микра. Микробиология. Блок 1
 Скачать 1.47 Mb.
|
|
три основные группы ферментов: Конститутивные - постоянно синтезирующиеся в микробных клетках. Индуцибельные - синтез которых индуцируется соответствующим субстратом. Репрессибельные - синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом. Для идентификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков Биохимические признаки сахаролитические свойства бактерий протеолитические свойства бактерий пигментообразование токсинообразование. Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов. Определение сахаролитических ферментов проводится на средах пестрого ряда (среда Гисса) . Средах пестрого ряда (среда Гисса) Состав: Пептонная вода Углевод (сахар или многоатомный спирт ) Индикатор рН В пробирку с глюкозой помещают "поплавок" для определения продукции газа (изначально все желтое, а потом окрашивается в розовый) Для определения протеолитических ферментов - коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо - пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7 - 10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины. Например: возбудитель сибирской язвы образует кратерообразное разжижение МПЖ. В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используется система индикаторная бумажная (СИБ ) СИБ - набор бумажных дисков, пропитанных различными субстратами и индикаторами, которые помещают в пробирки с взвесью изучаемой культуры. Диски фильтровальной бумаги пропитывают индикаторными (дифференциальными) средами. В высушенном состоянии диски можно длительно хранить. Перед использованием диски раскладывают пинцетом в стерильные пробирки и добавляют суспензию идентифицируемой культуры в физрастворе 4. Влияние физических факторов на жизнедеятельность микроорганизмов. К числу основных физических факторов, воздействующих на микроорганизмы как в естественной среде обитания, так и в условиях лаборатории, относятся: Температура О влиянии температуры на микроорганизмы судят по их способности расти и размножаться в определенных температурных границах. Для каждого вида микроорганизмов определена оптимальная температура развития. В зависимости от пределов этой температуры бактерии разделены на три физиологические группы. Высокие и низкие температуры по - разному влияют на микроорганизмы. При низких температурах клетка переходит в состояние анабиоза, в котором она может существовать длительное время. Низкие температуры приостанавливают гнилостные и бродильные процессы. На этом принципе основано сохранение продуктов в холодильниках. Высокая температура губительно действует на микробы. Чем выше температура, тем меньшее время необходимо для инактивации микроорганизмов. В основе бактерицидного действия высоких температур лежит разрушение ферментов за счет денатурации белков и нарушения осмотического барьера. Действие видимого излучения (света). Видимый (рассеянный свет), имеющий длину волны 300…1000 нм, обладает способность угнетать рост и жизнедеятельность большинства микроорганизмов. В связи с этим культивирование микроорганизмов осуществляют в темноте. Видимый свет положительно влияет только на бактерии, которые используют свет для фотосинтеза. Прямые солнечные лучи действуют на микроорганизмы более активно, чем рассеянный свет. Бактерицидное действие света связано с образованием гидроксильных радикалов и других высокореактивных веществ, разрушающих вещества, входящие в состав клетки. Например, происходит инактивация ферментов. Микроорганизмы - сапрофиты более устойчивы к воздействию света, чем патогенные. Это объясняется тем, что они, чаще подвергаясь действию прямых солнечных лучей, более адаптированы к ним. Ультрафиолетовое излучение. Ультрафиолетовое излучение с длиной волны 295…200 нм является бактерицидно активным, то есть способным губительно действовать на микроорганизмы. Механизм действия ультрафиолетового излучения заключается в его способности частично или полностью подавлять репликацию ДНК и повреждать рибонуклеиновые кислоты (особенно мРНК). Ионизирующее излучение Ионизирующее (рентгеновское) излучение представляет собой электромагнитное излучение с длиной волны 0,006…10нм. В зависимости от длины волны различают гамма - излучение, бета - излучение и альфа - излучение. Наиболее активным действие на биологические объекты отличается гамма - излучение, но даже его бактерицидные свойства значительно ниже, чем бактерицидные свойства ультрафиолетового излучения. Гибель бактерий наступает только при облучении их большими дозами от 45000 до 280000 рентген. Механизм действия рентгеновского излучения заключается в поражении ядерных структур, в частности нуклеиновых кислот цитоплазмы, что приводит к гибели микробной клетки или изменению ее генетических свойств (мутации). Электричество. Электрический ток малой и высокой частоты уничтожает микроорганизмы. Особенно сильным бактерицидным действием обладают токи ультравысокой частоты. Они приводят в колебание молекулы всех