Хроматографические методы анализа. Методическое пособие для специального курса Ответственный редактор Чл корр. Ран, профессор О. А. Шпигун Москва, 2007 2
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова Химический факультет Кафедра аналитической химии Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. Хроматографические методы анализа Методическое пособие для специального курса Ответственный редактор Чл.-корр. РАН, профессор О.А.Шпигун Москва, 2007 2 Настоящее пособие составлено в соответствии с программой практических занятий и лекций специального курса «Хроматографические методы анализа» для студентов 4 – 5 курсов химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Пособие содержит описание практических работ (раздел 6), выполняемых студентами в рамках спецпрактикума по хроматографическим методам. Для лучшего понимания материала и освоения практических навыков в анализе объектов окружающей среды перед описанием практических работ в пособии представлен теоретический материал по отдельным разделам газовой, высокоэффективной жидкостной, планарной хроматографии и капиллярному электрофорезу (разделы 1– 5). Раздел 7 посвящен особенностям эксплуатации хроматографических колонок для ВЭЖХ. Для закрепления полученных знаний в разделе 8 приводятся вопросы по рассмотренным вариантам хроматографии. Авторы благодарят к.х.н. Глазкова И.Н. и м.н.с Бендрышева А.А. за предоставленные материалы при написании пособия. Все замечания и пожелания студентов и преподавателей будут приняты авторами с глубокой благодарностью. 3 Оглавление стр 1. Основные положения хроматографии 4 2. Газовая хроматография 11 2.2. Газо-адсорбционная хроматография 21 2.3. Газо-жидкостная хроматография 30 2.3. Капиллярная газовая хроматография 34 2.4. Реакционная газовая хроматография 46 2.5. Хромато-масс-спектрометрия 51 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография 57 3.1. Молекулярная адсорбционная хроматография 58 3.1.1. Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) 63 3.1.2. Использование ОФ ВЭЖХ для решения экологических задач 74 3.2. Ионная хроматография 96 4. Планарная (тонкослойная) хроматография 110 5. Капиллярный электрофорез 130 6. Практические работы 143 7. Особенности эксплуатации колонок для ВЭЖХ 177 7.1. Подготовка растворителя и пробы 177 7.2. Типичные неисправности, способы обнаружения и устранения 180 7.3. Методические аспекты обеспечения высокой эффективности колонки 182 7.4. Проблемы изменения селективности колонок 189 7.5. Проблемы воспроизводимости между параллельными вводами пробы 191 7.6. Регенерация загрязненных колонок 194 8. Вопросы 197 9. Литература 203 4 Хроматография в настоящее время является наиболее широко используемым методом исследования объектов окружающей среды. Хроматографический метод был предложен в 1903 году русским ученым М.С. Цветом. Он писал: «При фильтрации смешанного раствора через столб адсорбента пигменты… расслаиваются в виде отдельных, различно окрашенных зон. Подобно световым лучам в спектре, различные компоненты сложного пигмента закономерно распределяются друг за другом в столбе адсорбента и становятся доступными качественному определению. Такой рассчвеченный препарат я назвал хроматограммой, а соответствующий метод анализа хроматографическим методом. Работы М.С.Цвета послужили фундаментом для развития остальных видов хроматографии для разделения как окрашенных, так и неокрашенных соединений, осуществляемых в любых средах. 1. Основные положения хроматографии Хроматография – это метод разделения и определения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижной (стационарной) фазой служит твердое пористое вещество (часто его называют сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу, иногда под давлением. Компоненты анализируемой смеси (сорбаты) вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Ее обычно помещают в стеклянную или металлическую трубку, называемую колонкой. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента (за счет адсорбции или по какому-либо другому механизму) компоненты будут 5 перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут колонку вместе с подвижной фазой (такие компоненты называются неудерживаемыми, а время их удерживания определяет “мертвое время” колонки). Таким образом происходит быстрое разделение сложных смесей компонентов. Следует подчеркнуть следующие достоинcтва хроматографических методов: 1. Разделение носит динамический характер, причем акты сорбции- десорбции разделяемых компонентов повторяются многократно. Этим обусловлена значительно большая эффективность хроматографического разделения по сравнению со статическими методами сорбции и экстракции. 2. При разделении используют различные типы взаимодействия сорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных. Это обуславливает возможность селективного разделения широкого круга веществ. 3. На разделяемые вещества можно накладывать различные дополнительные поля (гравитационное, электрическое, магнитное и др.), которые, изменяя условия разделения, расширяют возможности хроматографии. 4. Хроматография – гибридный метод, сочетающий одновременное разделение и определения нескольких компонентов. 