, бластомеры сохраняют равные потенциалы развития, т.е. являются тотипотентными клетками. Повреждение целостности оболочки оплодотворения может привести к разделению бластомеров, а каждый из них в отдельности даст начало развитию самостоятельного эмбриона. При этом каждый эмбрион будет иметь собственный хорион и амниотическую оболоч- ку. 2. Монохориальные и диамниотические близнецы. На 5-6 сутки после оплодотворения начинает формироваться бластоциста, в которой выделяют две группы клеток – трофобраст и эмбриобласт. Из клеток трофобласта раз- вивается внезародышевый провизорный орган – хорион, ворсины которого при дальнейшем развитии эмбриона образуют плаценту. Из клеток эмбриобласта формируются ткани зародыша, а также внезародышевые органы: желточный мешок, аллантоис, амнион. При нормальном эмбрио- 106 нальном развитии клетки одного эмбриобласта дают начало развитию одному зародышу. Но если клетки эмбриобласта по неизвестной причине (предполагается, что причина – задержка имплантации и недостаток кислорода) разделится на две (или более) части, то из каждой группы клеток начинает развиваться собственный эмбрион; вокруг каждого эмбриона начинает формироваться собственный амнион. Большинство монозиготный близнецов (более 70%) имеют монохориальный и диамниотический тип развития. 1 2 3 4 Рис. 12. Механизм развития монозиготных близнецов 1 – стадия зиготы; 2 – стадия дробления; 3 – стадия бластоцисты; 4 – развитие эмбрионов в матке 3. Монохориальные и моноамниотические близнецы. Следующий важный этап развития – образование амниона. Этот событие происходит на 9-14-ые сутки, параллельно идет формирование гаструлы. В исключительных случаях может произойти расщепление гаструлы, что, в конечном итоге, приведет к развитию различных форм сращенных близнецов. Независимо от типа развития монозиготные близнецы всегда имеют одинаковый пол и идентичный генотип (т.к. развиваются из одной зиготы), который обеспечивает высокий процент их фенотипического сходства. Незначительные фенотипические отличия обусловлены модификационной или случайной изменчивостью. 107 Близнецовый метод – исследование генетических закономерностей на близнецах, а также изучение явления многоплодия у человека. Сущность метода заключается в сравнении сходства (конкордантности) в группах монозиготных и дизиготных близнецов, что позволяет с помощью специа- льных формул оценить роль наследственности и факторов среды в развитии признака (или заболевания). Для количественной оценки роли этих факторов можно использовать формулу Хольцингера: Смз - Сдз Н = х 100 Е = 100 - Н 100 - Сдз Смз - конкордантность МЗ близнецов Н – роль наследственности Сдз - конкордантность ДЗ близнецов Е – роль факторов среды Работа 3. Решение задач. 1. Конкордантность монозиготных близнецов по массе тела составляет 80%, а дизиготных - 30%. Каково соотношение наследственных и средовых факторов в формировании признака? 2. Один из близнецов страдает дальтонизмом, второй (мужского пола) здоров. Каков вероятный пол близнеца, страдающего заболеванием? Являются ли близнецы монозиготными? Чем обусловлены различия фенотипов близнецов? IV . Популяционно-статистический метод Популяционно-статистический метод используется для изучения генетической структуры популяций, а также факторов, влияющих на сохранение и изменение генофонда популяций при смене поколений. Этот метод использует данные, полученные при изучении частоты встречаемости в популяции определенного признака или наследственного заболевания. 108 Механизмы, определяющие генетическую структуру популяций, могут быть разделены на две группы: поддерживающие равновесие генотипов и нарушающие равновесие. Закон равновесного состояния больше известен как закон Харди- Вайнберга: «В идеальной популяции соотношение гомозиготных и гетерозиготных особей есть величина постоянная». Идеальная популяция характеризуется следующими особенностями: - многочисленность; - свободное скрещивание особей в популяции (случайный выбор партнера); - одинаковая плодовитость гомозигот и гетерозигот; - отсутствие естественного отбора; - отсутствие новых мутаций в пределах популяции; - отсутствие оттока генов за счет миграции особей за пределы популяции или притока генов извне. Несмотря на то, что закон Харди-Вайнберга характеризует соотно- шение