Хроматографические методы анализа. Методическое пособие для специального курса Ответственный редактор Чл корр. Ран, профессор О. А. Шпигун Москва, 2007 2
 Скачать 0.77 Mb.
|
|
Таблица 12. Сорбенты для обращенно-фазовой ВЭЖХ Сорбент S p , м 2 /г Диаметр пор, нм Диаметр частиц, мкм Форма частиц Адсорбсил С 8 Адсорбсил С 18 Адсорбсфер С 8 Адсорбсфер С 18 Алтима С 8 Алтима С 18 АльфаБонд С 8 АльфаБонд С 18 М-Бондопак С 18 М-Бондопак Фенил Гиперсил С 8 Гиперсил ОДС Зорбакс С 8 Зорбакс ОДС Диасорб-130-С1 Диасфер 130-С8 Диасфер-130-С18Т Лихросорб RP-2 Лихросорб RP 18 Луна С18 Луна С 8 Нуклеосил С 18 Партисил ОДС-3 Сепарон С 18 Силасорб С 2 Силасорб С 8 Силасорб С 18 Сферисорб С 18 450 450 200 200 300 300 300 300 170 170 350 350 300-350 300-350 300-350 300 300 6 6 8 8 10 10 12,5 12,5 10 10 10 10 7 7 11 11 11 6 10 10 5 10 10 10 10 10 5, 10 5, 10 3, 5, 10 3, 5, 10 5, 10 5, 10 5, 10 10 10 10 3, 5, 10 3, 5, 10 8 8 5, 7, 10 5, 7, 10 5, 7, 10 10 5, 10 3,5 5 3, 5, 7, 10 10 5,10 5, 7, 10, 15, 20 5, 7, 10, 15, 20 5, 7, 10, 15, 20 Нерегулярная Нерегулярная Сферическая Сферическая Сферическая Сферическая Нерегулярная Нерегулярная Нерегулярная Нерегулярная Сферическая Сферическая Сферическая Сферическая Нерегулярная Сферическая Сферическая Нерегулярная Сферическая Сферическая Сферическая Сферическая Нерегулярная Сферическая Нерегулярная Нерегулярная Нерегулярная Сферическая органических растворителей, могли быть использованы для разделения полярных биологических молекул на октадецилсиликагеле. Даже при отсутствии органического компонента в элюенте, взаимодействие между растворенным веществом и привитыми углеводородными радикалами 66 неподвижной фазы, являлось причиной удерживания растворенного вещества. Что позволило сделать вывод о том, что удерживание в обращено-фазовом варианте в основном определяется гидрофобными взаимодействиями. Важнейшую роль в понимании механизма удерживания обращенно- фазовой хроматографии сыграли работы Хорвата и его школы. Суть теории Хорвата заключается в следующем. Существует принципиальное различие между процессами сорбции на полярных поверхностях из относительно неполярных растворителей («нормально-фазовый режим») и сорбции из воды либо сильнополярных растворителей на неполярных поверхностях («обращенно-фазовый режим»). В первом случае, между молекулами сорбатов и неподвижных фаз образуются ассоциаты за счет кулоновских взаимодействий или водородных связей. Во втором случае, причиной ассоциации на поверхности являются так называемые сольвофобные взаимодействия в подвижной фазе. Для полярных подвижных фаз, в особенности содержащих воду, характерно сильное кулоновское взаимодействие и образование водородных связей между молекулами растворителей. Все молекулы в таких растворителях связаны довольно прочно межмолекулярными силами. Для того чтобы поместить в эту среду молекулу сорбата, необходимо образование «полости» между молекулами растворителя. Энергетические затраты на образование такой «полости» лишь частично покрываются за счет взаимодействия полярных групп в молекуле сорбата с полярными молекулами растворителя. В аналогичном положении по отношению к растворителю находятся и неполярные молекулы неподвижной фазы. С энергетической точки зрения более выгодно такое положение, когда поверхность раздела между полярной средой (растворителем) и неполярными фрагментами неподвижной фазы и молекул сорбата минимальна. Уменьшение этой поверхности и достигается при сорбции (рис. 15). 67 Рис. 15. К механизму обращенно-фазовой хроматографии: а — сорбат в растворе; б — сорбат на поверхности неподвижной фазы. Молекулы воды и органического растворителя обозначены светлыми и темными кружками соответственно. Обращенно-фазовая хроматография широко применяется не только для разделения нейтральных соединений, но и ионогенных веществ. В принципе, и для таких соединений процесс сорбции описывается сольвофобной теорией. Однако сорбаты такого рода существуют в растворе и адсорбированном состоянии, как в виде нейтральных молекул, так и в виде ионов. Каждой из этих форм соответствует свое значение фактора удерживания. В зависимости от рН среды изменяются соотношение различных форм в растворе и факторы удерживания. В качестве подвижной фазы обычно используют смеси растворителей, т.