5. Хроматография позволяет решать как аналитические задачи (разделение, идентификация, определение), так и препаративные (очистка, выделение, концентрирование). Решение этих задач можно сочетать, выполняя их в режиме “on line”. 6 Многочисленные методы классифицируются по агрегатному состоянию фаз, механизму разделения и технике проведения разделения. Хроматографические методы различаются и по способу проведения процесса разделения на фронтальный, вытеснительный и элюентный. Для решения аналитический задач используется элюентный метод, он имеет следующие достоинства: – дает наиболее полное разделение, поскольку зоны сорбатов разделены зонами элюента; – сорбент непрерывно регенерируется; – параметры удерживания хорошо воспроизводимы. Элюентная хроматограмма, являющаяся зависимостью сигнала прибора (ось ординат) от времени или объема подвижной фазы (ось абсцисс), представляет собой совокупность пиков разделяемых компонентов. Обычно отдельный пик представляет собой гауссову кривую. Типичная хроматограмма приведена на рис. 1. - W(1) W(2) tm tR(1) tR(2) A t Рис. 1. Хроматограмма смеси двух веществ Рассмотрим основные хроматографические параметры, характеризующие поведение вещества в колонке. Время от момента ввода анализируемой пробы до момента регистрации максимума 7 хроматографического пика называют временем удерживания и обозначают – tR. Время удерживания складывается из двух составляющих – времени пребывания веществ в подвижной фазе (tm) и времени пребывания в неподвижной фазе (ts) Значение tm фактически равно времени прохождения через хроматограф несорбируемого компонента. Значение tR не зависит от количества пробы, вводимой в колонку, но зависит от природы вещества и сорбента (если изотерма сорбции вещества линейна), а также от упаковки сорбента и может меняться от колонки к колонке. Поэтому для характеристики истинной удерживающей способности колонки следует ввести исправленное время удерживания ( R t′ ) R t′ = tR – tm (1) Часто для характеристики удерживания используют удерживаемый объем – VR – объем подвижной фазы, который нужно пропустить через колонку с определенной скоростью, чтобы элюировать вещество: VR = F .tR (2), где F – объемная скорость потока подвижной фазы (см3/с) или (мл/мин). По полученной хроматограмме смеси (рис. 1) можно рассчитать экспериментальные значения хроматографических параметров: фактор удерживания (емкости) (k), коэффициент селективности (α), разрешение (R S ) и оценить эффективность хроматографической колонки. Фактор удерживания показывает во сколько раз дольше вещество пребывает в неподвижной фазе, чем в подвижной. Стараются выбирать условия хроматографического разделения таким образом, чтобы эта величина составляла от 1,5 до 4. k рассчитывают по формуле: 8 k = R m m R m m V V V t t t − = − (3) Расстояние между максимумами хроматографических пиков определяет селективность неподвижной фазы. Фактор разделения (коэффициент селективности) αесть мера относительного удерживания или относительной подвижности двух разделяемых веществ, и описывается уравнением: α = 1 2 R R t t ′ ′ = D2/D1 (4) Для разделения двух веществ необходимо подобрать условия разделения так, чтобы D1 ≠ D2 и α>1,00. Степень размывания хроматографического пика определяет эффективность колонки. Чем эффективнее колонка, тем уже пик, тем большее число компонентов можно разделить за более короткое время, т.е. время анализа сокращается. Количественно эффективность колонки может быть выражена числом теоретических тарелок N. Согласно концепции теоретических тарелок хроматографическую колонку представляют как ряд дискретных, соприкасающихся горизонтальных слоев, на которых мгновенно устанавливается равновесие между неподвижной и подвижной фазами, и акт сорбции-десорбции вещества повторяется многократно на каждом слое. Высота слоя – высота, эквивалентная теоретической тарелке, обозначается через H. Между параметрами существует соотношение: H = L/N (5), где L - длина колонки. Чем меньше H, тем большее число раз устанавливается равновесие между фазами при данной длине колонки, тем эффективнее разделение компонентов анализируемой смеси. 9 Из экспериментальных данных рассчитывают N по формуле: N = 2 16 W t R (6), где W – ширина пика у основания Разделение двух соседних пиков характеризуется разрешением Rs. Разрешение является мерой полноты разделения двух веществ. Разделение считается полным, если RS равно или больше 1,5. Суммарное влияние основных параметров хроматографической колонки (эффективности, селективности и коэффициентов удерживания) на разрешение хроматографических пиков описывается уравнением: RS = + − 2 2 2 1 1 4 1 k k N α α (7) Таким образом, полнота разделения компонентов является функцией D, RS, H и L. Полученная хроматограмма анализируемой смеси позволяет определить ее качественный и количественный состав. Качественной характеристикой определяемых веществ являются их времена удерживания (объемы удерживания) и другие характеристики удерживания ( R t′ , R V ′ , k, индексы удерживания). Для целей идентификации используют также корреляционные зависимости параметров удерживания с некоторыми физико-химическими свойствами соединений в гомологическом ряду (например, числом метиленовых групп, температурой кипения). Сопоставление площадей или высот хроматографических пиков позволяет оценить количественный состав смеси. В хроматографии используют три основных метода количественного анализа. 