Хроматографические методы анализа. Методическое пособие для специального курса Ответственный редактор Чл корр. Ран, профессор О. А. Шпигун Москва, 2007 2
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
Идентификация соединений - Определение компонентов 53 Различие состоит в том, что в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10 -5 -10 -6 Па), тогда как давление в хроматографической колонке 10 5 Па. Для понижения давления используют молекулярный сепаратор, который одним концом соединен с хроматографической колонкой, а другим с ионным источником масс- спектрометра. Сепаратор удаляет из газового потока, выходящего из колонки, основную часть газа-носителя, а органическое вещество пропускает в масс-спектрометр. Давление при этом понижается до рабочего давления масс-спектрометра. Для этого используют следующие процессы массопереноса: – эффузию через узкие поры и щели; – диффузию в расширяющейся газовой струе; – диффузию через полупроницаемые мембраны. Эти процессы используются в эффузионном, струйном и мембранном молекулярных сепараторах, соответственно. Для ионизации используют ионный удар, но более интересен другой способ ионизации – химическая ионизация. При этом способе источник ионов заполняется газом-реактантом, который ионизируется электронным ударом, а молекулы определяемых органических соединений превращаются в ионы за счет взаимодействия с ионами газа-реактанта или «медленными» электронами. Такая ионизация является «мягкой», то есть образовавшиеся ионы не разваливаются на мелкие фрагменты, а остаются в виде «молекулярного иона». Для ионизации лабильных органических соединений (в том числе биологически активных) разработаны специальные методы ионизации: ионизация в электроспрее (ESI) и ее подвид – химическая ионизация при атмосферном давлении (MALDI). Развитию хромато-масс-спекторметрии способствовало также создание «быстрых» квадрупольных масс-анализаторов. 54 Применение для решения экологических задач. Оснащенные современными компьютерами хромато-масс-спектрометры позволяют обнаружить в объектах окружающей среды множество химических веществ, в том числе, и токсичных. Впечатляющим примером достижений этого метода является его использование в работе космического аппарата, исследовавшего Марс с целью обнаружения жизни на этой планете. Масс- спектрометрическая установка выполнила анализ 14 образцов почвы с поверхности Марса. Никакой жизни обнаружено не было, несмотря на то, что предел обнаружения органических веществ составлял 10 -7 %. ГХ-МС широко используется для определения ЛОС в городском воздухе и воздухе рабочей зоны промышленных предприятий. Только с использованием этого метода можно получить детальную информацию о содержании приоритетных загрязнителей, к которым относятся ЛОС, в городском воздухе, их ПДК весьма низки и другие методы не могут справиться со столь сложной задачей. Наиболее ярким примером, характеризующим возможности ГХ-МС, является определение полихлорированных дибензо-п-диоксинов и родственных им полихлордибензофуранов. В настоящее время хромато- масс-спектрометрия является практически единственным приемлемым методом для определения в объектах окружающей среды этих чрезвычайно токсичных веществ. Сильное загрязнение поверхностных вод, попадание опасных соединений в подземные источники и водопроводную воду заставило экологов ужесточить контроль качества питьевой воды. Хромато-масс- спектрометрия – один из главных методов анализа воды, позволяющий идентифицировать большинство загрязнителей и определить их на уровне ПДК и ниже. На рис.13 показан один из примеров разделения сложной смеси веществ методом ГХ-МС, разделенные вещества и соответстуюшие им пики на хроматограмме показаны в табл.10 При контроле качества 55 воды наиболее важно определять ЛОС, диоксины, ПАУ, фенолы, пестициды. При определении ПАУ надежность их идентификации с помощью ГХ-МС не менее 80-95%, а чувствительность рутинных анализов составляет 0,1 мкг/л. При определении фенолов ГХ-МС их предварительно экстрагируют жидкостной или твердофазной экстракцией и затем переводят в ацетаты. Предел обнаружения фенолов и хлорфенолов составляет 5-20 нг/л. ГХ-МС относится к немногим методам, с помощью которых можно в сложной смеси органических загрязнений идентифицировать металлорганические соединения (на фоне других ЛОС). Рис. 13. Хроматограмма по полному ионному току смеси полициклических ароматических углеводородов, полихлорированных бифенилов, полинитроуглеводородов и хлорированных инсектицидов, экстрагированных из воды Определяют металлоорганические соединения олова, свинца, ртути и других тяжелых металлов. Обычно эти соединения переводят в летучие производные и обнаруживают ГХ-МС с высокой чувствительностью. 