Объект изучения микробиологии

• Название: Объект изучения микробиологии
• Анкор: Mikra_1-10 (2).docx
• Дата: 26.12.2017
• Размер: 6.2 Mb.
• Имя файла: Mikra_1-10 (2).docx
• Тип: Документы; #13104
• страница: 29 из 29

137. Понятие о пирогенности и методы ее определения.
Пирогены – это вещества липополисахаридной природы, образующиеся при гибели микробной клетки. Представляют собой эндотоксины, при введении в организм вызывают лихорадку.
Для определения пирогенности используют 3 метода. Прямой метод – биологический. Испытание проводят на кроликах. Группе животных, состоящей из 3 особей, пригодных для опыта, вводят испытуемый препарат в ушную вену. Затем измеряют ректальную температуру 3 раза с промежутками в 1 час. Испытуемый раствор считают непирогенным, если сумма повышений температуры у 3-х кроликов менее 1,4 °С. Если сумма находится в пределах 1,5-2,2 °С, испытание повторяют. Если сумма превышает 2,2 °С, то препарат считается пирогенным. Пирогенны продуцируются в основном грамотрицательными бактериями (ГОБ). У грамположительных бактерий пирогенная активность в 10⁴-10⁵ ниже, чем у ГОБ. Поэтому используют косвенный метод определения пирогенности путем определения общего количества микроорганизмов, в том числе ГОБ, до стерилизации 1 мл образца, взятого непосредственно перед стерилизацией, засевают на МПА. Инкубируют 5 суток при температуре 30-35 °С. Подсчитывают колонии – общее количество бактерий.
Микроскопируюти подсчитывают колонии ГОБ.
Допустимые нормы для 5,10,25,40% растворов глюкозы, 0,9% раствора NaCl – неинъекционного назначения: ОКБ – 50, ГОБ – 10; для инъекций: ОКБ – 15-20, ГОБ – 5. Превышение указанных показателей свидетельствует о пирогенности препарата после стерилизации.
Наиболее современным методом определения пирогенности является ЛАЛ-тест. В основе этого метода лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) морских животных мечехвостов специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий – липополисахаридами. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван «лизат амебоцитов лимулюс» (Li,ulus amebocyte lysate) – ЛАЛ-реактив. В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образования твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина. Преимуществами ЛАЛ-теста являются высокая чувствительность, возможность анализировать в короткий срок (1-2ч) большое количество образцов, возможность определения пирогенности лекарст, которые нельзя испытывать на кроликах – короткоживущих изотопов, препаратов седативного действия и др.
138. Санитарно-микробиологическое исследование воздуха в аптеках.

Пробы воздуха отбирают в следующих помещениях: в асептическом блоке, стерилизационной; ассистентской, фасовочной, комнате дефектора и материальной; в моечной; в зале обслуживания.

Отбор проб воздуха производят при соблюдении следующих условий: чистое подготовленное к работе помещение; - закрытые форточки и двери; определение в помещении % относительной влажности воздуха; уровень высоты отбора проб воздуха соответствует высоте рабочего стола; не ранее чем за 30 мин. после влажной уборки помещения. Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью приборов для бактериологического анализа воздуха: модель 818 (прибор Кротова), ПОВ, ПАБ.

Для определения общего содержания бактерий в 1 куб. м отбор производят на 2% питательный агар, разлитый в чашки по 12 - 15 мл. Для определения золотистого стафилококка используют желточно - солевой агар, для определения плесневых и дрожжевых грибов - среду Сабуро.

Методика исследования воздуха.

Доставленные чашки с посевами на питательном агаре и желточно - солевом агаре инкубируют в термостате при 37 град. C в течение 24 часов, посевы на желточно - солевом агаре дополнительно выдерживают еще 24 часа при комнатной температуре.

Посевы на среде Сабуро инкубируют при температуре 22 - 28 град. C 4 суток. Для определения общей бактериальной обсемененности через 48 часов посевы просматривают, подсчитывают количество выросших колоний и производят пересчет на 1 куб. м.

