Объект изучения микробиологии
 Скачать 6.2 Mb.
|
|
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций К таким методам относятся молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция, которые позволяют обнаружить присутствие в исследуемом материале даже единичных копий генов определяемых вирусов (ДНК или РНК с определённой нуклеотидной последовательностью), и тем самым доказать наличие соответствующей инфекции. 2.3.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) или локальная амплификация нуклеиновых кислот (ЛАНК) ПЦР, как и молекулярная гибридизация, основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации и на комплементарности цепей ДНК. Важным принципом реакции является использование термостабильной ДНК-полимеразы, при участии которой происходит амплификация – умножение определяемых генов или фрагментов с определённой нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован. Чувствительность этой реакции составляет 10-18 г/мл. В реакции участвуют следующие ингредиенты:
Сущность ПЦР состоит в том, что определяемая ДНК, находящаяся в тестируемом биологическом материале, подвергается денатурации. Затем праймеры 2-х типов в условиях отжига присоединяются, вследствие их комплементарности, к 3,-концам каждой из антипараллельных цепей, восстанавливая на этом участке двухспиральную структуру ДНК. Праймеры служат «затравками» для последующей достройки цепей ДНК, осуществляемой термостабильной ДНК-полимеразой, которая использует для этой цели свободные нуклеотиды. В результате одного цикла ПЦР количество молекул определяемой ДНК удваивается, то есть происходит амплификация ДНК. Обычно проводят 25-40 повторных циклов амплификации и в итоге за 2-3 часа получают миллионы копий специфического фрагмента ДНК вирусов. ПЦР проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амплификаторах, которые автоматически регулируют смену температуры. Каждому из 3-х этапов цикла амплификации – денатурации ДНК, отжига и достройки – необходима инкубация образцов при различном температурном режиме.
Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, авторадиографией или другими методами. С помощью ПЦР возможно определение не только нуклеотидной последовательности ДНК, но также РНК и, следовательно, выявление РНК-вирусов (для этого в реакцию вводят обратную транскриптазу). ПЦР особенно ценен для диагностики латентных вирусных инфекций и ВИЧ-инфекции. №24. Классификация бактерий по типу дыхания. Культивирование облигатно – анаэробных и аэробных бактерий. Дыхание - (или биологическое окисление) микроорганизмов представляет собой совокупность биохимических процессов, в результате которых освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микробных клеток. Классификация бактерий по типам дыхания: Облигатные аэробы (возбудители туберкулеза, чумы, холеры) – микроорганизмы, для оптимального роста которых необходимо 21 % кислорода. Облигатные анаэробы (возбудители столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции, бактероиды, фузобактерии) – бактерии, которые растут при отсутствии свободного молекулярного кислорода за счет процессов брожения. Они получают кислород из органических соединений в процессе их метаболизма. Некоторые из них не выносят даже незначительного количества свободного кислорода. Факультативные анаэробы (стафилококки, ешерихии, сальмонели, шигели и другие) – приспособились, в зависимости от условий среды (наличию или отсутствию кислорода), переключать свои метаболические процессы с использованием молекулярного кислорода на брожение и наоборот. Микроаэрофилы (молочнокислые, азотфиксирующие бактерии) – особенная группа микробов, для которых концентрация кислорода при культивировании может быть уменьшена до 2 %. Высшие его концентрации способны задерживать рост. Капнеические (возбудитель бруцеллеза бычьего типа) – микроорганизмы, которые требуют, кроме кислорода, еще и до 10 % углекислого газа. Культивирование облигатно анаэробных бактерий Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера и Малкиной. Метод Фортнера . Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов. Метод Малкиной. При посеве по методу Малкиной используют 2 пробирки со скошенным МПА, соединенных трубкой. В 1ну пробирку сеют культуру аэроба, в другую анаэроба. Когда исчерпается кислород при росте аэробных бактерий, начинается рост анаэробных. Посевы анаэробов производят на среде Китта –Тароции, состоящей из МПБ, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша. Перед посевом среду прогревают в водяной бане в течение 10-15 минут для удаления воздуха и остужают. После посева среду заливают слоем вазелинового масла или парафином с целью изоляции от атмос-го воздуха. *Основные питательные среды для культивирования анаэробов: сахарный агар, сахарный кровяной агар Цейсслера, среда Китт-Тароцци, среда Вильсона-Блера, тиогликолевая среда. Культивирование аэробных микроорганизмов Для выращивания аэробов необходимы питательные среды, создание оптимальных температурных условий и наличие кислорода. проводят следующим образом: *на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред, когда микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха; *в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. * в простых термостатах. Обычно рост бактерий в виде помутнения жидких питательных сред или образования колоний на плотных средах наблюдается через 18—24 ч культивирования в термостате. № 25. Методы выделения чистых культур аэробных бактерий. Этапы выделения. Чистая культура — это популяция микроорганизмов одного вида. Для выде ления чистой культуры аэробов используют методы, основанные на: 1. Механическим разобщением бактериальных клеток; 2. Действии физических и химических факторов, оказывающих избира тельное действие; 3. Способности некоторых бактерий размножаться в организме. Метод Дригальского основан на механическом разобщение на поверхности плотной питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуе мого материала. I этап. 1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовле ние мазка, окраска по Граму). 2. Посев в чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового мате риала, засевают вторую и третью чашки. 3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. II этап. 1. Микроскопическое изучение колонки по величине, форме, окраске, ха рактеру поверхности, краев, консистенции колонии. Колонии бактерий имеют различные размеры (от 2 до 4 мм), округлую правильную или неправильную форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или фестончатые края и различную консистенцию. Колонии бактерий могут быть бесцветными или имеют белый, золотистый, красный, лимонно-желтый цвет за счет образования пигмента. 2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовле ние мазка, окраска по Граму). 3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным огаром.(МПА) 4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. III этап. Проверка культуры на чистоту (макроскопическим — однородный рост, микроскопическим- однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признакам клетки). Идентификация проводится по: - ферментативным свойствам. - антигенным свойствам фагочувствительности токсигенности и другим признакам Биологический метод получения чистых культур основан на заражении чувствительных экспериментальных животных исследуемым материалом, содержащим микробные ассоциации. Например, пневмококки можно выделить из мокроты, заражая чувствительную к ним белую мышь. Через 4 ч в крови мыши обнаруживают чистую культуру пневмококков, так как они опережают размножение других микроорганизмов. Чистую культуру аэробных бактерий можно также получить, если на исследуемый материал воздействовать каким либо физическим или химическим фактором, оказывающим избирательное антибактериальное действие. №26. Методы выделения чистых культур облигатно анаэробных бактерий. Этапы выделения. А) по Цейсслеру : 1 этап: из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении подозрительных на анаэробы микробов исследуемый материал засевают на среду Китта-Тароции. В случае необходимости предварительно исследуемый материал разводят стерильным 0,9% р-ом NaOH. заливают вазелиновым маслом или парафином, подписывают и ставят в термостат. При темп-ре 37, на 18-24ч. 2этап: на след день посевы просматривают и описывают характер роста. готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют, описывая морфологич. и тинкториаль. Свойства бактерии. Затем производят пересев в чашки Петри на сахарно – кровяной агар, для получения изолированных колоний. Чашки помещают в анаэростат и термостатируют при темп-ре 37, на 18-24ч. 3 этап: посевы просматривают, изучают изолированные колонии, описывают характер роста. Морфологию бактерий исследуют приготовлением мазка из колонии, окрашенного по Граму. Далее для выделения и накопления чистой культуры производят пересев подозрительной колонии в пробирку со средой Китта – Тароции. Пробирки термостатируют При темп-ре 37, на 18-24ч. 4 этап: отмечают визуальный характер роста чистой культуры . проводят проверку чистой культуры, для чего ее микроскопируют Б) по Вейнбергу: 1 этап: из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. При обнаружении подозрительных на анаэробы микробов исследуемый материал засевают на среду Китта-Тароции. В случае необходимости предварительно исследуемый материал разводят стерильным 0,9% р-ом NaOH. заливают вазелиновым маслом или парафином, подписывают и ставят в термостат. При темп-ре 37, на 18-24ч. каплю материала со среды Китт — Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки Виньял — Вейона. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, при этом агар застывает и фиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток в глубине столбика агара. инкубируют в термостате При темп-ре 37, на 18-24ч. 2 этап: выросшие в узких пробирках колонии изучают с помощью лупы. На месте отобранной подозрительной колонии делают распил пробирки, колонию отбирают и пересевают на среду Китта- Тароции. Пробирки культивируют При темп-ре 37, на 18-24ч. Ш этап — проверяют чистоту выделенной куль туры. №27. Ферменты бактерий. Методы выявления сахаролитических и протеолитических ферментов. Ферменты, образу емые бактериальной клеткой, могут локали зоваться как внутри клетки — эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты. Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь ис точниками углерода и энергии. Большинство гидролаз является экзоферментами, которые, выделяясь в окружающую среду, расщепля ют крупные молекулы пептидов, полисаха ридов, липидов до мономеров и димеров, способных проникнуть внутрь клетки. Ряд экзоферментов, например гиалуронидаза, коллагеназа и другие, являются ферментами агрессии. Некоторые ферменты локализо ваны в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в про цессах переноса веществ в бактериальную клетку. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и — в некоторых слу чаях — для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности поль зуются при установлении таксономического положения бактерий. Наличие экзофермен тов можно определить при помощи диффе ренциально-диагностических сред, поэтому для идентификации бактерий разработаны специальные тест-системы, состоящие из набора дифференциально-диагностических сред. Известно более 2000 ферментов. Они объединены в шесть классов:
В соответствии с механизмами генетического контроля у бактерий выделяют три группы ферментов: - конститутивные, синтез которых происходит постоянно; - индуцибельные, синтез которых индуцируется наличием субстрата; - репрессибельные, синтез которых подавляется избытком продукта реакции. Идентификация бактерий по фер ментативной активности. Наиболее ча сто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз, используя специальные методы и среды. Для определения протеолитической активности мик роорганизмы засевают в столбик желатина уколом. Че рез 3—5 дней посевы просматривают и отмечают харак тер разжижения желатина. При разложении белка некоторыми бактериями могут выделяться специфические продукты — индол, сероводород, аммиак. Для их опреде ления служат специальные индикаторные бумажки, ко торые помещают между горлышком и ватной пробкой в пробирку с МПБ или (и) пептонной водой, засеянными изучаемыми микроорганизмами. Индол (продукт разло жения триптофана) окрашивает в розовый цвет полоску бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты. Бумага, пропитанная раствором ацетата свинца, в присутствии сероводорода чернеет. Для определения аммиака используют красную лакмусовую бумажку. Определение сахаралитической активности проводится на средах Гисса, состоящих из 1% пептонной воды, 0,5% определенного углевода( глюкоза, лактоза, манит и др) и индикатора Андреде (кислый фуксин в 1н растворе NaOH). В пробирку со средой опускают поплавок ( стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Свежеприготовленная среда имеет соломенно- желтый цвет. Результаты посевов учитываются ч/з 24-48 ч. О разложении углеводов судят по изменению цвета среды( она приобретает красный цвет, в результате сдвига рН в кислую сторону). О газообразовании свидетельствует накопление газа в поплавке. 28. Понятие об инфекции, инфекционном процессе, инфекционной болезни. Условия возникновения инфекционной болезни. Инфекция — сложный биологический процесс взаимодействия макроорганизма и возбудителя болезни, происходящий при определенных условиях внешней среды. Комплекс этих реакций сопровождается явным или скрытым нарушением постоянства внутренней среды макроорганизма (гомеостаза) Инфекционный процесс - это комплекс взаимных приспособительных реакций в ответ на внедрение и размножение патогенного микроорганизма в макроорганизме, направленный на восстановление нарушенного гомеостаза и биологического равновесия с окружающей средой. |