микра. Микробиология. Блок 1
 Скачать 1.47 Mb.
|
|
Окуляр - система увеличивающих линз, которая увеличивает изображение данное объективом. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15 Конденсер Аббе - система собирающих линз которые находятся под предметным столиком и служат для концентрации светового потока от зеркала. Зеркало - служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Аберрации бывают: сферические хроматические Сферические аберрации возникают за счет того что лучи не пересекаются в одной точке. Хроматические аберрации возникают за счет разложения белого света на составные части. Механическая часть микроскопа состоит: Подставка - это основание микроскопа. Коробка с микрометренным механизмом, построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно Тубус - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма Разрешающая способность микроскопа — это способность выдавать чёткое раздельное изображение двух близко расположенных точек объекта. Увеличение микроскопа - общее является произведением увеличений объектива и окуляра. 16. Спора. Строение, функция, методы выявления Споры бактерий — особый тип клеток, характеризующихся резко сниженным уровнем метаболизма и высокой резистентностью. Бактериальная спора формируется внутри материнской клетки и называется эндоспорой. Способностью к образованию спор обладают преимущественно палочковидные грамположительные бактерии родов Bacillus и Clostridium, из шаровидных бактерий лишь единичные виды, например Sporosarcina ureae. Как правило, внутри бактериальной клетки образуется только одна спора. Строение В зрелой споре различимы: Спороплазма Двухслойная ЦПМ 1. Внутренний слой 2. Внешний слой Оболочка споры Спороплазма (протопласт споры) включает : цитоплазму бактериальную хромосому системы белкового синтеза системы анаэробного энергообразования Двухслойная ЦПМ Внутренний слой (стенка споры) образован пептидогликанами. Внешний слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые структуры с низкой проницаемостью. У некоторых бактерий материнская клетка образует экзоспориум Экзоспориум - двух - трёхслойное желатинообразное покрытие образованное липопротеинами и углеводами и во многом аналогичное капсуле бактерий. При созревании споры экзоспориум может сохраняться в виде пустого и отстающего от споры «мешка». Оболочка споры - двухслойная: пространство между слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами, образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую чувствительность к лизоциму. Функция спор - сохранение генетического материалы при неблагоприятных условиях (защитная) Переход бактерий к спорообразованию наблюдается при истощении питательного субстрата недостатке углерода, азота, фосфора изменениях PH Методы выявления Метод окраски по Ожешко Метод Ожешко сходен с методом Циля - Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. После протравы соляной кислотой при нагревании в течение 2 - 3 мин мазок фиксируется и окрашивается по методу Циля - Нильсена. NB! Цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а споры в красный. Метод окраска по Цилю - Нильсену Метод Циля - Нильсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых. 1. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3 - 5 мин. 2. Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1 - 2 мин. 3. Промывают водой. 4. Докрашивают 3 - 5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель). Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем. NB! Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново - красный цвет, некислотоустойчивые - в сине - голубой. 17. Темнопольный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения. Микроскоп построен по традиционной схеме. Отличительной особеностью является применение специального конденсора (кардиоид или параболоид) формирующего световой конус, использующийся для бокового освещения объекта. При использовании объективов с больщой аппертурой для устранения засветки поля в объектив вкладывается диафрагма. Достоинства Возможность изучения живых микроорганизмов – изучение подвижности бактерий и простейших Нет искажений, связанных с фиксацией и окраской препаратов Недостатки Сложная настройка освещения Высокие требования к качеству предметных и покровных стекол Сфера применения: ультрамикроскоп для изучения подвижности живых неокрашенных микроорганизмов. Диагностика сифилиса (трепонема) и лептоспироза Принцип работы : В объектив не попадают прямые лучи, в центре конденсора чёрная бумага (темнопольный конденсор) → эффект Тиндаля → светящиеся контуры микроорганизмов на чёрном фоне. 18. Фазово-контрастный микроскоп. Принцип работы. Сфера применения. Фазово - контрастный микроскоп, состоит из специального конденсора и объективов с фазовыми пластинками позволяет перевести невидимые глазу фазовые колебания в видимык амплитудные. Изменение фазы колебания когерентных лучей происходит при прохождении через прозрачные объекты. При этом, в отличие от темнопольного микроскопа, можно рассмотреть не только контуры объекта, но и его внутреннее строение. Достоинства Возможность изучения живых микроорганизмов – изучение подвижности бактерий и простейших Нет искажений, связанных с фиксацией и окраской препаратов Возможно изучение внутренней структуры крупных объектов (ядра, вакуоли ) Недостатки Хроматические аберрации (возникают за счет разложения белого света на составные части) Принцип работы: Преобразовывает не видимые глазу фазовые изменения вносимые объектом в видимый изменения контрастности. Конденсор с поляризатором. Сфера применения : изучение подвижности изучение внутреннего строения микроорганнизмов изучение неокрашенные живые препараты. 19. Этапы развития микробиологии. Работы основоположников микробиологии. Эмпирические знания (до изобретения микроскопов и их применения для изучения микромира). Дж. Фракасторо (1546г.) предположил живую природу агентов инфекционных заболеваний - contagium vivum. Морфологический период занял около двухсот лет. Антони ван Левенгук в 1675г. впервые описал простейших, в 1683г. - основные формы бактерий. Несовершенство приборов (максимальное увеличение микроскопов X300) и методов изучения микромира не способствовало быстрому накоплению научных знаний о микроорганизмах. Физиологический период (с 1875г.) - эпоха Л.Пастера и Р.