Объект изучения микробиологии
 Скачать 6.2 Mb.
|
|
58.Понятие о биотехнологии. Использование достижений в практической микробиологии. Биотехнология - область знаний, которая возникла на основе достижений генной инженерии., изучая биотехнологические процессы, протекающие в живой клетке, использует эти процессы для получения полезных для человека веществ в промышленных условиях. Биотехнология — это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов. В качестве биологических объектов могут быть использованы организмы животных и человека (например, получение иммуноглобулинов из сывороток вакцинированных лошадей или людей; получение препаратов крови доноров), отдельные органы (получение гормона инсулина из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней) или культуры тканей (получение лекарственных препаратов). С помощью биотехнологических процессов получают профилактические, лечебные и диагностические препараты, в том числе вакцины, антибиотики, лечебные сыворотки и иммуноглобулины. Важнейшим достижением в биотехнологии стала технология рекомбинантных ДНК , более известная как генная инженерия. Она позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат и служит для получения генетически модифицированного организма (ГМО).Методы рекомбинантной ДНК открывают широкие перспективы в развитии медицины. В настоящее время получены рекомбинантные штаммы бактерий, продуцирующие инсулин, гормон роста,интерферон.С помощью этого метода получена рекомбинантная вакцина против гепатита В. . 59.Вакцины. Классификация вакцин. Требования предъявляемые к вакцинным препаратам. Вакцины-препараты, предназначенные для активной иммунопрофилактики,т.е.для создания активной специфической невоспроимчивости организма к конкретному возбудителю. Иногда исп-ют для лечения: дизентерия, бруцеллез. Классификация вакцин: Живые вакцины - приготавливают из специально полученных штаммов МО с ослабленной аттенуированной) вирулентностью и полноценным иммуногенными свойствами.Основное достоинство-полностью сохраненный набор АГ, что обеспечивает развитие длительной невосприимчивости даже после однократной иммунизации. Живые вакцины исп-ют для профилактики полиомиелита, чумы, краснухи,кори ,туберкулеза(БЦЖ). Убитые(инактивированные)-содержат инактивированные тем или иным способом МО. Для инактивации исп-ют разные методы – нагревание, УФ-облучение,УЗ, химич.в-ва (формальдегид,фенол,спирты). Получают путем выращивания МО на искусств.питат.средах или культурах клеток. После инактивации проводят выделение антигенных комплексов, их очистку. Иммунногенность убитых вакцин ниже, чем у живых. Поэтому вызываемый ими иммунитет кратковременный. Относятся вакцины против брюшного тифа, паратифов, холеры, коклюша, гриппа, полиомиелита. Химические(компонентные) - создаются из антигенных компонентов, извлеченных из микробной клетки. Выделяют те антигены, которые определяют иммуногенные характеристики микроорганизма. Примером служит брюшнотифозная вакцина,состоящая из О-антигенов(соматических), против гриппа(вирусные нейраминидазы и гемагглютинины),пневмококков(на основе полисахаридных капсул). Для придания более высокой иммуногенности компонентные вакцины нередко добавляют адъюванты (сорбируют на гидроксиде алюминия). Анатоксины - обезвреженные формалином экзотоксины возбудителей токсинемических инфекций. Формирует напряженный иммунитет на 4-5 лет. Молекулярные вакцины в них антиген находится в молекулярной форме или даже в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность т. е. в виде эпитопов, детерминант. Рекомбинатные (генно-инженерные) - вакцины, полученные с помощью генной инженерии. В генетический аппарат неболезнетворного вируса встраивают участок ДНК болезнетворного вируса. Такие вакцины дают напряженный иммунитет (вакцина против вирусного гепатита В). Корпускулярные вакцины - представляют собой бактерии или вирусы, инактивированные химическим (формалин, спирт, фенол) или физическим (тепло, ультрафиолетовое облучение) воздействием(противочумная, антирабическая). Вакцины, содержащие антигены бактерий и анатоксины, на зываются ассоциированными. Примерами ассоциированных вак цин являются: вакцина АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столб-нячная вакцина), в которой коклюшный компонент представлен убитой коклюшной вакциной, а дифтерийный и столбняч ный — соответствующими анатоксинами; Существуют общие требования ко всем вакцинам. Любой рекомендуемый для вакцина¬ции препарат должен быть: иммуногенным, безопасным, нереактогенным, не вызывать аллергических реакций, не обладать тератогенностью, онкогенностью; штаммы, из которых готовят вакцину, должны быть генетически стабильными, вакцина должна обладать длительным сроком хранения, производство ее должно быть технологичным, а способ применения — по возможности, простым и доступным для массового применения. 