к. это позволяет улучшить селективность и эффективность разделения и уменьшить время необходимое для его проведения. Меняя состав подвижной фазы в ОФЖХ, можно изменять удерживание в очень широких пределах. Почти для всех анализируемых соединений удерживание в некоторых чистых растворителях (метанол, тетрагидрофуран) пренебрежимо мало, а в чистой воде чрезвычайно велико. Поэтому, чтобы добиться приемлемого времени удерживания, 68 обычно необходимо использовать смеси воды с органическим растворителем – так называемым модификатором. Зависимость фактора удерживания вещества от состава подвижной фазы описывается уравнением lgk = b +pC (13), где C – концентрация органического компонента (модификатора) в подвижной фазе, b и p – константы. При постоянных условиях хроматографирования удерживание различных сорбатов определяется следующими факторами: – гидрофобностью сорбатов; – дипольным моментом; – объемом их молекул; – поляризуемостью; – уменьшением площади неполярной поверхности при сорбции. При описании взаимосвязи удерживания и свойств сорбатов наиболее популярны уравнения, связывающие факторы удерживания, измеряемые в хроматографической системе, с коэффициентами распределения (чаще всего в системе октанол – вода). Для соединений близкой структуры наблюдается линейная зависимость между логарифмами коэффициентов распределения ифакторами удерживания: lgk' = a + blgPi (14) , где Pi,j — коэффициент распределения вещества между водной и органической фазами. Во многих случаях логарифм фактора удерживания линейно связан с числом повторяющихся структурных фрагментов: lgk' = a + bn (15) . Самым распространенным дескриптором является число атомов углерода. Эти соотношения полезны как при подборе состава подвижной фазы как при разделении, так и для идентификации компонентов смеси. 69 Для решения каждой конкретной задачи состав как подвижной, так и неподвижной фазы должен быть тщательно подобран с точки зрения как физических, так и химических свойств ее компонентов. Общая схема выбора варианта ВЭЖХ в зависимости от природы разделяемых веществ показана на рис. 16 Система для проведения разделения методом ВЭЖХ состоит из нескольких блоков: насоса, дозатора, колонки, детектора и регистрирующего устройства. Рассмотрим основные типы насосов, используемых в ВЭЖХ. Шприцевые насосы.Вращение прецизионного синхронного двигателя преобразуется в перемещение поршня в цилиндре. При движении поршня подвижная фаза либо поступает в цилиндр, либо выдавливается из него. Преимущество данного типа насоса – практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы, недостаток – невозможность создания градиента с помощью одного насоса. Пневмоусилительные насосы. Обеспечивают постоянное давление на входе в колонку. Преимущества – отсутствие пульсаций потока, высокая надежность; недостаток – невысокая воспроизводимость объемной подачи подвижной фазы. Плунжерные возвратно-поступательные насосы. С помощью электромеханического устройства приводится в возвратно-поступательное движение плунжер, перемещающийся в рабочей головке, в результате чего насос либо набирает подвижную фазу, либо подает ее с заданной скоростью. Преимущество – постоянная объемная подача подвижной фазы, недостаток – довольно большие пульсации потока, которые являются основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности детектора. 70 Рис. 16. Выбор условий ВЭЖХ с учетом гидрофобности разделяемых веществ 71 Для ввода пробы в жидкостной хроматографии используют следующие типы дозаторов: – дозирующая петля – дозаторы с мембраной (без остановки потока и с остановкой потока). Основные виды детекторов и их характеристики приведены в табл. 13. Наиболее распространенным детектором в адсорбционной ВЭЖХ является спектрофотометрический. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны, соответствующей максимуму поглощения определяемых веществ. Такие детекторы измеряют поглощение света в ультрафиолетовой или видимой области спектра, причем первый вариант используется чаще. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно интенсивные полосы поглощения в диапазоне длин волн 200-360 нм. Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность. Чувствительность УФ-детектора может достигать 0,001 ед. оптической плотности на шкалу при 1% шума. При такой высокой чувствительности может быть зафиксировано до нескольких нг даже слабо поглощающих УФ веществ. Широкая область линейности детектора позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты смеси на одной хроматограмме. Возможности спектрофотометрического детектора существенно расширились после появления его современного аналога – детектора на диодной матрице (ДДМ), работающего как в УФ-, так и видимой области. В таком детекторе «матрица» фотодиодов (их более 200) постоянно регистрирует поглощение электромагнитного излучения в режиме сканирования. Это позволяет снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через 72 ячейку детектора