Методичка по микробиологии. Методические рекомендации для студентов, в том числе для самостоятельной аудиторной и внеаудиторной работы
 Скачать 1.09 Mb.
|
|
Тема: БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБОВ. Цель: научиться учитывать результаты и оценивать биохимические свойства бактерий. Усвоить методы выращивания и схему выделения чистой культуры анаэробов. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
по ферментативной активности.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
Работа №1: Среды для определения сахаролитических свойств бактерий. Жидкие среды. 1)Среда Гисса (___________________________________________)  до К   исходная до КГ 2) Среда Раппопорта (_______________________________________). Элективная для сальмонелл. Разливается в бутылки или колбы. Среда Раппопорта  Исходная до К до КГ Плотные среды 1)Эндо, Левина, Плоскирева – среды на выявление энтеробактерий (МПА + ____________+ щелочной индикатор: в Эндо –___________, в Левина–___________________________, в Плоскирева –______________________, последняя еще имеет соли желчных кислот и бриллиантовую зелень, которые подавляют рост кишечной палочки). Лак (+) Лак (+) Лак(+)  Лак (-) Лак (-) Лак (-) Эндо Левина Плоскирева Бактерии, расщепляющие лактозу -lac(+), дают окрашенные колонии, потому, что___________________________________________________. Бактерии, не расщепляющие лактозу – lac(-) дают бесцветные колонии. Среда Олькеницкого (__________________________________________ ____________________________________). Среда развивается в виде скоса, используется для выделения чистой культуры энтеробактерий.  Лактоза до КГ - Глюкоза до КГ до К Работа № 2: «Пестрый ряд» кишечной палочки «Пестрый ряд» состоит из набора сред Гиса и МПБ с индикаторными бумажками на определение конечных продуктов расщепления белков. Лак- Глю- Ман- Маль- Саха- МПБ тоза коза нит тоза роза  индолH2S Результат: кишечная палочка ферментирует ____________________ __________________________________________________________ __________________________________________________________ Работа № 3: Факторы патогенности стафилококка 1. Лецитовиттелаза (лецитиназа) – разрушает лецитин клеточных стенок, выявляется при посеве на ЖСА (МПА + яичная взвесь + 10% хлорид натрия).  ЖСА lec (+) lec (-) 2. Плазмокоагулаза – сворачивает плазму. Посев проводят в 0,5 мл плазмы крови кролика.   исходная сгусток 3. Гемолизин – токсин, расщепляющий эритроциты. Определяется на кровяном агаре (КА) КАгем (+) гем (-) 4. Фибринолизин – токсин, расплавляющий фибрин. Определяется посевом в свернутую кровь.   сгусток крови лизис сгустка Работа № 4: Способы создания анаэробных условий. Метод Перетца Принцип: _________________________  _________________________Метод Фортнера Принцип:  ________________________________________________ аэроб анаэроб Метод Горовец-Власовой. Принцип: ________________________ ________________________ аэроб анаэроб Трубки Вейон-Виньяля Принцип: _________________________ _________________________  Работа 5: Среды для выращивания анаэробов 1. Среда Цейсслера (глюкозо – кровяной агар) в чашке Петри Принцип:___________________________ ___________________________ 2. Среда Китта-Тароцци (сахарный бульон, кусочки паренхиматозных органов, высокий столбик, слой вазелинового масла). Принцип:  ____________________________________________ исходная с ростом 3. Среда Вильсона-Блера - железосульфитный агар ( 3% МПА + 1% глюкозы+ 20% сульфит натрия + 8% хлорид железа) разливают высоким столбиком, сверху вазелиновое масло. Позволяет выявить сероводородную активность  Принцип:  ____________________________________________ исходная с ростом.