Для определения количественного содержания золотистого стафилококка просматривают посевы на желточно - солевом агаре после 48-ми часов инкубации, колонии, подозрительные на стафилококк, подсчитывают и проводят идентификацию . После идентификации производят пересчет полученных результатов на 1 куб. м воздуха.
139.Бактериологическое исследование стерильных лекарственных средств.К ним относятся растворы для инъекций, глазные капли, препараты для детей до 1 года. Асептические лекарственные формы готовят в асептических условиях без стерилизации. Асептика - предупреждение попадания микробов в лекарственный препарат. Асептические и стерильные лекарственные формы го­товят в асептических условиях: 1. Требования к помещению. Помещение называется асептический блок. Уборка в нем производится 1раз в смену с использованием дезинфицирующих растворов (хлорамин Б - 1%, перекись водорода - 3%). Для стерилизации воздуха и поверхностей применяют бактерицидные лампы. Отбор проб для бактериологического исследования (силами центров ГСЭН) различных объектов в аптеках проводится не менее 2 раз в квартал. Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппарата Кротова Микробное число воздуха в асептическом блоке не должно превышать 500 - 750 до и 1000 МК/м3 после работы, а золотистого стафилококка, плесневых и дрожжевых грибов не должно быть в 250 л воздуха ни до, ни после работы. 2.Требования к аптечной посуде, дистиллированной воде. Они обрабатываются в автоклаве (120 ° - 1атм. - 45 мин. или 132 °- 2 атм. - 20 мин). 3. Требование к персоналу. Персонал работает в стерильной одежде ( халат, шапочка, бахилы, марлевая повязка), обрабатывает руки дезраствором. 4 ( 0,5% р-р хлорамина Б или этанол - 80%). В стерильных лекарственных формах содержание микроорганизмов не допускается, в асептических - допускается не более 10-15 в 1г (мл). Общее микробное число (ОМЧ) – количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г (мл) препарата, определяют по числу выросших колоний. Определение микробной обсемененности растительного лекарственного сырья В асептических условиях (в стерильной чашке Петри, обоженными ножницами и пинцетом) из листа или верхнего слоя корневища вырезают кусочек площадью 1 см2, который помещают в пробирку с 10 мл стерильного физиологического раствора и взбалтывают в течение 5 мин. Из полученного смыва готовят четыре десятикратных разведения (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000), для посева в связи с большой обсемененностью растительного сырья используют два последних (1: 1000 и 1: 10000) разведения. В стерильную чашку Петри вносят 1 мл смыва, после чего в нее наливают 15 мл расплавленного и остуженного до 450С МПА, перемешивают и после застывания агара посевы инкубируют при 370С 24 - 48 ч. Производят подсчет выросших колоний на поверхности и в глубине агара. Полученное число колоний следует умножить на степень разведения. Бактериологическое исследование стерильных лекарственных средств Инъекционные растворы, глазные капли, лекарственные средства для новорожденных, другие лекарственные препараты, стерилизуемые в процессе их изготовления, засевают неразведенными в тиогликолевую среду для определения микробной обсемененности и среду Сабуро для выявления дрожжевых и плесневых грибов.
140.В аптеках согласно инструкции, утвержденной приказом Министерства здравоохранения, не менее двух раз в квартал осуществляется бактериологический контроль, объектами которого служат:

·Водаочищеннаядляприготовленияинъекционныхрастворовиглазныхкапель–инъекционныерастворыдостерилизации; глазныекапли, приготовленныевасептическихусловияхнастерильныхосновах (т.е. изготовляемыевсамихаптеках).

