Биология. Методы изучения эукариотической клетки
 Скачать 2.57 Mb.
|
|
1 ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ЯРОСЛАВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ КАФЕДРА БИОЛОГИИ С ГЕНЕТИКОЙ Б И О Л О Г И Я руководство к практическим занятиям специальность 31.05.01 – Лечебное дело Ярославль, 2012 2 Методическое пособие разработано для организации самостоятельной аудиторной и внеаудиторной работы студентов лечебного факультета Ярославской государственной медицинской академии и содержит рекомендации к выполнению работ по разделам «Биология клетки», «Размножение», «Генетика», «Онтогенез». Руководство составлено в соответствии с ФГОС высшего профессионального образования (2010) и рабочей программы кафедры биологии с генетикой. Авторы: А.Г.Диунов – доцент, кандидат медицинских наук, заведующий кафедрой биологии с генетикой Г.П.Жариков – доцент, кандидат биологических наук С.В.Тихомирова – старший преподаватель, кандидат биологических наук Н.А.Смирнова – преподаватель Рецензент: Гансбургский А.Н.- д.м.н., профессор кафедры гистологии с эмбриологией и цитологией Рекомендовано к изданию цикловой методической комиссией по морфологическим дисциплинам ЯГМА (протокол № 4 от 26.04.2012). © А.Г.Диунов, Г.П.Жариков, С.В.Тихомирова, Н.А.Смирнова © ЯГМА 3 Занятие № 1 Тема: Методы изучения эукариотической клетки. Световая микроскопия. Цель: - изучить современные методы изучения эукариотических клеток. Задачи: - разобрать основные методы изучения эукариотической клетки, выявить преимущества и недостатки каждого метода; - изучить устройство светового микроскопа и овладеть методикой работы с ним; - освоить методику приготовления временных микропрепаратов. В результате изучения данной темы студент должен знать: - методы изучения эукариотических клеток, представлять их возможности; - устройство светового микроскопа; - принципы приготовления постоянных и временных микропрепаратов. уметь: - микроскопировать препараты биологических объектов при малом и боль- шом увеличениях микроскопа; - осуществлять уход за микроскопом; - приготовить временный микропрепарат биологического материала; - проанализировать, зарисовать и обозначить структуры биологического объекта. Самостоятельная аудиторная работа Работа 1. Методы изучения эукариотических клеток Изучите представленный в таблице учебный материал. Таблица 1 Метод Характеристика Световая микроскопия Используется для изучения биологических объектов, естественно окрашенных или с использованием специальных красителей; максимальное разрешение – 200-500 нм. Дает возможность длительного наблюдения за живым подвижным объектом, производить фото- графирование и микрокиносъемку. 4 Электронная микроскопия Позволяет изучить ультраструктуру органоидов эукариотической клетки, бактерий, вирусов, структуру биологических макромолекул. Максимальное разрешение – 0,5-1 нм. Трансмиссионный (просвечивающий) микроскоп позволяет получить плоскостное изображение объекта, а сканирующий – создает эффект пространственного трехмерного изображения. Структура фибринового сгустка (sk.ru) Флюоресцентная микроскопия Актиновые микрофиламенты окрашены в красный (фаллоидин, меченый флуоресцином), микротрубочки – в зеленый (флуоресцентно- меченые антитела), ядра клеток – в голубой цвет (ru.wikipedia.org) Культивирование клеток Проводится в условиях in vitro для изучения влияния различных факторов на основные процессы жизненного цикла клеток. Клетки, 5 выделенные из органа, выращивают в стери- льных условиях с использованием специальных питательных сред. Клеточные культуры служат объектом для цитологических, фармаколо- гических, микробиологических и других иссле- дований, а также используются в целях биотехнологии для получения материала для трансплантации, синтеза биологически активных веществ, образования антител и др. Дифференциальное ультрацентрифугиро- вание Методоснован на разной скорости