компонентов. По сравнению с детектированием на одной длине волны, сравнение спектров, полученных в процессе элюирования пика, позволяет идентифицировать разделяемые компоненты с гораздо большей степенью достоверности. Принцип действия флуориметрического детектора основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в УФ-области спектра, длины волн флуоресцентного излучения превышают длины волн поглощенного света. Флуориметрические детекторы обладают очень высокой чувствительностью и селективностью. Наиболее важная область их применение детектирование ароматических полициклических углеводородов. Амперометрический детектор применяют для определения органических соединений, которые могут быть окислены на поверхности твердого электрода. Аналитическим сигналом является величина тока окисления. В детекторе имеется по крайне мере два электрода – рабочий и электрод сравнения (хлоридсеребрянный или стальной), иногда устанавливают вспомогательный электрод, необходимый для подавления влияния омического падения напряжения в растворах низкой проводимости. Успех определения определяет выбор материала и потенциала рабочего электрода. В амперометрическом детекторе используют электроды из углеродных материалов, наиболее часто стеклоуглеродный, и металлические: платиновый, золотой, медный, никелевый. Потенциал рабочего электрода устанавливают в интервале 0 - +1,3 В. Можно проводить измерения либо при постоянном потенциале, либо импульсном режиме, когда задается трехступенчатая развертка потенциала, которая обеспечивает на разных стадиях – окисление вещества, очистку электрода и его регенерацию. Использование этого 73 детектора особенно важно при определении фенолов, фенольных соединений, гидразинов, биогенных аминов и некоторых аминокислот. Кондуктометрический детектор используют для определения неорганических анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества. Таблица 13. Детекторы для высокоэффективной жидкостной хроматографии, используемые в анализе объектов окружающей среды Вид детектора Измеряемый параметр Минимально определяемое количество, г Селективность Спектрофото- метрический Оптическая плотность 10-10 Высокая Флуориметри- ческий Интенсивность флуоресценции 10-11 Очень высокая Кондуктомет- рический Электропровод- ность 10-9 Низкая Амперометри- ческий Величину тока 10-11 - 10-9 Очень высокая Масс-спектро- метрический Величину ионного тока 10 -12 – 10 -10 Очень высокая Исключительно информативным является масс- спектрометрический детектор, который обладает высокой чувствительностью и селективностью. Основная проблема, затрудняющая использование этого детектора, проблема ввода потока элюента в масс- спектрометр. Развитие микроколоночной хроматографии позволяет 74 разработать системы прямого ввода потока элюента в ионный источник масс-спектрометра. Используют масс-спектрометры высокого разрешения и достаточного быстродействия с химической ионизацией при атмосферном давлении или ионизацией с применением электрораспыления. Последние модели масс-спектрометров для жидкостной хроматографии работают в диапазоне масс m/z от 20 до 4000 а.е.м. Масс-спектрометрический детектор предъявляет жесткие требования к чистоте растворителей, является дорогостоящим и сложным в обращении. 3.1.2. Использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для решения экологических задач Определение загрязнений воды и почвы. Высокоэффективная жидкостная хроматография активно используется для определения различных экотоксикантов в водах и почвах. Наиболее значимые задачи, решаемые ВЭЖХ в анализе вод и почвы – определение фенольных соединений, ПАУ и пестицидов. Так как ПДК этих экотоксикантов в водах и почвах очень низки, их определение обычно проводят после предварительного концентрирования или выделения. Для этого можно использовать жидкостную экстракцию, но более удобным и эффективным методом является сорбция или твердофазная экстракция. Определение фенолов в сточных и природных водах. Весьма распространенными экотоксикантами являются фенол и его хлорпроизводные и нитропроизводные, гваякол, крезолы. Эти соединения образуются в процессе производственной деятельности человека, в частности, в целлюлозно-бумажном производстве. Возникает необходимость их определения в различных типах вод: природных, 75 водопроводной, производственных и сточных. Состав вод весьма сложен и может включать большое число фенольных соединений, которые образуются как на стадии загрязнения, так и в процессе очистки вод. Наиболее вероятными компонентами сточных вод являются фенол, гваякол, о-, м- и п-крезолы, моно-, ди-,три- и пентахлорфенолы, моно- и