60. Анатоксины, их получение и практическое применение. Анатоксины - обезвреженные формалином экзотоксины возбудителей токсинемических инфекций (дифтерийный анатоксин, столбнячный, ботулинический, гангренозный, стафилококковый). Формирует напряженный иммунитет на 4-5 лет. Получают из вышеперечисленных возбудителей инфекций, выращивают на жидких питат.средах для накопления токсина, затем фильтруют через бактериальные фильтры для удаления микробных клеток . К фильтрату добавляют 0,3-0,4% формалина и выдерживают его при 370C 3-4недели до полного исчезновения токсических свойство, очищают. Исп-ют для активной иммунопрофилактики токсинемических инфекций ( столбняка, дифтерии, ботулизма). 61. Диагностикумы (бактериальные, эритроцитарные, вирусные), получение и использование. Диагностикумы. Получение, применение. В диагностических целях при обнаружении антител в сы воротке крови больных, реконвалесцентов и бактерионосите лей используются серологические реакции. Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроор ганизмов или определенные антигены. Необходимость использования диагностикумов для сероло гических реакций связана не только с явным их преимущест вом перед живыми культурами микробов (безопасность в ра боте), но еще и потому, что для приготовления диагностикумов подбираются штаммы микроорганизмов с высокой чувст вительностью к антителам и способностью длительно сохра нять антигенные свойства. Для инактивации микроорганизмов при приготовлении диагностикумов чаще всего используются химические вещест ва, особенно формалин, являющийся лучшим консервантом. Убитые нагреванием микробы хуже сохраняют антигенные свойства и применяются редко. В серологических реакциях (реакции агглютинации, реак ции пассивной гемагглютинации, реакции связывания компле мента, реакции торможения гемагглютинации) для выявления специфических антител применяются: бактериальные, эритроцитарные и вирусные диагностикумы. Бактериальные диагностикумы могут содержать инактивированную микробную взвесь или отдельные антигенные компоненты бактерий: О, Н или Vi-антигены и используются в реакциях агглютинации. Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с ад сорбированными на них антигенами, извлеченными из бакте рий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выяв ления антигена в выделениях больных, в тканях и др., при меняют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сен сибилизированные антителами. Вирусные диагностикумы — препараты, содержащие инактированные вируссодержащие жидкости (культуральные, из куриных эмбрионов или организма животных, зараженных соответствующим вирусом), применяются в РСК (реакции связывания комплемента), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции нейтрализации. В настоящее время в лабораториях используются следу ющие диагностикумы. 1. Бактериальный диагностикум сальмонелл тифа. Приме няется в реакции агглютинации для обнаружения антител в сыворотке больных. 2. Сальмонеллезные О-диагностикумы содержат О-антигены различных групп сальмонелл (инактивированных 15%-ным раствором глицерина). Применяются для выявления О-антител при сальмонеллезных инфекциях в реакции агглю тинации с сывороткой больных. 3. Сальмонеллезные Н-монодиагностикумы. Исполь зуются в реакции агглютинации для определения заболевания в прошлом (анамнестическая реакция агглютинации) и реже с диагностической целью. 4. Vi — брюшнотифозный диагностикум. Применяется в реакции агглютинации при выявлении брюшноти фозного бактерионосительства. 5. Единый бруцеллезный диагностикум — взвесь бруцелл (инактивированных фенолом), подкрашенная метиленовым синим. Применяется для определения антител в сыворотках крови больных бруцеллезом людей и животных в реакциях агглютинации Райта и Хеддльсона. 6. Эритроцитарный сальмонеллезный О-диагностикум — взвесь эритроцитов с адсорбированными на них О-антигенами различных групп сальмонелл. Используется для постановки РПГА с сывороткой больного при уточнении клинического диагноза сальмонеллезной инфекции. 7. Эритроцитарный Vi-диагностикум — эритроциты, сенси билизированные очищенным Vi-антигеном S. typhi, применяет ся в РПГА при выявлении брюшнотифозного бактерионоси тельства. 8. Гриппозный диагностикум представляет собой аллантоисную жидкость инфицированных вирусом гриппа (типов А, В) куриных эмбрионов и инактивированную мертиолатом или формалином. Диагностикумы необходимы при постановке РТГА с парными сыворотками больных для уточнения кли нического диагноза и циркулирующего типа вируса гриппа. 9. Диагностикум вируса клещевого энцефалита получают из суспензии мозга белых мышей, зараженных вирусом кле щевого энцефалита. Суспензию подвергают центрифугирова нию (для осветления) и инактивируют химическими вещест вами. Диагностикум используется в РТГА и РСК с сывороткой больных при диагностике заболевания. 