вода дистиллированная;

· инъекционные растворы до и после стерилизации;

· глазные мази после стерилизации;

· глазные капли, приготовленные в асептических условиях на стерильной основе;

· сухие лекарственные вещества, используемые для приготовления инъекционных растворов;

· нестерильные лекарственные формы;

· аптечная посуда, пробки, прокладки, прочие материалы;

· инвентарь, оборудование, руки, санитарная одежда персонала;

· воздух аптечных помещений.
141.Практически во всех группах микроорганизмов имеются возбудители болезней растений .К фитопатогенным микроорганизмам относят грибы,бактерии,вирусы,актиномицеты.Первое место среди фитопатогенных микробов принадлежит грибам, это связано с более кислой средой тканей растений, которая благоприятствует развитию больше грибов, чем бактерий. Тем не менее, известно довольно много бактериальных болезней растений (бактериозами).Источники заражения фитопатогенными микроорганизмами различны. Одним из важнейших источников заражения являются семена,остатки больных растений,некоторыенасекомыеПереносить фитопатогенные микроорганизмы может также вода.Бактерии вызывают свыше 200 болезней растений. Большой ущерб причиняют бактериозы овощным, плодовым, техническим культурам. Длина бактериальной клетки составляет 0,5 - 4,1 мкм, диаметр от 0,3-0,8 мкм. Преобладающая форма грамотрицательных фитопатогенных бактерий палочковидная (исключение Streptomyces, которые имеют нитчатое строение). Большинство фитопатогенных бактерий подвижны за счет жгутиков, неподвижных форм немного. Бактерии могут иметь один или несколько жгутиков. У большинства подвижных фитопатогенных бактерий жгутики полярные, реже - перитрихиальное их расположение. Бактериальная клетка окружена толстой многослойной оболочкой - клеточной стенкой. Поверхность некоторых фитопатогенных бактерий покрыта слизистым слоем - капсулой.Почти все фитопатогенные бактерии грамотрицательные; лишь виды родов Clavibacter и Streptomyces дают положительную реакцию. По характеру питания фитопатогенные бактерии - гетеротрофы, способные расти на питательных средах. На твердых питательных средах бактерии образуют колонии, окраска, форма, поверхность которых типична для данного штамма.Семейства,вызывающие заболевания растений(Pseudomonadaceae,Xanthomonadaceae,Rhizobiaceae,Entorobacteriaceae,Mycobacteriaceae,Bacilliaceae)

Актиномицетов относят к грамположительным бактериям. Вегетативное тело актиномицетов представлено очень тонкими (в 5—7 раз тоньше, чем грибные) ветвящимися гифами (мицелий). Размножаются актиномицеты участками мицелия или спорами. На питательных средах актиномицеты образуют сначала кожистые колонии (субстратный мицелий), которые затем покрываются воздушным мицелием. Сама колония врастает в агар субстратным мицелием. Питание актиномицетов не специализировано. Они используют различные животные и растительные остатки. Среди патогенных актиномицетов наибольший интерес представляют виды рода Streptomyces, вызывающие паршу у растений.
142.Пробы очищенной воды, используемойдляприготовленияинъекционныхрастворовиглазныхкапель, отбираютвстерильныефлаконывколичестве 15 - 20 куб. смнепосредственноиземкостей, вкоторыхосуществляетсястерилизация. Инъекционныерастворы (достерилизации) отбираютвовремяихприготовления, нонепозднееполуторачасов, идоставляютвлабораториювтехжефлаконах, вкоторыхонибудутподвергнутыстерилизации. Инъекционныерастворы, глазныекаплипослестерилизациииприготовленныеасептическимспособомдоставляютваптечнойупаковке.Исследованиедистиллированнойводыдляприготовленияинъекционныхрастворовиглазныхкапель.Определениеналичиябактерийгруппыкишечныхпалочекв 1,0 куб. см. Лекарственныесредствазасеваютвколичестве 1 г (куб. см) на 9 куб. смразведеннойглюкозо - пептоннойсреды, средыКесслериКода. Посевывыращиваютпритемпературе 37 град. C втечение 18 - 24 часовсдальнейшимвысевомсектораминасредуЭндо, последнююинкубируютпритемпературе 37С 18 - 24 часаипроводятпросмотрпосевов. Изподозрительныхколонийделаютмазки, красятпоГрамуимикроскопируют. Приналичииграмотрицательныхпалочекоставшуюсячастьколонийпересеваютнаглюкозо - пептоннойсредуспоплавком, инкубируютпри 37 град. C втечение 18 - 24 часов. Наличиекислотыигазанаглюкозо - пептоннойсредеобусловливаетсодержаниебактерийгруппыкишечныхпалочек.
143.При проведении исследования определяют

1.Общее число микроорганизмов, образующих колонии на питательномагаре.