5. Молоко по Тукаеву (1% пептонная вода + 5% обезжиренного молока) используется для выявления протеолитической активности бактерий. Работа 6: Рост анаэробов при посеве на молоко. Большинство анаэробов вызывают створаживание молока. Для приготовления мазка стерильной бактериологической петлей берут содержимое пробирки со дна пробирки. Окрашивают по Граму. Клостридии представляют крупные Грам (+) палочки с непрокрашенными терминальными или субтерминальными спорами. Клостридии Грам (+) Работа № 7: Схема выделения чистой культуры анаэробов. I этап. Изучение исследуемого материала: а) микроскопия, б) посев в 5 пробирок со средой Китта-Тароцци (сразу после ее прогревания на водяной бане при t 80 0С 15-20 мин и быстрым охлаждением). II этап. Изучение культуральных свойств (характер изменения среды Китта-Тароцци) и получение изолированных колоний по методу Вейнберга(разведения в расплавленном сахарном агаре с последующим помещением в трубки Вейон-Виньяля) - .      или по методу Цейсслера (посев с разобщением на глюкозо – кровяной агар)  III этап. Изучение колоний. Отсев на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры. IV этап. Изучение чистой культуры а) морфологические и тинкториальные свойства - мазок в окраске по Граму, Гинсу, Ожешко; б) биохимические – «пестрый» ряд, посев в молоко, на среду Вильсона-Блера и др., в) антигенные и токсигенные свойства - на лабораторных животных. V этап. Учет результатов Заключение о виде. Работа № 8: Изучение чистой культуры, выделенной самостоятельно при проведении УИРС 1. Культуральные свойства: 2. Морфологические и тинкториальные свойства в окраске по Граму: ___________________ Грам ( ) Подпись преподавателя_____________________ Вопросы для самоконтроля:
Лабораторное занятие № 7 Тема: КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ. БАКТЕРИОФАГИ. Цель: усвоить методы культивирования и индикации вирусов, методы получения и титрования бактериофагов и их практическое использование. ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА:
вируссодержащим материалом. Провести вскрытие ранее зараженного эмбриона, визуально оценить состояние оболочек.
а) цитопатическое действие - промикроскопировать и зарисовать культуры фибробластов в норме и с ЦПД; б) реакция гемагглютинации – поставить РГА для индикации вируса в исследуемом материале, оценить и зарисовать; в) реакция гемадсорбции – зарисовать с таблицы; г) включения в пораженных клетках – зарисовать с таблиц тельца Бабеша-Негри при бешенстве, тельца Гварниери при натуральной оспе, внутриядерные включения при аденовирусной инфекции; д) реакция бляшкообразования – с таблицы; е) «цветная проба» - зарисовать и оценить готовую реакцию.
бактериофага.
и по Грациа.
фаголизиса и фаготипирования.
и профилактики заболеваний. 10. Уборка рабочего места. 11. Защита протокола. Работа № 1: Техника овоскопии, заражения и вскрытия куриного эмбриона. Овоскопия: поместить эмбрион на овоскоп и карандашом отметить границу воздушной полости. Строение 12-дневного куриного эмбриона  воздушная хорион - аллантоисная полость оболочка (ХАО) эмбрион аллантоисная полость амниотическая желточный мешок полость белок Заражение: скорлупу над воздушной полостью протирают спиртом, обжигают на огне, смазывают 2% настойкой йода, снова протирают спиртом и обжигают. Для заражения на ХАО изогнутыми ножницами срезают скорлупу над воздушной полостью, пинцетом снимают часть подскорлупной оболочки, исследуемый материал в объеме ________ наносят на ХАО (конец иглы не должен быть ниже границы воздушной полости). Отверстие в скорлупе закрывают покровным стеклом и заливают воском или парафином. Для заражения в аллантоисную полость через прокол в скорлупе вводят иглу шприца так, чтобы конец иглы был ниже уровня воздушной полости на ______. Отверстие в скорлупе заливают воском. Вскрытие куриных эмбрионов проводят с соблюдением правил асептики. Скорлупу над воздушной полостью обрабатывают так же, как при заражении, и срезают ножницами чуть выше границы прикрепления хорион-аллантоисной оболочки. Визуально оценивают состояние ХАО (помутнение, наличие бляшин и т.д.). Аллантоисную жидкость насасывают пипеткой после прокола ХАО в месте, лишенном крупных кровеносных сосудов. Затем ХАО разрезают ножницами и через отверстие выливают все содержимое в чашку Петри. Амниотический мешок так же разрезают, освобождают от эмбриона, просматривают на наличие поражений. Работа №2: Культуры клеток для культивирования вирусов.