62. Диагностические сыворотки, получение и использование. Диагностические иммунные сыворотки широко применяются для определения вида или типа микроба, выделенного от больного или носителя и для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии. В зависимости от характера антигена, послужившего для иммунизации животного, сыворотка последнего приобретает различные свойства. Специфические свойства иммунных сывороток могут быть обнаружены путем изучения действия их на соответствующие антигены. В зависимости от условий опыта у таких сывороток можно наблюдать агглютинирующее (склеивающее), преципитирующее (осаждающее) и литическое (растворяющее) действие. Применительно к наблюдаемым феноменам принято говорить о соответствующих иммунных телах, содержащихся в сыворотках: агглютининах, преципитинах, лизинах и пр. Агглютинирующие сыворотки При идентификации микробов, наряду с определением морфологических, культуральных и биохимических свойств их, широко используются диагностические агглютинирующие сыворотки. Агглютинацией называется склеивание микробов, скучивание их под влиянием специфических антител - агглютининов, содержащихся в иммунной сыворотке. Реакция агглютинации в настоящее время является наиболее часто применяемой, нередко единственной в смысле определения и выделения различных видов из группы морфологически неотличимых бактерий. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба и серологическую диагностику заболевания. Устранить групповую агглютинацию можно, удалив из сыворотки антитела в отношении антигенов, являющихся общими для гомологичного микроба и для родственных с ним. Это достигается путем смешения небольшого количества сыворотки с густой взвесью микробов, дающих групповую агглютинацию, что ведет к адсорбции на их поверхности соответствующих антител. В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба. Антитела, обусловливающие агглютинацию бактерий и иных клеток, получили название агглютининов, а сыворотки, содержащие эти антитела, агглютинирующих. Сыворотки получаются путем иммунизации животных соответствующими микробами. В качестве продуцентов агглютинирующих сывороток могут быть использованы кролики, бараны, козы, ослы и лошади. Наиболее свободными от неспецифических антител являются сыворотки кроликов. Для иммунизации животных можно применять живые и убитые культуры, являющиеся типичными по своим морфологическим, культуральным, биохимическим, серологическим и антигенным свойствам. Лучшие результаты получаются при применении формалинизированных и обработанных парами формалина микробных взвесей. Иммунизацию проводят путем введения антигена в краевую ушную вену, начиная с 500 млн. микробных тел в 1 мл и увеличивая дозу вдвое при последующих введениях. Для получения полноценных сывороток обычно бывает достаточно 3-4 инъекций с интервалами в 5 дней. На 5-7 день после третьей иммунизации берется проба крови и проверяется титр сыворотки. Титром сыворотки считается то наибольшее ее разведение, с которым получается реакция агглютинации соответствующей культуры, оцениваемая тремя крестами при помощи агглютиноскопа. Если титр сыворотки оказывается достаточным, то в тот же день у кролика производится кровопускание. Кровь можно получить тремя способами: 1) из ушной вены; 2) из сердца; 3) из сонной артерии (тотальное кровопускание). Кровь по каплям собирается в большую стерильную пробирку. Полученная кровь ставится на 10-15 минут в термостат, образовавшийся сгусток отделяется от стенок пробирки, после чего кровь выдерживается в течение 24-48 часов в рефрижераторе при температуре 4-8 °С. В настоящее время от крупных животных (лошади, ослы и др.) кровь берут в бутыли с цитратным раствором. Плазму дефибринируют раствором хлористого кальция. К полученной сыворотке добавляется консервант. Сыворотка (в нативном виде) выдерживается не менее 1 месяца при температуре 4-8 °С для стабилизации титра, после чего определяется окончательный титр ее к гомологичным штаммам и наличие групповой реакции путем постановки реакции агглютинации с набором соответствующих живых культур в количестве 3-5 штаммов каждого вида. Титр групповых агглютининов не должен превышать 1/8 титра к гомологичным культурам. Институтами вакцин и сывороток выпускаются неадсорбированные и адсорбированные агглютинирующие сыворотки. Специфические адсорбированные агглютинирующие сыворотки получают путем удаления методом адсорбции неспецифических и групповых антител из нативных сывороток. Использование адсорбированных сывороток дает возможность определения выделенного микроба в пределах вида или типа при помощи реакции агглютинации на стекле без дополнительной постановки развернутой агглютинации. Для адсорбции агглютинирующих сывороток в качестве адсорбента могут применяться живые и убитые бактерии. Наилучшей адсорбционной способностью обладает живая культура, содержащая все антигенные