2.Содержание общих и термотолерантныхколиформных бактерий(ОКБ и ТКБ)

3.Содержание спор сульфитредуцирующихклостридий.

4.Содержание колифагов.

Пробу в объёме 500 мл отбирают в стерильную ёмкость,снабжённую пробкой с колпачком, после предварительной стерилизации крана обжиганием и последующего спучка воды не менее 10 минут при полностью открытом кране.При отборе пробы напор воды уменьшают.

1.Определение ОМЧ.Вносят по 1 мл воды в 2 стерильны чашки Петри,затем в каждую чашку вливают 8-12 мл питательного агара,смешивают содержимое чашек на горизонтальной поверхности.После застывания агара,чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют 24ч при 37.Подсчитывают все выросшие на чашке колонии.Количество колоний суммируют и делят на 2.Результат-КОЕ в 1 мл пробы воды.Если подсчёт на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».Норматив в 1 мл питьевой воды-не более 50 КОЕ.

2.Определение общих и термотолерантныхколиформных бактерий(ОКБ и ТКБ)

1)Методом мембранной фильтрации(основной метод).Метод основан на фильтрации установленного объёма воды через мембранныефильтры,выращивание посевов на питательной среде с лактозой и идентификацией крлоний.Изучают 3 пробы по 100 мл.Фильтры помещают на чашки со средой Эндо и ставят в термостат дном вверх и инкубируют 24 часа при37.Если на фильтре есть рост изолированных типичных лактозоположительных колоний(красных)с отпечатком на обратной стороне фильтра,подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и подтверждают их принадлежность к ОКБ иТКБ.Для этого ставят оксидазный тест и определяют отношение к окраске по граму.После этого проводят вычисления по формуле.

2)Титрационнымметодом.Основан на накоплении бактерий после посева установленного объёма на жидкую средус пересевом на плотную средуслактозойПри качественном методе исследования засевают 3 по 100 мл,при количественном-3 по 100 мл,3 по 10 мл и 3 по 1 мл.Посевы инкубируют 48ч при 37..Приобнаружение помутнения в жидкой среде и обраования газа высеваем на среду Эндо,если они на ней ферментатируют лактозу до кислоты при 44 градусах и газа-есть ТКБ.Норматив-нет окб и ткб, в 100 мл воды.

3.Определение спор.Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках 15 минут при 75 для уничтожения вегетативных форм.Из каждой пробы делают посев или фильтруют 20 мл.

-методом фильтрования в пробирках:перед посевом железо-сульфитный агаррасплавляют.Послефильтрации,фильтр помещают в пробирку с горячим агаром.Пробирку быстро охлаждают в холодной воде.Посевы культивируют 16-18 часовпри 44.

-методом фильтрования в чашках Петри:чашки Петри заливают тонким слоем ЖСА.Послефильтрации,фильтрна застывшую питательную среду и заливают ЖСА до верхнего края чашки.

-прямым посевом: в стерильные пробирки вносятпо 5 или 10 млисследуеиойпробы,заливают горячим ЖСА,пробирку быстро охлаждают.В количественном подсчитываем отдельные чёрнвеколонии,выражают в КОЕ в 20мл.Норматив-споры должны отсутствовать.

4)Определениеколифагов

-титрационныйметод:определение предварительным накоплением в среде обогащения на культуре и выявлениизон лизиса на питательном агаре.Приналичии лизиса-присутствие колифагов.