осаждения органоидов клеток под действием центробежной силы и используется для разделения внутри- клеточных структур. Микрохирургия клетки Методы применяются для выделения тканевых клеток и переносе их в организм другого животного, а также для извлечения и транс- плантации ядер, ядрышек и других органоидов клетки. Операции по пересадке ядер дают возможность изучить роль ядра и цитоплазмы в жизни клеток, изучить изменения, проис- ходящие в безъядерных клетках, выяснить участие ядра и цитоплазмы в передаче по наследству тех или иных признаков. Работа № 2. Устройство и приемы работы с микроскопом Световой микроскоп состоит из следующих основных частей: механической (штатив, предметный столик, тубус, револьвер, макро- и микровинты), осветительной (зеркало, служащее для направления светового пучка на изучаемый объект) и оптической (окуляр и объективы). Цифры на окуляре и объективах показывают степень увеличения. Чтобы определить степень увеличение объекта, необходимо перемножить цифры на окуляре и объективе. Приемы работы с микроскопом: 1. Установить микроскоп на рабочем месте так, чтобы окуляр был обра- щен к левому глазу. Не передвигать микроскоп до конца работы с ним. 2. Альбом для рисунков разместить справа (или слева) от микроскопа. 6 3. Перед началом работы с микроскопом необходимо: - проверить комплектность: наличие окуляра, объективов, зеркала; - установить объектив малого увеличения (8 х); - с помощью макровинта установить расстояние между объективом и предметным столиком около 1 см. 4. Смотря в окуляр микроскопа, с помощью зеркала добиться максимального освещения поля зрения. 5. Изучаемый микропрепарат разместить на предметном столике микроскопа покровным стеклом вверх. Изучаемый объект должен располагаться под объективом. 6. Глядя в окуляр, с помощью макровинта добиться четкого изображения объекта. Поскольку чаще в поле зрения оказывается только часть объекта, то необходимо рассмотреть весь препарат. Передвигать препарат следует большим и указательным пальцами левой руки, правая рука должна нахо- диться на макровинте, слегка поворачивая его для поддержания фокусного расстояния. 7. Для изучения объекта на большом увеличении необходимо: - выбранный участок объекта установить точно в центре поля зрения; - вращая револьвер, установить объектив большого увеличения (40х) напротив отверстия в предметном cтолике. Переводить микроскоп на большое увеличение следует очень аккуратно, при этом смотреть не в окуляр, а сбоку на микроскоп; - для фокусировки изображения используйте микровинт. Если самостоятельно не получается увидеть объект при большом увеличении микроскопа, пригласите преподавателя. Для изучения объекта при большом увеличении можно использовать другой способ: - выбранный участок объекта установить в центре поля зрения; - макровинтом приподнять тубус микроскопа, вращением револьвера сме- нить объектив малого увеличения (8х) на объектив «40х»; 7 - СМОТРЕТЬ СБОКУ! Опустить объектив «40 х» почти до соприкосно- вения с покровным стеклом препарата; - очень медленно, глядя в окуляр, приподнять тубус микроскопа макро- винтом до появления изображения объекта; - далее четкость изображения поддерживать микровинтом. 8. После завершения изучения и зарисовки микропрепарата следует: - вращением револьвера установить объектив малого увеличения; - снять микропрепарат с предметного столика. Работа № 3. Строение животной клетки Перед выполнением работы ознакомьтесь с обобщенной схемой разреза яичника млекопитающего (Рис.1). Яичник является местом образования женских половых клеток. У млекопитающих в яичниках содержатся не яйцеклетки, а клетки-предшественники, находящиеся на той или иной стадии овогенеза. Рис. 1. Схема разреза яичника млекопитающего 1 – первичный фолликул, 2 – растущий фолликул, 3 – созревающий фолликул, 4 – Граафов пузырек, 5 – разорвавшийся фолликул 8 Рассмотрите постоянный микропрепарат «Яичник