компоненты в неизмененном виде. Полученные микробные взвеси перед употреблением центрифугируются в необходимом количестве и добавляются к адсорбируемой сыворотке. Адсорбцию сывороток следует начинать адсорбентами, имеющими близкое родство с культурой, примененной для получения данной сыворотки. Сыворотка с адсорбентом помещается в термостат при 37 °С на срок от 2 до 18 часов и затем в рефрижератор до следующего дня. Истощаемая сыворотка после каждой адсорбции проверяется в реакции агглютинации на стекле как с культурами того вида, которыми ведется истощение, так и с культурами, реагировавшими с ней при первоначальном контроле, а также с гомологичными культурами. Полностью адсорбированные сыворотки освобождаются от микробных тел путем центрифугирования или сепарирования. Если к нативной сыворотке не добавлялся консервант, то к полученной серии сыворотки следует добавить 1-2 % перекристаллизованной борной кислоты. Затем сыворотка фильтруется через стерилизующий бактериальный фильтр и после выдерживания в течение 2-х суток при комнатной температуре испытывается на стерильность, специфичность и высоту титра. Контроль на специфичность адсорбированных агглютинирующих сывороток проводится до и после фильтрования - реакцией агглютинации на стекле и развернутой реакцией агглютинации с гомологичными и гетерологичными культурами. Ясно выраженная положительная реакция агглютинации, получаемая с 3-5 гомологичными культурами в течение 1 минуты при комнатной температуре, при отсутствии реакции агглютинации с культурами других серологических типов в течение 20 минут служит критерием для выпуска адсорбированных сывороток. Диагностические агглютинирующие сыворотки разливаются по 1 мл в соответствующие ампулы, которые упаковываются по нескольку штук (не более 10) в коробку. Агглютинирующие сыворотки необходимо хранить в темном сухом месте при 4-10 °С. При правильном содержании сыворотка сохраняет свою активность в течение одного года со дня изготовления. Агглютинирующие адсорбированные сыворотки выпускаются и в сухом виде. Сыворотки перед высушиванием в стерильных условиях разводят сахарозо-желатиновой средой, разливают по 1 мл в стерильные ампулы и высушивают из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума. Преципитирующие сыворотки Преципитирующие сыворотки применяются для постановки реакций преципитации с целями диагностики некоторых инфекционных заболеваний, для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии, в судебно-медицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови, в санитарии, химии и т.д. Реакция преципитации характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить ничтожные следы антигена (до разведения 1:100000 и выше). Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. Преципитирующие сыворотки получаются путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток. Наилучшие преципитирующие сыворотки получаются при иммунизации полным антигеном или соляно-кислой вакциной. Применяемую для иммунизации животных экстрагированную соляно-кислую вакцину готовят следующим образом: густой смыв суточной культуры дважды промывают (при центрифугировании) физиологическим раствором и обрабатывают десятикратным количеством 0,2 N соляной кислоты в течение 18-24 часов при температуре 37 °С. Затем центрифугируют, полученный осадок микробных тел дважды промывают физиологическим раствором и нейтрализуют 25 % раствором углекислой соды. Полученную вакцину оставляют в виде осадка. Преципитирующие сыворотки готовятся подобно агглютинирующим, только выпускаются они с высокими титрами, не ниже 1:100000, что достигается более длительной иммунизацией животных. Небольшие дозы (0,5 мл) антигена вводятся в течение 2-3 недель по 3 дня подряд с перерывом в 4 дня. Более массивные дозы (1-2-3 мл) вводятся с интервалами в 4-6 дней по 8-12-16 раз. Значительной эффективностью обладает разделение иммунизации на несколько циклов, из которых один производится внутривенно (6-8 инъекций по 1-2 мл), а другой - крупными дозами внутрибрюшинно (6-8 инъекций по 3-5 мл). Кровопускание производится на 8-12-й день после последнего введения антигена. Полученная сыворотка консервируется добавлением 1-2 % сухой борной кислоты или 0,5 % хлороформа. Готовый препарат контролируют на специфичность, стерильность и высоту титра. При титровании преципитирующей сыворотки определяется то предельное разведение антигена, которое может быть обнаружено при помощи цельной или разведенной иммунной сыворотки. 62.