динитрофенолы. Для разделения и одновременного определения летучих и малолетучих фенолов весьма удачным является использование высокоэффективной жидкостной хроматографии на гидрофобизированном силикагеле. Эффективность и селективность разделения фенолов определяется составом подвижной фазы. Наиболее часто для разделения фенолов в ВЭЖХ используют смеси ацетонитрила или метанола с буферными растворами (ацетатными или фосфатными), успешное разделение фенолов различного состава может быть достигнуто, если в качестве водного компонента подвижной фазы используется вода, подкисленная уксусной, хлоруксусной или фосфорной кислотой. Время удерживания фенолов определяется их гидрофобностью и увеличивается с ее ростом. Для наиболее значимых фенолов, загрязнителей окружающей среды, удерживание растет в ряду: катехол < фенол < 4-нитрофенол < гваякол < п-крезол < 2,4-нитрофенол < 2-нитрофенол < 2-хлорфенол < 4- хлорфенол < 3-хлорфенол < 2,4-диметилфенол < 4-хлор-3-метилфенол < 2,4-дихлорфенол < 2,4,6- трихлорфенол < пентахлорфенол и зависит от состава подвижной фазы. Чем больше в ней содержание ацетонитрила или метанола, тем меньше удерживание. Для разделения столь сложной смеси фенольных соединений не удается подобрать подвижной фазы определенного состава. Необходимо либо использование градиентного элюирования, либо разные фенолы делят с использованием различных подвижных фаз. Низкие ПДК фенольных соединений в водах требуют чувствительных методов детектирования или предварительного 76 концентрирования. Достаточно успешным является детектирование фенолов с использование ДДМ, предел обнаружения фенола при длине волны 260 нм в этом случае достигает 1 мг/л. Еще большей чувствительностью и селективностью к фенолу и его производным обладает амперометрический детектор. Его использование позволяет определять фенолы на уровне ПДК даже в природных водах. В природных водах ПДК для фенола составляет 0,001 мг/л, п-хлорфенола – 0,002 мг/л, 2,4-дихлорфенола – 0,004 мг/мл, 2,4,6 – трихлорфенола – 0,006 мг/л и пентахлорфенола – 0,01 мг/л. Амперометрическое детектирование основано на окислении фенолов на поверхности твердого электрода, в качестве которого обычно используют стеклоуглеродный электрод. Установлено, что максимальный сигнал регистрируется при потенциале стеклоуглеродного электрода – +1300 мВ относительно стального или +1100 мВ относительно хлоридсеребрянного электродов сравнения. Важным является использование в качестве компонента подвижной фазы фосфорной кислоты, в этом случае минимальны флуктуации базовой линии сигнала амперометрического детектора, что позволяет уменьшить величину минимальной определяемой концентрации, которая соответствует сигналу, равному удвоенной “ширине” базовой линии. В табл. 14. приведены примеры определения фенола в водах в различных условиях, на рис. 17 показана хроматограмма смеси , а на рис. 18 – 20 определение фенолов в водопроводной и сточной воде. Определение пестицидов. В современном сельском хозяйстве широко применяются химические соединения, используемые для борьбы с вредными организмами, грибами, сорняками, так называемые пестициды. Наряду с несомненной пользой крупномасштабное производство и бесконтрольное применение пестицидов привело к существенному обострению экологической обстановки. 77 Таблица. 14. Примеры определения фенольных соединений в водах ВЭЖХ Определяемые фенолы Неподвижная фаза Подвижная фаза Детектор с min , мг/л Катехол, фенол, 4-нитрофенол, 2- нитрофенол, п-крезол, 2,4-динитрофенол, 2,4-диметилфенол, 2-хлорфенол, 4- хлорфенол, 2,4-дихлорфенол, 2,4,6- трихлорфенол, пентахлорфенол » » Фенол, 2-хлорфенол, 2,4-дихдорфенол, 2,4,6- трихлорфенол, пентахлорфенол Фенол, гваякол, п-крезол, о-крезол, Пирагаллол, 4-гидроксианилин, бензкатехол, 2- гидроксианилин, фенол, крезолы, моно-, ди-, трихлорфенолы, моно-, динитрофенолы, пентахлорфенол Spherisorb C 18 , 5 мкм Hypersil Green C 18 Kromasil C 18 , 5 мкм Силикагель С 18 , 3 мкм Метанол (МеОН) – 1% раствор уксусной кислоты градиентный режим: 25 ─ 100% МеОН Ацетонитрил (АН) - 1% раствор уксусной кислоты; градиентный режим: 30 ─ 100% АН МеОН – Н 2 О; градиентный режим: 25 ─ 100% МеОН АН ─ 0,1% раствор H 3 PO 4 (57:43) АН ─ 0,1% раствор H 3 PO 4 (20:80) МеОН ─ 0,1 М раствор Na 2 HPO 4 ─ 50 нM нитрилтрехуксусная кислота ─ 0,03 M раствор додецилсульфата натрия; градиентный режим ДДМ УФ МС » Амп » Амп с 4 ячейками 0,03 ─0,1(прямой ввод) (0,65 ─ 1,0)•10 2 (предварительное концентрирование ) (0,3 – 8,0)•10 2 (предварительное концентрирование ) (2,5 – 27)•10 3 (0,04 – 0,3)•10 3 0,001 – 0,01 0,001 – 0,1 8•10 -5 – 4•10 -4 |