млекопитающего» при малом увеличении микроскопа (объектив – 8 х). В корковом (наружном) слое яичника располагаются растущие фолликулы – овоциты I-го порядка, окруженные слоями фолликулярных клеток. Между овоцитом и окружающими его фолликулярными клетками имеется толстая прозрачная оболочка – zona pellucida (блестящая оболочка). Выберите овоцит I-го порядка и установите его в центре поля зрения. Переведите микроскоп на большое увеличение (объектив – 40х) и изучите строение клетки. Овоцит имеет почти правильную округлую форму. В центре клетки располагается ядро с нитями хроматина и ядрышками. Цитоплазма овоцита равномерно заполнена относительно небольшим количеством питательных веществ. Фото 1. Строение овоцита В альбоме сделайте рисунок с обозначениями: цитоплазматическая мембрана, цитоплазма с питательными веществами, кариолемма, кариоплазма, хроматиновые нити, ядрышки. Работа 4. Строение растительной клетки кожицы чешуи лука Возьмите дольку луковицы, отделите мясистую чешую и снимите пинцетом тонкую пленку, покрывающую чешую с внутренней стороны. Положите пленку на предметное стекло и капните на ее пипеткой раствор йода, накройте покровным стеклом и рассмотрите препарат при малом увеличении микроскопа (объектив – 8х). На препарате видны тесно прилегающие друг к другу клетки вытянутой, почти прямоугольной формы. В клетках можно увидеть округлое ядро, окрашенное йодом в желто-коричневый цвет. 9 Фото 2. Клетки кожицы лука При большом увеличении микроскопа найдите двухконтурную оболочку клетки, обратите внимание на зернистую структуру цитоплазмы. В цитоплазме некоторых клеток видны как бы пустоты – вакуоли с клеточным соком. Нарисуйте несколько клеток в альбом с обозначением их основных структур. * * * * * 10 Занятие № 2 Тема: Структурно-функциональная организация эукариотической клетки Цель: - изучить общий план строения животной клетки; морфологию и функции отдельных органоидов. Задачи: - разобрать строение и функции органоидов эукариотической клетки; - рассмотреть взаимосвязь органоидов в процессах жизнедеятельности клетки; - сформировать представление о клетке как открытой элементарной био- логической системе. В результате изучения данной темы студент должен знать: - отличия прокариотических и эукариотических клеток; - строение и функции плазмолеммы, органоидов общего и специального назначения, клеточных включений; - структурную организацию наследственного аппарата клеток. уметь: - анализировать различные органоиды и включения клеток при световой и электронной микроскопии; - экспериментально смоделировать состояние растительных и животных клеток (эритроциты человека) в различных средах (изотонической, гипер- тонической, гипотонической); - работать с лабораторным оборудованием, таблицами, рисунками. Вопросы для устного собеседования: 1 . Клетка – элементарная открытая биологическая система. Типы клеточной организации. Основные положения клеточной теории. 2. Строение плазмолеммы: надмембранный, мембранный и субмембранный комплексы. Медицинские аспекты функций плазмолеммы. 3. Строение ядра клетки: кариолемма, кариоплазма, хроматин, ядрышки. Понятие об эухроматине и гетерохроматине. Функции ядра. 4. Классификация органоидов клетки. Строение и функции мембранных ор- ганоидов клетки: митохондрии, эндоплазматическая сеть, пластинчатый комплекс, пероксисомы. 11 5. Органоиды внутриклеточного пищеварения: первичные и вторичные лизо- сомы, аутофаголизосомы, остаточные тельца. Понятие об аутолизе. 6. Немембранные органоиды клетки: рибосомы, филаменты, центриоли, рес- нички, жгутики. Цитоскелет клетки. 7. Биологическое и медицинское значение клеточных включений. Актуальность и мотивация к изучению темы. Клетка – это живая открытая биологическая система, способная к саморегуляции, само- обновлению и самовоспроизведению. Эти особенности функционирования клетки обеспечиваются различными структурами. Клеточные органоиды участвуют в постоянном потоке вещества, энергии и информации в клетке; воспринимают различные внешние раздражители (физические, механичес- кие, гормоны, медиаторы и т.