Объект изучения микробиологии
 Скачать 6.2 Mb.
|
|
Рост периодической культуры бактерий, выращиваемых на жидкой питательной среде, подразделяют на несколько фаз, или периодов: 1. лаг-фаза; 2. фаза логарифмического роста; 3. фаза стационарного роста, или максимальной концентрации бактерий; 4. фаза гибели бактерий. Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кри вой размножения бактерий, отражающей зависимость логариф ма числа живых клеток от времени их культивирования. Лаг-фаза — период между по севом бактерий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4—5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в раз мерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеино вых кислот, белка и других компонентов. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом ин тенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5— 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20—40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ра нимы, что объясняется высокой чувствительностью компонен тов метаболизма интенсивно растущей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Затем наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз неспособных клеток остается без изменений, составляя макси мальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность вы ражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования. Завершает процесс роста бактерий фаза гибели, характеризующаяся отмиранием бак терий в условиях истощения источников питательной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продолжи тельность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Интен сивность роста и размножения бактерий зависит от многих фак торов, в том числе оптимального состава питательной среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др. Размножение бактерий на плотной питательной среде. Рост микробов на плотной питательной среде. Для изучения свойств коло ний микробы культивируют на плотных питательных средах в чашках Петри. При этом посев материала проводят таким образом, чтобы получить изолированные колонии. Для характеристики колоний используют следующие признаки: 1. Размер колонии. Колонии обычно измеряют в миллиметрах или пользуют ся для этого описательными терминами, такими, например, как точечные (диаметр менее 1 мм), мелкие (диаметр 1-2 мм), средние (диаметр 2-4 мм) и крупные (диаметр 4-6 мм и более). 2. Форма колонии. Бывает правильной (круглая), неправильной (амебовидная), ризоидной (корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев). 3. Контуры края. Определяют при рассмотрении колонии под лупой или микроскопом с малым увеличением. Различают ровные края в виде четко выра женной линии и неровные края (фестончатый, волнистый, эрозированный или зазубренный, бахромчатый). 4. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью пи тательной среды и формой на вертикальном разрезе. Определяется рельеф колонии невооруженным глазом или при помощи лупы при рассматривании сверху и сбоку. Различают каплеобразные и куполообразные колонии правильной круглой формы, плоско-выпуклые колонии, конусообразные колонии, колонии с приподнятой серединой, колонии с вдавленным центром, плоские колонии. 5. Поверхность колонии. Изучают при помощи лупы или под микроскопом при малом увеличении. Поверхность колонии бывает матовая или блестя щая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие ко лонии обозначают буквой S (smooth - гладкий), шероховатые - буквой R (rough - шероховатый). 6. Цвет колонии. Определяется пигментом, который продуцирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета. Пигментообразующие виды микробов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, си ние, красные, сиреневые, черные и др. 7. Структура колоний. Определяется в проходящем свете при слабом увеличе нии микроскопа, суженной диафрагме или при несколько опущенном кон денсоре. По структуре различают гиалиновые колонии, зернистые колонии, нитевидные или волокнистые колонии. 8. Консистенция колоний. Исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериоло гической петлей. По характеру консистенции колонии бывают пастообразные, вязкие или слизистые, волокнистые или кожистые, хрупкие сухие. Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолирован ные колонии округлой формы с ровными или неровными кра ями (S- и R-формы), различной консистенции и цве та, зависящего от пигмента бактерий. Пигменты, растворимые в воде, диффундируют в питатель ную среду и окрашивают её. Дру гая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в орга нических растворителях. И, нако нец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях. Наиболее распространены среди микроорганизмов такие пиг менты, как каротины, ксантофиллы и меланины. Меланины яв ляются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из фенольных соединений. Меланины наряду с каталазой, супероксиддисмутазой и пероксидазами защищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радикалов кислорода. Многие пигменты обладают ан тимикробным, антибиотикоподобным действием. №22. Особенности культивирования риккетсий, хламидий и вирусов. Риккетсии и хламидии — облигатные внутриклеточные бактерии, которые не растут на искусственных питательных средах. Вирусы также являются облигатными внутриклеточными микроорганизмами, но они принципиально отличаются от всех внеклеточных и внутриклеточных бактерий; отсутствием клеточной организации, ферментов строительного и энергетического метаболизма, наличием одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), неспособностью к бинарному делению. Для культивирования риккетсии, хламидий и вирусов используют клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Клеточные культуры. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Переви-виваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей. Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с дабавлением телячьей сыворотки крови. Клетки эпителиальной и соединительной тканей растут в суспензии; при оседании они довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде "пласте, состоящего из одного слоя клеток (монослоя). Перевиваемые однослойные клеточные культуры приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки, а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др. К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых. Все работы с культурами клеток требуют строжайшего соблюдения правил асептики во избежание заноса в них различных микроорганизмов из окружающей среды. ''После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток, которая начинает расти и развиваться, ее заражают материалом, содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упомянутые микроорганизмы проникают внутрь клеток, где и размножаются: В клетках, пораженных риккетсиями, на 3—8-й день отмечается большое количество коккобациллярных форм, заполняющих целиком цитоплазму или ядро клеток, которые затем гибнут. 'Хламидии также рассматривают в окрашенных по Романовскому—Гимзе препаратах клеток^в которых наблюдают различные формы размножающихся микроорганизмов. размножение (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. При этом часть из них погибает и отслаивается от стенки пробирки^Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие клетки, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплошного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточные островки. 'Характер ЦПД, вызванный разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних (парамиксовирусы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других к (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация клеток и т.д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая клеточную культуру под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом) Некоторые вирусы (энтерови-русы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4—6-й день). Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности. один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты — реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты. Другой метод — реакция гемагглютинации. Применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости клеточной культуры либо хорион-аллантоисной или амниоти-ческой жидкости куриного эмбриона. Гемагтлютинацию— скучивание эритроцитов кур, гусей, морских свинок —вызывают вирусы, содержащие в оболочке гемагглютинин." Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с клеточными культурами и подопытными животными значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Для получения чистых культур риккетсии, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют куриные эмбрионы в возрасте от 8 до 12 дней. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, которые обнаруживают после вскрытия эмбриона на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроба без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсии или вирусов при изготовлении различных препаратов. Лабораторные животные. Экспериментальные животные используются для выделения риккетсий и вирусов из исследуемого материала, а также для получения больших количеств этих микроорганизмов. Например, риккетсий можно культивировать в легких мышей и кроликов, производя заражение животных через нос. При этом способе культивирования получают большое количество материала и используют его для приготовления вакцин или диагностических препаратов. Успех выделения вируса зависит от правильного выбора вида экспериментального животного и способа введения материала. Для выделения, нейровирусов наилучшим является введение исследуемого материала в головной или спинной мозг, респираторных вирусов — на слизистую оболочку верхних дыхательных путей. Для лабораторных целей используют белых мышей, кроликов, белых и хлопковых крыс, морских свинок, обезьян. Наиболее широко применяют в вирусологической практике белых мышей, например для выделения вирусов — возбудителей бешенства, энцефалита, орнитоза. После введения исследуемого материала за животным устанавливают наблюдение, отмечают его поведение, появление симптомов заболевания, температуру. Если у первично зараженного животного отсутствуют клинические проявления болезни, производят 2—3 последовательных «слепых пассажа» на новой партии животных, вводя им суспензии из органов животных первой партии. При отсутствии симптомов заболевания у повторно зараженных животных результаты исследования считают отрицательными. При наличии у животных клинических признаков болезни производят определение вирусов в суспензии органов с помощью серологических реакций (реакция нейтрализации с известными сыворотками). Для бактериологического исследования берут стерильно кровь из сердца, кусочки органов для посева на питательные среды, готовят мазки-отпечатки для окраски и микроскопирования. Применяют подкожный, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, субдуральный и другие методы заражения лабораторных животных. №23. Культивирование вирусов. Методы индикации и идентификации вирусов в культуре клеток. 1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения Культура клеток – клетки какой-либо ткани животных или человека, способные расти и размножаться в искусственных условиях. Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии. Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения. Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови. Изотоничность и буферность среды поддерживается с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,2-7,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,8-7,8. Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО2 (в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону). Для приготовления питательной среды требуется вода высокой степени очистки, так как культура клеток очень чувствительна к ионам тяжёлых металлов. Рекомендуется применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищенную в ионообменных колонках. Работу с культурами клеток проводят в тщательно обработанной «вирусологической» посуде из специальных сортов стекла или пластиковой посуде из полистерола для одноразового использования. Приготовленную культуру клеток инкубируют в термостате при температуре 36,0-38,50С. 1.2.2. Типы клеточных культур Для приготовления культур клеток используют различные ткани животных, человека и птиц как эмбриональные, так и зрелые. Кроме нормальных используют и злокачественные перерождённые ткани, получаемые из опухолей. Источником эмбриональной ткани часто служит куриный зародыш, а также эмбрионы человека, мышей, свиней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей выживаемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тканей чаще всего употребляется почечная ткань (обезьян, морских свинок, хомячков и др.), амниотическая оболочка человека. Ткани берут в асептических условиях, промывают в солевом растворе Хенкса и затем подвергают измельчению. В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которые подразделяют на: 1. Культуры фиксированных кусочков тканей. 2. Однослойные культуры клеток: а) первичные культуры клеток; б) перевиваемые (стабильные) культуры клеток; в) культуры диплоидных клеток. 3. Культуры суспензированных клеток. В практической вирусологии чаще используют однослойные культуры, клетки которых растут и размножаются будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату (стеклу, пластику), образуя слой толщиной в одну клетку (монослой). Метод обработки однослойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами (обычно трипсином), разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клетки прикрепляются к стеклу сосуда и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визуально наблюдать возникающие изменения в динамике. а) Первичные культуры клеток способны размножаться только в первой генерации Методика получения первичных культур фибробластов куриного эмбриона
Через 3-4 суток от начала культивирования, просматривая пробирки при малом увеличении микроскопа, можно видеть вытянутые, отростчатые клетки – фибробласты, которые растут на стенке пробирки, образу монослой. б) Перевиваемые культуры клеток (линии клеток) Это стабильные культуры клеток, которые способны бесконечно долго размножаться вне организма, если их культивировать в соответствующих условиях. Например, перевиваемые культуры из амниона человека (FL, А-8), почки обезьян (VERO - от зелёной мартышки, LLCMK 2 – от макаки-резус), эмбриона мыши (ЗТЗ), из опухолевых клеток человека (HeLa - из рака шейки матки, Нер–2 – из рака гортани) и многие другие. Перевиваемые культуры клеток обладают целым рядом преимуществ по сравнению первичными. Работа с ними менее трудоёмка, они отличаются большим диапазоном чувствительности ко многим вирусам. Однако перевиваемые культуры не пригодны для производства вирусных вакцин, так как существуют опасения по поводу их возможной злокачественности. Перевиваемые культуры клеток без пересева на свежую среду довольно быстро дегенерируют. Поэтому исходную культуру клеток выращивают в матрацах с питательной средой, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды. При работе с пробирочными культурами также рекомендуется пересевать их через 7-8 дней, или же раз в 3-4 дня заменять питательную среду свежей, тогда клеточные культуры сохраняют свою жизнеспособность 2-3 недели. Для культивирования перевиваемых культур клеток применяют среду 199 (часто с добавлением 10% бычьей сыворотки), среду Игла с добавлением 20% сыворотки, 0,5% гидролизат лактальбумина, содержащий 5% телячьй сыворотки. в) Культуры диплоидных клеток Их называют полуперевиваемыми культурами, так как ини обладают способностью к пересевам в течение длительного времени – выдерживают до 40-50 пассажей, проводимых на протяжении 8-10 месяцев. Затем культура клеток дегенерирует и гибнет. Диплоидными их называют , потому что они стойко сохраняют диплоидный кариотип, присущий исходным нормальным клеткам организма – родоначальницам диплоидной линии. Культуры диплоидных клеток получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (диплоидные клетки лёгких человека), штаммы WJT-38, JMR-90, MRC-5 из лёгких ткани эмбриона человека. Диплоидные культуры применяют для выделения и культивирования вирусов. Они чувствительны ко многим штаммам вирусов, онкогенно безопасны, пригодны для культивирования в промышленных масштабах и получения массового количества вирусных вакцин. Культуры суспензированных клеток Суспензированная культура – это культура, в которой отдельные клетки или их конгломераты постоянно находятся во взвешенном состоянии в жидкой среде. Культуры клеток в суспензии удаётся получить, если проводить их культивирование при постоянном интенсивном перемешивании среды путём вращения пробирок в барабане, с помощью магнитной мешалки и т.п. В последнее время используют специальные аппараты – хемостаты, в которых обеспечивается автоматическое обновление среды. Суспензированные клетки обладают большей активностью роста, накапливаются в большом количестве, при регулярной замене среды длительное время остаются жизнеспособными. |