генотипов в идеальной популяции, эти несложные формулы можно использовать для анализа реальных популяций; расчетные цифры будут очень близки к реальным. Сточки зрения популяционного статистического анализа особенно важно, что закон устанавливает математическую зависимость между часто- тами генов и генотипов. Эта зависимость основывается на простом мате- матическом расчете. Если генофонд популяции обусловлен парой аллельных генов (например, А и а), ген А встречается с частотой р, а ген а – с частотой q, тосоотношение частот этих аллелей в популяции окажется равенством: р А +q а = 1 Возведя обе части равенства в квадрат и раскрыв скобки, получим формулу, отражающую частоту генотипов: Р 2 А А +2 р q А а+ q 2 а а = 1 Следовательно, генотип АА встречается в рассматриваемой популяции с частотой Р 2 , генотип а а – с частотой q 2 , а гетерозиготы - с частотой 2 рq. 109 Таким образом, зная частоту аллелей, можно установить частоту всех генотипов, и, наоборот, зная частоту генотипов – частоту аллелей. Работа 4. Решение задач 1. С какой частотой в популяции людей встречаются гетерозитотные носители по гену альбинизма, если известно, что из 20 000 человек один является альбиносом. За развитие заболевания отвечает аутосомно- рецессивный ген. 2. Врожденный вывих бедра наследуется как аутосомно-доминантный признак, средняя пенентрантность – 25%. Заболевание встречается с часто- той 6:10 000. Определите частоту встречаемости рецессивных гомозигот. * * * * * Самостоятельная внеаудиторная работа Решение ситуационных задач. 1. Двое молодых здоровых людей, вступающих в брак, обратились в медико-генетическую консультацию в связи с проявляющейся в обеих семьях аномалией слуха: у жениха были глухие брат, дядя со стороны матери и племянник (сын сестры), а невеста имела глухих брата и сестру, но оба родителя обладали нормальным слухом. Составьте родословную и определите вероятность рождения будущего ребенка глухим. 2. Группы крови у монозиготных близнецов совпадают в 100% случаев, а дизиготных близнецов в 40% случаев. Чем определяется коэффициент наследуемости – средой или наследственностью? 3. При исследовании буккального (щечного) эпителия, взятого у мужчины с нормальным кариотипом, в клетках был обнаружен Х-хроматин. Как можно объяснить это явление? 4. Показатель заболеваемости населения подагрой составляет 2%; заболевание обусловлено доминантным аутосомным геном. По некоторым 110 данным, пенетрантность гена подагры у мужчин равна 20%, а у женщин – 0%. Определите генетическую структуру популяции по анализируемому признаку. Вопросы для самоконтроля знаний 1. Какие трудности возникают при изучении наследственности человека? 2. Какие методы генетики, используемые при изучении наследственности у растений и животных, не применимы к человеку? 3. Какие клинические особенности характерны для заболеваний с аутосом- но-доминантным типом наследования? 4. Какие можно выделить отличия между Х-сцепленным доминантным и Х-сцепленным рецессивным типами наследования? 5. Какие причины приводят к рождению монозиготных близнецов? Как можно доказать зиготность близнецов? 7. В чем заключается смысл метода контроля по партнеру? 8. Почему популяционно-статистический метод не используется при изуче- нии хромосомных болезней человека? 9. Какие методы позволяют выявить (или предположить) наличие в генотипе патологического (мутантного) гена? Темы учебно-исследовательской работы студентов: 1. Генетическая инженерия и проект «Геном человека» 2. Методы генетики соматических клеток. 3. Использование в судебной медицине методов изучения наследственности человека. * * * * * 111 Словарь терминов Альфа-фетопротеин – эмбриональный белок, обнаруживаемый в крови пло- да, новорожденного, беременной женщины, а также в амниотической жидкости; содержание особенно увеличивается при дефектах развития нервной трубки плода. Биохимические методы – методы, которые позволяют диагностировать заболевания обмена веществ путем исследования биологических жидкостей (крови, мочи, амниотической жидкости) с целью определения содержания метаболитов, гормонов, антител. Биохимические нагрузочные тесты – введение в организм различных химических соединений (например, глюкозы, фенилаланина) с последующим определением их концентраций в крови; используются для выявления