элементов клетки, вследствие чего происходит быстрое и равномерное нагревание всей массы клетки не зависимо от температуры окружающей среды. Кроме того, установлено, что длительное воздействие токов высокой частоты приводит к электрофорезу некоторых компонентов питательной среды. Образующиеся при этом соединения инактивируют микробную клетку. Ультразвук. Механизм бактерицидного действия ультразвука (волны с частотой 20 000 Гц) заключается в том, что в цитоплазме микроорганизмов, находящихся в жидкой среде, образуется кавитационная полость, которая заполняется парами жидкости, в пузырьке возникает давление, что приводит к дезинтеграции цитоплазматических структур. Аэроионизация. Наибольшее влияние на бактерии оказывают отрицательно заряженные ионы, действуя в средних концентрациях (5*104 в 1 см3 воздуха). Положительно заряженные ионы обладают менее выраженным бактерицидным действием, они способны задерживать рост и развитие микроорганизмов только в больших концентрациях (106 в 1 см3 воздуха). Сила действия аэроионов зависит от их концентрации, длительности экспозиции и расстояния от источника. 5. Влияние химических факторов на жизнедеятельность микроорганизмов. Способность ряда химических веществ подавлять жизнедеятельность микроорганизмов зависит от концентрации химических веществ и времени контакта с микробом. Дезинфектанты и антисептики дают неспецифический микробицидный эффект; химиотерапевтические средства проявляют избирательное противомикробное действие. По механизму действия химические вещества разделяются деполимеризующие пептидогликан клеточной стенки повышающие проницаемость клеточной мембраны блокирующие те или иные биохимические реакции денатурирующие ферменты окисляющие метаболиты и ферменты микроорганизмов растворяющие липопротеиновые структуры повреждающие генетический аппарат или блокирующие его функции. У микроорганизмов химической деструкции прежде всего подвергаются белки и липиды цитоплазматической мембраны, белковые молекулы жгутиков, фимбрий, секс - пили, порины клеточной стенки грамположительных бактерий, связывающие белки периплазмы, протеиновые капсулы, экзотоксины, ферменты - токсины и ферменты питания. Деструкция гетерогенных полимеров (белки, полиэфиры и др.) происходит как при действии окислителей, так и при действии гидролизующих и детергентных антисептиков ( кислоты, щелочи, соли двух - и поливалентных металлов и др.) 6. Классификация питательных сред. Особенности состава и применения. По составу : Простые - содержат основные компоненты белкового питания. Используются в качестве питательной основы для приготовления сложных питательных сред 1. пептонная вода, 2. мясо - пептонный бульон 3. питательный агар Сложные - содержат питательную основу и различные добавки: ростовые, дифференцирующие, селективные, хромогенные. 1. кровяной агар 2. солевой агар 3. селенитовый бульон По консистенции : Жидкие (бульоны) - не содержат гелеобразующих веществ 1. солевой бульон 2. пептонная вода Полужидкие - содержат 0,1 - 0,7% агар - агара 1. тиогликолевая среда (среда для контроля стерильности) Плотные (агары) - содержат 1,0 - 2,0% агар - агара 1. мясо - пептонный агар 2. среда Эндо... По назначению : Дифференциальные - выделение чистой культуры микроорганизмов при одновременной дифференцировке по биохимическим свойствам Основной состав: 1. диф. фактор 2. индикатор 3. пит основа (МПА, лактоза, осн фуксин) Например: 1. среда Эндо 2. кровяной агар Элективные - предназначены для подавления роста сопутствующей микрофлоры с целью облегчения выделения целевого микроорганизма в чистой культуре. Например: 1. солевой агар Элективно - дифференциальные - предназначены для выделения чистой культуры микроорганизмов и одновременного подавления роста сопутствующей микрофлоры. Вырастающая сопутствующая микрофлора дифференцируется от целевых микроорганизмов по биохимическим свойствам. Основной состав: 1. МПА 2. элективный фактор 3. диф. фактор 4. индикатор Например: 1. желточно - солевой агар 2. агар Плоскирева Обогатительные - увеличение концентрации микроорганизмов в исследуемом материале, с последующем выделением чистой культуры путем высева на плотную среду. В зависимости от характеристики исследуемой пробы обогатительные среды могут обладать селективностью или быть неселективными (МПБ, обогат фактор) Например: 1. сахарный бульон 2. солевой бульон Синтетические – состоят из химически чистых компонентов, что позволяет создавать строго контролируемые условия роста. Предназначены для изучения метаболизма (аксотрофы и прототрофы), генетических экспериментов Основной состав: 1. Вода 2. Глюкоза 3. Мин. соли/орг молек Например: 1. агар М9 Среды для анаэробов - выделение и культивирование строгих анаэробов Основной состав: 1. Глюкоза 2. ред фактор Например: 1. анаэробный кровяной агар 2. тиогликолевая среда 3. среда Вильсона - Блер 7. Культивирование. Рост и размножение бактерий на жидких питательных средах Культивирование микроорганизмов - это получение большого числа бактерий на питательной среде. Цели культивирования : Изучение микробиологических свойств Для диагностики инфекций Для получения биопрепарата – из бактерий или полученные с помощью бактерий. Условия культивирования бактерии: Наличие полноценной питательной среды. Оптимальная температура Атмосфера культивирования – либо кислород, либо его отсутствие. Время культивирования – видимый рост через 18 - 48 часов, но некоторые – туберкулез например – 3-4- недели Освещенность. Некоторые будут расти только в присутствии света. Способы культивирования аэробов : Стационарный Периодическое культивирование Непрерывное культивирование Метод глубинно культивирования с аэрацией среды Стационарный Для культивирования микроорганизмов необходимы питательные среды, которые могут обеспечить, клетки всеми нужными для роста и размножения веществами Периодическое культивирование При периодическом процессе весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют посевной материал и при оптимальных условиях продолжают процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или определенного метаболита. В ходе периодического культивирования изменяется темп роста культуры, ее морфология и физиология. За время культивирования меняется состав среды - уменьшается концентрация питательных веществ, увеличивается содержание метаболитов. С физиологической точки зрения периодическое культивирование невыгодно. В ходе его возникает также ряд технологических трудностей - циклический ход операций, сменные режимы, что затрудняет контроль и регуляцию процесса. Непрерывное культивирование Способ непрерывно - проточного культивирования микроорганизмов более совершенен. Суть его заключается в том, что микробная популяция развивается в проточной питательной среде. Непрерывный способ имеет две разновидности: гомогенно - непрерывный игра - диентно - непрерывный. В первом случае выращивание ведут в одном ферментаторе; при тщательном перемешивании среды и аэрации обеспечивается одинаковое состояние культуры во всем объеме жидкости. Рост - увеличение цитоплазматической массы отдельной клетки или группы бактерий в результате синтеза клеточного материала (например, белка, РНК, ДНК). Достигнув определенных размеров, клетка прекращает рост и начинает размножаться. Размножение - способность их к самовоспроизведению, увеличению количества особей на единицу объема. На жидких питательных средах бактерий вызывают помутнение среды, могут образовывать осадок – придонный, пристеночный и могут образовывать пленку на поверхности среды. 8. Культуральные свойства. Колония и ее характеристики. Культуральные свойства - свойства, характеризующие рост микроорганизмов на искусственных питательных средах К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде : Колоний Штриха сплошного газона. Колонией - называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают Поверхностные Глубинные Донные колонии При описании колоний учитывают следующие признаки: форму колонии : 1. округлая 2. амебовидная 3. ризоидная 4. неправильная размер (диаметр) колонии : 1. очень мелкие (точечные) (0,1 - 0,5 мм) 2. мелкие (0,5 - 3 мм) 3. средних размеров (3 - 5 мм) 4. крупные (более 5 мм в диаметре); поверхность колонии : 1. гладкая 2. шероховатая 3. складчатая 4. морщинистая профиль колонии : 1. плоский 2. выпуклый 3. конусовидный 4. кратерообразный прозрачность : 1. тусклая 2. матовая 3. блестящая 4. прозрачная 5. мучнистая цвет колонии (пигмент) : 1. бесцветная 2. пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная) край колонии : 1. ровный 2. волнистый 3. зубчатый 4. бахромчатый структуру колонии : 1. однородная 2. мелко - или крупнозернистая 3. струйчатая консистенцию колонии : 1. плотной 2. мягкой 3. врастающей в агар 4. слизистой (тянется за петлей) 5. хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей). 9. Метаболизм бактерий. Катаболизм, анаболизм. Метаболизм (обмен веществ) - бактерий представляет собой совокупность двух взаимосвязанных противоположных процессов катаболизма и анаболизма. Катаболизм (диссимиляция) - распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопление выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ. Анаболизм (ассимиляция) - синтез веществ с затратой энергии. Особенности метаболизма у бактерий состоят в том, что: его интенсивность имеет достаточно высокий уровень, что возможно обусловлено гораздо большим соотношением поверхности к единице массы, чем у многоклеточных; процессы диссимиляции преобладают над процессами ассимиляции; субстратный спектр потребляемых бактериями веществ очень широк - от углекислого газа, азота, нитритов, нитратов до органических соединений , включая антропогенные вещества - загрязнители окружающей среды (обеспечивая тем самым процессы ее самоочищения); бактерии имеют очень широкий набор различных ферментов - это также способствует высокой интенсивности метаболических процессов и широте субстратного спектра. |