д.), что, в свою очередь, влияет на функцио- нальную и митотическую активность клеток. Любой многоклеточный организм характеризуется чрезвычайным разнообразием клеток, в теле человека насчитывают более 200 различных типов клеток. Нейрон и гладкое мышечное волокно содержат сходные органоиды, а по морфологическому строению совершенно не похожи друг на друга. Особенности строения клетки обеспечивают специфичность ее функ- ции. Знания особенностей строения клеток позволяют определить не только их принадлежность к определенной ткани, но и выявить различные заболе- вания, причины которых связаны с нарушением функций отдельных органо- идов или клетки в целом. Поэтому для будущих врачей особое значение имеют слова одного из создателей клеточной теории Р.Вирхова о том, что любой патологический процесс в организме начинается на уровне клеток, а это следует учитывать при диагностике заболеваний человека. 12 Самостоятельная аудиторная работа Работа 1. Строение плазмолеммы Изучите и зарисуйте молекулярную структуру цитоплазматической мембраны (Рис.2). Обозначьте надмембранный, мембранный и субмембран- ный комплексы. Укажите типы белков, входящих в состав мембраны и их функции. Рис 2. Строение плазмолеммы Таблица 2 Строение и функции плазмолеммы Структурные компоненты Функции Надмембранный комплекс Мембранный комплекс Субмембранный комплекс Работа 2. Плазмолиз в клетках листа элодеи От ветки элодеи отделите лист, желательно молодой, ярко-зеленой окраски. На предметное стекло нанесите каплю воды, поместите в нее лист и накройте покровным стеклом. Рассмотрите препарат при малом увеличении микроскопа, найдите центральную жилку листа, образованную вытянутыми 13 клетками. Один из ее участков установите в центре поля зрения и рассмотрите при большом увеличении. Лист элодеи состоит из нескольких слоев клеток, поэтому для изучения клеток следует слегка вращать микровинт. Клетки листа имеют прямоугольную форму, в цитоплазме видны округлые тельца зеленого цвета – хлоропласты. Обратите внимание на движение хлоропластов. Какие причины приводят их в движение? Нанесите на один край покровного стекла каплю 10% раствора хлорида натрия, а с противоположной стороны положите полоску фильтровальной бумаги. Наблюдайте за состоянием цитоплазмы в клетках при большом увеличении микроскопа. Вода из цитоплазмы клеток будет переходить в окружающую гипертоническую среду. Объем цитоплазмы при этом уменьшится, и она начнет отходить от клеточных стенок. Постепенно цитоплазма приобретет форму шара. Это явление называется плазмолиз. Зарисуйте в альбоме строение нормальной клетки листа элодеи и клетку с явлением плазмолиза. А Б Фото 3. Строение клеток листа элодеи (А) и явление плазмолиза (Б) 14 Работа 3. Пластинчатый комплекс в нервных клетках спинального ганглия Рассмотрите препарат при малом увеличении микроскопа. Найдите крупные, округлой формы клетки, расположенные группами и разделенные пучками волокон. Клетки имеют сероватый цвет, ядро светлое, практически неокрашенное. При большом увеличении в цитоплазме вокруг ядра можно увидеть фрагменты пластинчатого комплекса в виде темно-коричневых изогнутых нитей. Выберите клетку с хорошо выраженным пластинчатым комплексом и зарисуйте ее с обозначениями: ядро, ядрышко, пластинчатый комплекс. Фото 4. Комплекс Гольджи в нервных клетках спинального ганглия (окраска: азотно-кислое серебро) 1 – пластинчатый комплекс; 2 – ядра нейронов Работа 4. Пигментные включения в эпителии кожи головастика На малом увеличении микроскопа найдите клетки отросчатой формы, в теле которых видна коричневая зернистость. Рассмотрите препарат на большом увеличении, обратите внимание на зернышки пигмента меланина в цитоплазме клеток. Ядра клеток не видны, однако