гетерозиготных носителей патологических генов. Близнецы – потомство, родившееся от обычно одноплодной особи. Гемеллология – наука о близнецах. Генеалогическое древо – графическое изображение с помощью специ- альных символов родословных связей в пределах одной семьи или рода с указанием наличия определенного признака или заболевания. Генеалогический метод – изучение характера наследования определенного признака с последующей оценкой его проявления у потомков на основании анализа генеалогического древа. Генетический маркер – полиморфный участок ДНК строго определенной локализации, разные аллели которого позволяют дифференцировать различные по происхождению хромосомы и анализировать их сегрегацию в родословной. Генетический риск – вероятность появления генетического заболевания. Генная инженерия – совокупность методов и технологий получения реком- бинантных молекул ДНК и РНК, выделения отдельных генов, осуществле- ния манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генодиагностика (ДНК-диагностика) – комплекс методов позволяющих обнаруживать гены или фрагменты нуклеиновых кислот специфичные для определенного вида. Гибридизация in situ – взаимодействие комплементарных цепей денату- рированной ДНК клеток и меченной радионуклидами или иммунофлюо- ресцентными соединениями одноцепочечной ДНК или РНК с целью исследования структуры хромосомы. Дерматоглифика – изучение рельефных узоров на коже, образованных папиллярными линиями (папиллярные узоры) на ладонях, подушечках пальцев, ступнях ног. Дизиготные близнецы – потомство при многоплодной беременности, развивающееся из двух (или более) самостоятельных зигот, возникших в результате одновременного созревания двух (или более) яйцеклеток и 112 оплодотворения их двумя (или более) сперматозоидами. Пол близнецов может быть одинаковым или разным. Дискордантность – степень различия близнецов по изучаемому признаку. Клон – генетически однородное потомство одной соматической клетки. Клонирование гена – получение большого числа идентичных копий определенного участка ДНК с использованием для этих целей микроорганизмов. Конкордантность – степень сходства близнецов по изучаемому признаку; количественный показатель совпадения признака в парах родственников, выраженный в процентах. Монозиготные близнецы – потомство при многоплодной беременности, развивающееся из одной сформировавшейся зиготы; близнецы всегда одного пола и характеризуются высоким процентом конкордантности. Панмиксия – случайное скрещивание разнополых организмов с разными генотипами в популяции. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод циклического синтеза in vitro огромного числа копий участка ДНК с целью идентификации определенного гена. Пробанд – лицо, в отношении которого составляется родословная; при построении родословной пробанд отмечается стрелкой. Секвенирование – определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК или последовательности аминокислот в белке. Сибсы – потомки одних и тех же родителей (братья и сестры); у полусибсов общим является только один из родителей. Скрининг (просеивание) – обследование больших групп людей на какое- либо состояния (болезнь или носительство патологических генов) с помощью простых методов, дающих быстрый результат. Трансгенные организмы – животные, растения или микроорганизмы, наследственный материал которых изменен с помощью методов генной инженерии (например, путем введения гена от организма другого вида). Хроматин половой – а) интенсивно окрашенная структура ядра у самок млекопитающих, представляющая собой спирализованную (функционально неактивную) Х-хромосому; б) материал, из которого состоит Y-хромосома. Цитогенетика – раздел генетики, изучающий закономерности наслед- ственности и изменчивости на уровне клеток и субклеточных структур. * * * * * Рекомендуемая литература: 1. Лекционный материал 2. Биология /Под редакцией В.Н.Ярыгина. В 2-ч т. М.: Высшая школа, 2006. – Кн.1. , с. 255-272 113 3. Бочков Н.П. Клиническая генетика: Учебник.- 3-е изд., - М.: ГЭОТАР- Медиа, 2006. – 480с. 4. Пехов А.П. Биология: Медицинская биология, генетика и паразитология. Учебник. Изд. 2-е, испр. И доп. – М.: РУДН, 2007. – с. 276-281. 5. Генетика. Учебник для ВУЗов/ Под ред. Акад. РАМН В.И.Иванова. – М.:ИКЦ «Академкнига», 2006. - с.315-410. |