Работа №3: Питательные среды для культур клеток: 1. Сбалансированные солевые растворы - раствор Эрла, Хенкса 2. Ростовые среды: а) естественные – среда Эндерса:_______________________________ б) гидролизаты – _____________________________________________ в) синтетические – среда Игла:__________________________________ среда 199:___________________________________ _______________________________________________ Перед использованием ко всем средам добавляется________________ _____________________. Большинство сред содержат индикатор – феноловый красный, чтобы оценивать состояние культур клеток (если его нет, то необходимо внести в среду). Работа №4: Методы индикации вирусов а) цитопатическое действие (ЦПД)- культуры клеток изучают под малым увеличением микроскопа в исходном состоянии или после окраски анилиновыми красителями. Нормальные клетки фибробластов располагаются на стекле в виде монослоя и имеют четко выраженную структуру. Вирусы при размножении в клетках вызывают их дегенерацию. нормальные ЦПД - фибробласты дегенерация б) реакция гемагглютинации – РГА: Компоненты: 1) смыв из носа - вируссодержащий материал 2) 1% взвесь куриных эритроцитов. Механизм реакции:___________________________________________ ___________________________________________________________ ____________________________________________________________
Результат: Заключение: в исследуемом материале содержится вирус, потому что ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ в) реакция гемадсорбции – РГадспроводится на ХАО куриного эмбриона или на культуре клеток после внесения на них исследуемого материала. Если в исследуемом материале есть вирус, то после добавлении взвеси куриных эритроцитов, эритроциты приклеиваются – адсорбируются на клетках. Изучают РГадс на ХАО – невооруженным глазом, на культуре клеток – под малым увеличением микроскопа. г) включения в пораженных клетках цитоплазматические - тельца Бабеша-Негри при бешенстве тельца Гварниери при натуральной оспе внутриядерные - при аденовирусной инфекции д) реакция бляшкообразования На монослое культуры клеток во флаконах Кареля под агаровым покрытием образуются ограниченные участки разрушенных вирусом клеток - бляшки или негативные колонии, которые отличаются по форме и размерам.   е) «цветная проба» - учесть результат готовой реакции Культура клеток культура клеток Среда 199 исследуемый материал Среда 199 Результат: в исследуемом материале содержится вирус, потому что ___________________________________________________________________________________________________________________________ Работа №5: Строение бактериофага. головка нуклеиновая кислота отросток чехол шипики базальная пластинка Работа № 6: Получение бактериофагов. 1._____________________________________________________ 2._____________________________________________________ 3._____________________________________________________ 4. _____________________________________________________ 5. _____________________________________________________ 6. _____________________________________________________ Работа № 7: Методы титрования фагов.
Полученный фаг разводится ___________________________________ _______________________ В каждое разведение вносится ___________ количество культуры бактерий. Инкубация в термостате.  10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 КК КФ Механизм реакции:_____________________________________________ _____________________________________________________________ Титр фага (ТФ) – то __________________разведение, при котором еще ________________________________________. Результат: Титр фага =____________________ 2. Титрование по методу Грациа Из разведения 10 -4 количество негативных колоний -_______ Титр фага по Грациа – количество фаговых частиц на 1 мл. Результат: титр фага по Грациа =______________________ Работа №8: Методы фагодиагностики:
 Холерный бактериофаг стерильная дорожка Заключение:_________________________________________ __________________________________________________________
фаг 29 фаг 52 фаг 47 фаг 80 Заключение: ___________________________________________ Реакция фаготипирования стафилококков используется для установления источника инфекции. Работа № 9: Диагностические и лечебно-профилактические фаги. Диагностические фаги: 1)___________________________для_____________________________; 2)______________________________для_____________________________________________________________ Лечебно-профилактические: 1)__________________________________ 2)__________________________________ Вопросы для самоконтроля:
Лабораторное занятие №8. |