в том месте, где они располагаются, пигмента мало. Зарисуйте клетку с обозначениями: цитоплазма, зерна пигмента. * * * * * 15 Самостоятельная внеаудиторная работа Задание 1. На этой веселой картинке (Рис. 3) обозначены функции органоидов клетки. Определите эти органоиды и запишите функции, которые они выполняют. Какие органоиды эукариотической клетки не обозначены на рисунке? Придумайте символические рисунки, обозначающие функции этих органоидов. Рис. 3. Обобщенная схема строения клетки Вопросы для самоконтроля: 1. Какие существуют гипотезы происхождения эукариотических клеток? 2. Какими свойствами мембраны можно объяснить ее участие в эндоцитозе и экзоцитозе? 3. Какие органоиды эукариотической клетки являются полуавтономными? Какой биологический смысл имеет это явление? 4. Какие клеточные структуры формируют вакуолярную систему клетки? Назовите основные функции этих структур. 16 5. Что означают термины «аутолиз» и «аутофагия»? Какой биологический смысл имеют эти события? 6. При различных интоксикациях организма (например, алкогольной) в клет- ках печени обнаруживаются увеличенные в размерах митохондрии. Как можно объяснить эти изменения органоидов клетки? 7. В норме рН гиалоплазмы клетки слабощелочная. Какие причины могут изменить рН гиалоплазмы в кислую сторону? Какие при этом возникнут последствия? 8. В медицине известен синдром «неподвижных ресничек». Какие нарушения могут возникнуть в организме больных при этом синдроме? К каким по- следствиям они приведут? Темы учебно-исследовательской работы студентов: 1. Современные методы изучения клеток. 2. История возникновения и современное состояние клеточной теории. 3. Клеточные включения: норма и патология. 4. Патология органоидов эукариотической клетки. * * * * * Словарь терминов Активный транспорт – перенос через мембрану клетки веществ против градиента их концентраций; осуществляется с помощью белков- переносчиков и требует затрат энергии (АТФ). Аутофагия – процесс разрушения лизосомами структурных компонентов собственной клетки, выработавших свой ресурс. Включения – временные и необязательные компоненты клетки, которые могут образовываться как при нормальном функционировании, так и при различных патологических состояниях. Гетерофагия – процесс разрушения лизосомами внеклеточных веществ, поступивших в клетку путем эндоцитоза. Гетерохроматин – конденсированные (cпирализованные) участки хромати- новых нитей, для которых характерна низкая транскрипционная активность. 17 Гиалоплазма (цитоплазматический матрикс, цитозоль)– часть цитоплазмы, занимающая пространство между органоидами клетки; представляет собой коллоидную систему, которая может изменяться по типу гель-золь. Гистоны – эволюционно консервативные белки эукариот, связанные ДНК; участвуют в формировании структурных единиц хроматина – нуклеосом. Гликокаликс – надмембранный комплекс плазмолеммы, представлен глико- протеинами и гликолипидами; выполняет рецепторную функцию, участвует в адгезии (слипании) клеток и пристеночном пищеварении. Диктиосома– структурно-функциональная единица комплекса Гольджи; состоит из стопки одномембранных мешочков, внутренние полости которых не сообщаются друг с другом. Кариолемма– ядерная оболочка, состоящая из двух мембран, разделенных перинуклеарным пространством; содержит ядерные поры, обеспечивающие транспорт высокомолекулярных веществ: из ядра в цитоплазму – РНК и субъединицы рибосом, из цитоплазмы в ядро – синтезируемые клеткой белки и другие органические вещества. Кариоплазма(нуклеоплазма) – жидкий компонент ядра, заполняющий пространство между ядерными структурами; коллоидный раствор, содер- жащий различные белки, ферменты, нуклеотиды, минеральные соли. Компартментация клетки – разделение объема клетки на отдельные части, отличающиеся химическим составом и локализованными в них органоидами. Микротрубочки – немембранный органоид клетки в виде полого цилиндра, стенка