10 Метод абсолютной калибровки обычно предполагает построение градуировочного графика по стандартным смесям, как и в других физических методах. В методе внутренней нормализации предполагается, что пики всех возможных компонентов смеси зафиксированы на хроматограмме, и сумма их площадей (S) равна 100%. Различия в чувствительности детектора к разным компонентам учитывается введением поправочных коэффициентов (Ki). Расчет ведут по формуле: Х(%)= ( ) i i i i i n S K S K = ∑ 1 100 (8), где n - число компонентов смеси, S - площадь хроматографического пика, Ki - поправочные коэффициенты для каждого i-компонента. Метод внутреннего стандарта предусматривает введение в анализируемый образец известного количества эталонного соединения, хроматографирование полученной смеси и расчет по формуле: сi(%) = st st i kс S S (9), где сst - концентрация внутреннего стандарта введенного в пробу, k - поправочный множитель, который рассчитывают по стандартной смеси эталонного соединения и определяемого вещества по формуле k = Sst . .сi / Si .сst (10), где индекс i относится к определяемому веществу, а st - стандарту. В аналитической практике используют различные варианты хроматографического разделения: жидкостную или газовую; колоночную или плоскостную; адсорбционную, распределительную или ионообменную хроматографию. 11 2. Газовая хроматография Газовая хроматография – метод разделения летучих, термостабильных соединений. Этим требованиям отвечает около 5% известных органических соединений, но именно эти соединения оставляют 70-80 % соединений, которые использует человек в сфере производства и быта. Подвижной фазой служит инертный газ (газ-носитель), протекающий через неподвижную фазу, имеющую большую поверхность. В качестве подвижной фазы можно использовать водород, гелий, азот, аргон и углекислый газ. Наиболее часто используют азот, как более доступный и дешевый. Газ-носитель обеспечивает перенос разделяемых компонентов по хроматографической колонке и не взаимодействует ни с разделяемыми веществами, ни с неподвижной фазой. Достоинствами газовой хроматографии являются: – сравнительная простота аппаратурного оформления; – весьма широкие границы применимости (можно определять соединения, для которых достигается давление насыщенного пара 0,001-1 мм рт.ст.); – возможность определения с высокой точностью малых количеств газов органических соединений с высокой точностью; – быстрота анализа; – широкий выбор сорбентов и неподвижных фаз; – высокая гибкость изменения условий разделения; – возможность осуществления химических реакций в хроматографической колонке или детекторе, что расширяет круг анализируемых соединений (реакционная газовая хроматография); 12 – повышение информативности при сочетании с различными инструментальными методами (масс-спектрометрией и ИК(Фурье)спектрометрией). На рис. 2 показана принципиальная схема хроматографа. Газовый хроматограф представляет собой совокупность нескольких узлов. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рис. 2. Принципиальная схема газового хроматографа Стабилизация и очистка газовых потоков происходит в системе подготовки газов, которая состоит из баллона с газом-носителем (1) и блока подготовки газов (2). Блок подготовки газов включает: дроссель, регулятор давления, регулятор потока. Дозирование и ввод пробы осуществляется с помощью медицинского или микрошприца (для парообразной или жидкой пробы соответственно) или дозирующей петли (3). Пробы вводятся через резиновую мембрану в испаритель (4) – специальное устройство для испарения пробы. Затем потоком газа-носителя проба переносится в колонку (5), которая помещена в термостат (6). Для более точного дозирования или ввода нестандартных проб можно использовать специальные дозирующие устройства: 13 дозирование давлением; микродозатор-микродиппер (пробы < 1 мкл); устройство для ввода твердых проб; герметичные пробоотборные колонки. При введении пробы должны соблюдаться следующие условия: – минимальный водимый объем; – проба не должна быть направлена навстречу потока газа-носителя и искажать характеристики потока; – воспроизводимость пробы с большой степенью точности; – испарение без разложения; – смеси компонентов должны вводиться и испаряться без изменения состава; – количество вещества в пробе должно быть намного меньше емкости колонки. Система детектирования состоит из детектора (7) с блоком питания (8), усилителя сигнала детектора (9) и регистрирующего устройства (10). В систему детектирования может быть включен электронный интегратор, измеряющий параметры хроматографических пиков. Испаритель и детектор, как и колонку, термостатируют. В газовой хроматографии используют насадочные, капиллярные и поликапиллярные колонки, их сравнение показано в табл. 1. Использование капиллярных колонок позволяет существенно повысить эффективность разделения, а поликапиллярных – не только получить высокую эффективность, но и провести разделение за очень короткое время. На рис. 3. показано разделение смеси легких углеводородов из 12 компонентов за 15 сек. 14 |