56 Таблица 10. Перечень летучих соединений на хроматограмме, показанной на рис.13 № пика Соединение № пика Соединение 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1,4-Дихлорбензол 1,3-Дихлорбензол Гексахлорэтан Нитробензол Изофорон Нафталин Гексахлорбутадиен Не идентифицирован Хлорнафтилен Аценафтилен Аценафтен Аценафтилен-d 10 2-Хлорбифенил 2,6-Динитротолуол 2,4-Динитротолуол α-НСН Гексахлорбензол 2,3-Дихлорбифенил Фенантрен Фенантрен-d 10 Антрацен Линдан 2,4,5-Трихлорбифенил Гептахлор 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 2,2’,4,4’-Тетрахлорбифенил Не идентифицирован Не идентифицирован 2,2’,3’,4,6-Пентахлорбифенил Флуорантен Эндосульфан/хлордан Еndrin keton Не идентифицирован 2,2’,4,4’,5,6’-Гексахлорбифенил Диэлдрин 4,4’-ДДД 4,4’-ДДТ Хризен Бензо[a]антрацен 2,2’,3,3’,4,4’,6-Гептахлорбифенил 2,2’,3,3’,4,5,6,6’-Октахлорбифенил Бензо[b]флурантен Бензо[k]флурантен Эндрин альдегид Не идентифицирован Бензо[a]пирен Дибензо[a,k]антрацен Инден[123-cd]пирен Например, С н для триметилпропилсвинца и диэтилдипропилсвинца составляет 0,05 и 0,8 нг/л (s r 0,018-0,032), предел обнаружения ртутьорганических соединений в биологических пробах составляет 0,2–1,4 нг/г. Единственной альтернативой в данном случае является ГХ с специфическим атомно-эмиссионным детектором. Хромато-масс-спектрометрия относится к наиболее мощным методам анализа почв. Круг определяемых соединений и подходы к анализу аналогичны методикам, используемым в анализе вод. 57 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография Жидкостная хроматография (ЖХ) - метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой является жидкость. Подвижная фаза в жидкостной хроматографии выполняет двоякую функцию: 1) обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке (подобно подвижной фазе в газовой хроматографии); 2) регулирует константы равновесия, а, следовательно, и удерживание в результате взаимодействия с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ. В ЖХ природа подвижной фазы имеет существенно большее значение. В результате комбинации ограниченного числа сорбентов и неограниченного числа, различных по составу, подвижных фаз возможно решение чрезвычайно большого числа встречающихся на практике задач. Метод ЖХ применим для разделения значительно более широкого круга веществ, чем газовая хроматография, поскольку большая часть веществ не обладает летучестью, а многие вещества неустойчивы при высоких температурах. В ЖХ разделение обычно происходит при комнатной температуре. ЖХ подразделяется на варианты в соответствии с характером основных проявляющихся межмолекулярных взаимодействий: – в ситовой хроматографии разделение компонентов осуществляется за счет разницы в растворимости молекул при их прохождении (фильтрации) через слой сорбента; – в адсорбционной хроматографии – за счет разницы в адсорбируемости молекул, проходящих через слой частиц сорбента, покрытых неподвижной фазой в виде тонкого слоя или поверхностнопривитых радикальных групп; – в ионообменной и ионной хроматографии – за счет разницы в способности к обмену ионами с ионообменниками; 58 Для анализа объектов окружающей среды наиболее широко используют ВЭЖХ в адсорбционном и ионообменном вариантах. 3.1. Молекулярная адсорбционная хроматография В зависимости от природы подвижной (ПФ) и неподвижной (НФ) фазы различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографию. В нормально-фазовой ВЭЖХ НФ – полярная (чаще всего силикагель), а ПФ – неполярная (гексан, либо смеси гексана с более полярными органическими растворителями – хлороформом, спиртами и т.д.). Удерживание веществ растет с увеличением их полярности. Разделения компонентов достигают, меняя элюрующую силу подвижной фазы, которая зависит от энергии взаимодействия компонентов ПФ с поверхностью НФ. В нормально-фазовой хроматографии элюирующая способность ПФ увеличивается с ростом ее полярности. В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза – неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С8, С18); ПФ – полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Наименьшей элюирующей способностью обладает вода, а для повышения элюирующей способности в ПФ вводят ацетонитрил, метанол и другие растворители. Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы. Подвижная фаза, прежде всего, должна растворять разделяемые компоненты. Основными характеристиками подвижных фаз являются ее элюирующая способность и селективность. Элюирующая способность подвижной фазы – это ее способность вступать в межмолекулярные взаимодействия с разделяемыми соединениями и группами на поверхности 59 сорбента. Эти взаимодействия способствуют десорбции разделяемых соединений, более быстрому перемещению хроматографических зон. Многократное увеличение гибкости метода ВЭЖХ достигается за счет применения в качестве подвижных фаз смесей растворителей. Принцип составления таких смесей прост. Необходимо взять два индивидуальных растворителя, один из которых имеет заведомо недостаточную элюирующую силу, а другой – заведомо избыточную, варьируя соотношение растворителей, можно получить нужную элюирующую способность. Под этим обычно имеют в виду, что на данном сорбенте данный сорбат будет иметь приемлемое значение фактора удерживания. Помимо элюирующей способности подвижная фаза должна обладать селективностью по отношению к компонентам разделяемой смеси. Селективность подвижных фаз связана с их способностью к специфическим взаимодействиям с сорбатами, определяемыми их структурными признаками. Благодаря разному характеру взаимодействий значение элюирующей способности по отношению к сорбатам различного строения будет отличаться, что и позволит их разделить. Селективность, как и элюирующая способность, определяется в первую очередь природой более сильного компонента смеси. Элюотропные ряды являются простейшей формой оценки силы индивидуальных растворителей. Они дают количественную оценку адсорбционной способности растворителей в тех или иных вариантах хроматографического разделения. Элюотропный ряд – это перечень растворителей расположенных в порядке возрастания элюирующей способности, которая может быть охарактеризована различными параметрами. В качестве таких параметров используют: – параметр адсорбционной силы растворителя ε 0 , который представляет собой относительную энергию взаимодействия молекул подвижной фазы с поверхностью адсорбента; 60 – параметр Р ’ (параметр Снайдера), который рассчитывают как сумму логарифмов коэффициентов распределения стандартных веществ (этанола, диоксана и нитрометана) между паровой фазой и испытуемым растворителем; – параметр S, который отражает чувствительность величин удерживания к изменению состава подвижной фазы. Эта величина предложена для ОФ ВЭЖХ. Свойства растворителей, используемых в ВЭЖХ приведены в табл. 11. Основой всех способов классификации селективностиявляется различная способность растворителей вступать в межмолекулярные взаимодействия различных типов, представление интегрального параметра элюирующей силы в виде суммы парциальных величин, характеризующих протонодонорные, протоноакцепторные, диполь-дипольные и некоторые другие свойства растворителей. Снайдер разбил 81 исследованный растворитель на восемь классов, которые определенным образом располагаются в треугольнике селективности (рис. 14). Его вершинам отвечают гипотетические растворители, способные к взаимодействиям только одного типа: Х е – протонодонорным, Х d – протоноакцепторным и Х n – диполь-дипольным. Окружности в его пределах изображают области соответствующие реально существующим растворителям, поделенным на восемь групп селективности: I – алифатические простые эфиры, амины; II – алифатические спирты; III – пиридины, тетрагидрофуран, амиды (кроме формамида); IV – гликоли, уксусная кислота, формамид; V – метиленхлорид, этиленхлорид; VI – алифатические кетоны и сложные эфиры, диоксан, сульфоны, нитрилы; VII – ароматические углеводороды, нитросоединения; VIII – фторированные спирты, вода, хлороформ. 