которого образована белком тубулином; входят в состав цитоскелета, центриолей, веретена деления, ресничек и жгутиков. Опосредованный рецепторами эндоцитоз – способ поступления веществ внутрь клетки, в котором участвуют специфические рецепторы, располо- женные в области эндоцитозных ямок. Таким способом в клетки поступают иммуноглобулины, факторы роста клеток, липопротеины низкой плотности, вирусы. Органоид – постоянная структура клетки, выполняющая специфические функции. Различают органоиды общего значения (имеются во всех клетках растений и животных) и специализированные органоиды, обеспечивающие особые функции клеток, например, движение или сокращение. Пиноцитоз – процесс поглощения клеткой жидкости и растворенных в ней веществ с формированием в гиалоплазме эндоцитозных пузырьков. Полисома – несколько рибосом, присоединенных к одной информационной РНК; формируется для ускорения образования в клетке определенного белка. Рецептор – а)белковый компонент цитоплазматической мембраны клетки, способный взаимодействовать с определенным биологически активным веществом (гормон, цитокин, фактор роста клеток, нейромедиатор, антиген и др.); б) нервное окончание или специализированная клетка, способная реагировать на специфический раздражитель. Транспорт пассивный – перенос через мембрану клетки веществ по градиенту концентрации без затрат энергии. Путем простой диффузии 18 переносятся малые неполярные молекулы (О 2 , СО 2 , N 2 , Н 2 ); гидрофильные молекулы и ионы переносятся с помощью белков-переносчиков (облегченная диффузия). Фагоцитоз – процесс захватывания и поглощения клеткой крупных частиц: вирусов, бактерий, остатков разрушенных клеток или экзогенных инородных частиц с последующим их слиянием с лизосомами и формированием фаго- лизосом. Филаменты – нитевидные структуры клетки, которые содержат сократи- тельные белки (актин, миозин, тропомиозин и др.); входят в состав цитоскелета, а также участвуют в формировании сократительного кольца при делении клетки. Хроматин– интерфазная форма существования хромосом, по строению пре- дставляет собой нуклеопротеидный комплекс – ядерная ДНК, связанная с гистоновыми и негистоновыми белками. Циклоз– внутриклеточное циклическое движение гиалоплазмы. Цитоплазма – структурный компонент клетки, заполняющий пространство между ядром и плазмолеммой. Состоит из гиалоплазмы, органоидов и клето- чных включений. Цитоскелет – объемная (трехмерная) цитоплазматическая сеть, состоящая из микротрубочек, филаментов и микротрабекул; участвует в поддержании фор- мы клетки и компартментации ее объема, обеспечивает внутриклеточный транспорт органоидов и движение гиалоплазмы клетки. Экзоцитоз – процесс, при котором внутриклеточные секреторные гранулы сливаются с плазмолеммой, затем их содержимое выводится из клетки. Эндоцитоз – транспорт веществ внутрь клетки. Основные механизмы эндоцитоза: пиноцитоз, фагоцитоз, опосредованный рецепторами эндоцитоз, активный и пассивный транспорт. Эухроматин – деспирализованные участки хроматиновой нити, которые содержат большое количество структурных генов и характеризуются высо- кой транскрипционной активностью. Ядрышко – плотное образование сферической формы, обнаруживается в ядре неделящейся клетки и исчезает в профазу митоза; образуются на хромосомах, имеющих вторичную перетяжку. Ядрышковый организатор содержит гены, кодирующие рибосомную РНК. * * * * * Рекомендуемая литература: 1. Лекционный материал. 2. Биология. В 2 кн.: Учебник для медицинских специальностей вузов/ под ред. В.Н.Ярыгина. – М.: Высшая школа, 2007. – Книга 1, с. 38 – 51. 3. Биология: учебник: в 2 т. /под ред. В.Н.Ярыгина. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 19 2014. – Т.1, с. 95 – 120, 139 – 154. 4. Цитология (учебное пособие для студентов медицинских ВУЗов) под ред. Зайцева В.Б., Киров, Кировская государственная медицинская академия, 2001, 64 с. 20 Занятие № 3 |