Коха. Л. Пастер - изучение микробиологических основ процессов брожения и гниения, развитие промышленной микробиологии, выяснение роли микроорганизмов в кругообороте веществ в природе, открытие анаэробных микроорганизмов, разработка принципов асептики, методов стерилизации, ослабления (аттенуации) вирулентности и получения вакцин (вакцинных штаммов). Р. Кох - метод выделения чистых культур на твердых питательных средах, способы окраски бактерий анилиновыми красителями, открытие возбудителей сибирской язвы, холеры (запятой Коха), туберкулеза (палочки Коха), совершенствование техники микроскопии. Экспериментальное обоснование критериев Хенле, известные как постулаты (триада) Хенле - Коха. Иммунологический период. И. И. Мечников создал новую эпоху в микробиологии - учение о невосприимчивости (иммунитете), разработав теорию фагоцитоза и обосновав клеточную теорию иммунитета. Одновременно накапливались данные о выработке в организме антител против бактерий и их токсинов, позволившие П. Эрлиху разработать гуморальную теорию иммунитета. В последующей многолетней и плодотворной дискуссии между сторонниками фагоцитарной и гуморальной теорий были раскрыты многие механизмы иммунитета и родилась наука иммунология Следующим важным этапом в развитии микробиологии стало открытие антибиотиков . В 1929г. А. Флеминг открыл пенициллин и началась эра антибиотикотерапии, приведшая к революционному прогрессу медицины. В дальнейшем выяснилось, что микробы приспосабливаются к антибиотикам, а изучение механизмов лекарственной устойчивости привело к открытию второго - внехромосомного (плазмидного) генома бактерий. Изучение плазмид показало, что они представляют собой еще более просто устроенные организмы, чем вирусы, и в отличии от бактериофагов не вредят бактериям, а наделяют их дополнительными биологическими свойствами. Открытие плазмид существенно дополнило представления о формах существования жизни и возможных путях ее эволюции. Современный молекулярно - генетический этап развития микробиологии, вирусологии и иммунологии начался во второй половине 20 века в связи с достижениями генетики и молекулярной биологии, созданием электронного микроскопа. В опытах на бактериях была доказана роль ДНК в передаче наследственных признаков. Использование бактерий, вирусов, а затем и плазмид в качестве объектов молекулярно - биологических и генетических исследований привело к более глубокому пониманию фундаментальных процессов, лежащих в основе жизни. Выяснение принципов кодирования генетической информации в ДНК бактерий и установление универсальности генетического кода позволило лучше понимать молекулярно - генетические закономерности, свойственные более высоко организованным организмам. БЛОК 2 1. Бактериологический метод диагностики. Достоинства и недостатки. Бактериологические методы диагностики - это совокупность методов изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения Основным, наиболее точным и достоверным, является бактериологический метод ― метод выделения чистых культур Метод выделения чистых культур позволяет выделить из естественной среды обитания ― тканей и жидкостей организма человека или внешней среды ― отдельные виды микробов. Это достигается посевом материалов в искусственные питательные среды. Чистые культуры патогенных микробов, выделенные от больных людей и животных, позволяют своевременно установить диагноз и определить природу инфекционного заболевания. Они являются исходным материалом для получения бактерийных препаратов (вакцины, токсины, фаги, антибиотики и т. д.) Выделенная чистая культура идентифицируется по морфологическим, тинкториальиым, культуральным, токсигенным и биохимическим свойствам, по антигенной структуре и вирулентности. Идентификация представляет собой комплекс микроскопических, бактериологических, иммунологических и биологических исследований, применяемых для определения типа и вида бактерий. Достоинства относительно высокая специфичность исследования возможность лабораторного моделирования терапевтического воздействия на микроорганизмы и учет его эффективности. Недостатки длительность исследования высокие требования к забору материала повышенные требования к квалификации персонала лабораторий. 2. Бактериологический метод диагностики. Основные этапы. Бактериологические методы диагностики - это совокупность методов изучения свойств микроорганизмов, определения их систематического положения. Основным, наиболее точным и достоверным, является бактериологический метод ― метод выделения чистых культур Метод выделения чистых культур позволяет выделить из естественной среды обитания ― тканей и жидкостей организма человека или внешней среды ― отдельные виды микробов. Это достигается посевом материалов в искусственные питательные среды. Чистые культуры патогенных микробов, выделенные от больных людей и животных, позволяют своевременно установить диагноз и определить природу инфекционного заболевания. Они являются исходным материалом для получения бактерийных препаратов (вакцины, токсины, фаги, антибиотики и т. д.) Выделенная чистая культура идентифицируется по морфологическим, тинкториальиым, культуральным, токсигенным и биохимическим свойствам, по антигенной структуре и вирулентности. Идентификация представляет собой комплекс микроскопических, бактериологических, иммунологических и биологических исследований, применяемых для определения типа и вида бактерий. Достоинства относительно высокая специфичность исследования возможность лабораторного моделирования терапевтического воздействия на микроорганизмы и учет его эффективности. Недостатки длительность исследования высокие требования к забору материала повышенные требования к квалификации персонала лабораторий. Основные этапы 1 этап Подготовительные мероприятия. Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты. Обогащение. Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37о. Микроскопия. Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы. Создание отдельных колоний. На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37о. Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одной стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды. 2 этап Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия. Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют. Накопление чистой культуры. Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37о, но в некоторых случаях может быть иной). Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера. Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло - красный цвет. Состав среды Клиглера МПА 0,1% глюкозы 1% лактозы Специальный реактив на сероводород Феноловый красный индикатор. 3 этап Уровень роста и чистоты культуры. В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение. 3. Биохимические свойства бактерий. Механизмы изучения. Биохимические свойства - способность микроорганизмов к ферментации и ассимиляции тех или иных химических веществ. У бактерий различают |