61 Таблица 11. Свойства растворителей для ВЭЖХ Растворитель Предел прозрачности для УФ-света, нм Элюирующая сила ε 0 на силикагеле Параметр P’ Параметр S Группа селективности Ацетонитрил Вода Гексан Диоксан Метанол Метиленхлорид Пропанол-2 Тетрагидрофуран Толуол Триэтиламин Уксусная кислота Хлороформ Этанол Этилацетат 190 - 190 215 205 233 205 212 285 - - 245 210 256 0,50 1.50 0,01 0,45 0,7 0,32 0,55 0.44 0,1 - - 0,26 0,6 0,38 5,8 10.2 0,1 4.8 5,1 3,1 3,9 4,0 2,4 1,9 6,0 4,1 4,3 4,4 3,1 0,0 - 3,5 3.0 - 4,2 4,4 - - - -3,6 VI VIII - VI II V II III VII I VI VIII II VI 62 Рис. 14. Классификация растворителей по Снайдеру. Кругами выделены области, в которых группируются растворители по селективности: X e – способность к протонодонорным взаимодействиям; X d – способность к протоноакцепторным взаимодействиям; X n – способность к диполь-дипольным взаимодействиям. AB, CD и EF- тренды изменения способности к соответствующим взаимодействиям Этот наглядный подход позволяет предвидеть насколько вероятно изменение селективности при замене одного растворителя другим. Растворители одной группы сходны по селективности, максимального изменения селективности можно ожидать при замене одного растворителя на другой из группы, наиболее удаленной на треугольнике. Для улучшения разделения высокополярных и ионогенных компонентов и формы хроматографического пика в подвижную фазу вводят специфические добавки: фосфорную и уксусную кислоты при разделении соединений кислотного характера; аммиак и алифатические амины при разделении соединений основного характера, алкилсульфаты натрия при разделении соединений анионного характера, соли тетраалкиламмония при разделении соединений катионного характера. 63 3.1.1. Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) Обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ) имеет ряд преимуществ перед другими вариантами жидкостной хроматографии: – это очень гибкий метод, так как, изменяя состав водно- органических смесей, используемых в качестве подвижной фазы, можно на одной колонке обеспечить разделение соединений различной природы; – селективность данного метода почти всегда значительно выше, чем других вариантов хроматографии для всех соединений, кроме сильнополярных – при использовании гидрофобизированных силикагелей быстро устанавливается равновесие между подвижной и неподвижной фазой, эти сорбенты отличаются высокой эффективностью разделения; – можно осуществлять разделение соединений, растворимых как в воде, так и в органических растворителях; – возможность использования в подвижной фазе буферных растворов может улучшить селективность и эффективность разделения ионогенных соединений. В обращенно-фазовой хроматографии неподвижной фазой служат гирдофобизированные силикагели, которые получают при обработке силикагеля хлор- и алкоксисиланом. Широко в аналитической практике используют гидрофобизированные силикагели с привитыми окта- децильными группами (С 18 ) Плотность прививки составляет 1,1- 2,3 нм -2 В зависимости от способа обработки свойства гидрофобизированных силикагелей могут изменяться, поэтому свойства коммерческих колонок различных фирм несколько отличаются. Содержание углерода составляет 5-20%. Степень покрытия поверхности силикагеля органическим модификатором составляет 10-60%, в лучших случаях она достигает 90%. Наличие остаточных силанольных групп приводит к тому, что 64 адсорбционный и ионообменный механизмы удерживания всегда сопутствуют обращенно-фазовому. Для уменьшения числа силанольных групп сорбенты дополнительно обрабатывают триметилхлорсиланом (это называют эндкеппингом). В табл. 12 представлены типичные обращенно- фазовые сорбенты. Наиболее популярными являются силикагели следующих торговых марок: бондопак, лихросорб, порасил, сепарон, сферисорб, нуклеосил, кромасил. Недостатками обращенно-фазовых сорбентов на основе силикагеля являются ограниченно допустимый диапазон рН и сорбционная активность силанольных групп. Этого недостатка в значительной степени лишены колонки нового поколения фирмы «Феноминекс», ее колонка Луна С 18 обладает стабильностью в диапазоне значений рН 1,5-10. Механизм разделения соединений в этом варианте хроматографии пока до конца неясен. Наиболее удачными и распространенными являются теория, использующая представления о параметрах растворимости Гильдебранта, и сольвофобная теория Хорвата-Меландера. По теории, основанной на параметрах растворимости Гильдебранта, удерживание определяется молекулярными взаимодействиями разделяемых веществ с подвижной и неподвижной фазой. Зависимость фактора емкости вещества от состава подвижной фазы описывается уравнением lnk = Aφ 2 + Bφ + C (12), где φ – объемная доля органического компонента (модификатора) в подвижной фазе, А, В и С – константы. Однако поведение соединений сложного строения с несколькими функциональными группами часто не удается описать данной зависимостью. Более адекватно закономерности удерживания сорбатов в ОФ ВЭЖХ описываются сольвофобной теорией. Хорвартом и Миландером впервые было показано, что водные элюенты, не содержащие |