Живые вакцины, получение и применение, достоинства и недостатки. Живые аттенуированные вакцины конструируются на основе ослабленных штаммов микроорганизмов, потерявших вирулентность, но сохранивших антигенные свойства. Такие штаммы получают методами селекции или генетической инженерии. Живые вакцины при введении в организм приживляются, размножаются, вызывают генерализованный вакцинальный процесс и формирование специфического иммунитета к патогенному микроорганизму, из которого получен аттенуированный штамм. Получают живые вакцины путем выращивания аттенуированных штаммов на питательных средах, оптимальных для данного микроорганизма. Бактериальные штаммы культивируют или в ферментерах на жидких питательных средах, или на твердых питательных средах; вирусные штаммы культивируют в куриных эмбрионах, первично-трипсинизированных, перевиваемых культурах клеток. Процесс ведут в асептических условиях. Биомассу аттенуированного штамма подвергают концентрированию, высушиванию со стабилизирующей средой, затем ее стандартизируют по числу микроорганизмов и фасуют в ампулы или флаконы. Консервант к живой вакцине не добавляют. Срок годности вакцины ограничен 1.2 годами, вакцина должна храниться и транспортироваться при пониженной температуре (от 4 до 8 .С). Живые вакцины применяют, как правило, однократно; вводят их подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины . перорально (полиомиелит) и ингаляционно. Живые вакцины составляют примерно половину всех применяемых в практике вакцин. Наиболее важные для иммунопрофилактики живые вакцины приведены ниже. Бактериальные живые вакцины: туберкулезная (из штамма БЦЖ); чумная (из штамма EV); туляремий-ная, сибиреязвенная (из штамма СТИ-1); бруцеллезная (из штамма 19-ВА); против Ку-лихорадки. Вирусные живые вакцины: оспенная (на основе вируса оспы коров); коревая (из штамма Л-16 и штамма Эдмонстон); полиомиелитная (из штаммов А. Сэбина типов 1, 2, 3); против желтой лихорадки (из штамма 17D); гриппозная (из лабораторных штаммов); против венесуэльского энцефаломиелита лошадей (из штамма 230); паротитная Положительные стороны: по механизму действия на организм напоминают "дикий" штамм, может приживляться в организме и длительно сохранять иммунитет (для коревой вакцины вакцинация в 12 мес. и ревакцинация в 6 лет), вытесняя "дикий" штамм. Используются небольшие дозы для вакцинации (обычно однократная) и поэтому вакцинацию легко проводить организационно. Последнее позволяет рекомендовать данный тип вакцин для дальнейшего использования. Отрицательные стороны: живая вакцина корпускулярная - содержит 99% балласта и поэтому обычно достаточно реактогенная, кроме того, она способна вызывать мутации клеток организма (хромосомные аберрации), что особенно опасно в отношении половых клеток. Живые вакцины содержат вирусы- загрязнители (контаминанты), особенно это опасно в отношении обезьяннего СПИДа и онковирусов. К сожалению, живые вакцины трудно дозируются и поддаются биоконтролю, легко чувствительны к действию высоких температур и требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи. Хотя живые вакцины требуют специальных условий хранения, они продуцируют достаточно эффективный клеточный и гуморальный иммунитет и обычно требуют лишь одно бустерное введение. Большинство живых вакцин вводится парентерально (за исключением полиомиелитной вакцины). На фоне преимуществ живых вакцин имеется и одно предостережение, а именно: возможность реверсии вирулентных форм, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. По этой причине живые вакцины должны быть тщательно протестированы. Пациенты с иммунодефицитами (получающие иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны получать такие вакцины. 64.Инактивированные, корпускулярные вакцины. Приготовление и применение. Достоинства и недостатки. Для профилактики вирусных заболеваний широко применяют инактивированные вакцины, которые имеют ряд преимуществ перед живыми вакцинами. Важным условием эффективности вакцин является количество и качество вирусного антигена, выбор инактиватора и оптимальных условий инактивации, позволяющих полностью лишить вирус инфекционности при максимальном сохранении антигенности. Понятие «инактивированный» относится к жизнеспособности вирусов, входящих в состав вакцины. Инактивированные вирусные вакцины обычно готовят из вирулентных вирусов, разрушая вирулентность химическими(ацетон) или физическими(нагревание) методами при сохранении иммуногенности. Такие вакцины должны быть безопасны и содержать большое количество вирусного антигена, чтобы вызвать иммунный ответ и образование антител. Среди первых инактивированных вирусных вакцин были вакцины против бешенства, желтой лихорадки, ящура, классической чумы свиней, чумы плотоядных, ньюкаслской болезни и оспы животных. Поскольку не все из созданных вакцин оказались эффективными, а некоторые из них таили угрозу инфицирования из-за недостаточной полноты инактивации вируса, многие исследователи стали отдавать предпочтение живым вакцинам, приготовленным на основе аттенуированных штаммов. Лучшим примером живых вакцин служит вакцина против оспы людей. Убитые корпускулярные вакцины представляют собой препараты, приготовленные из штаммов бактерий и вирусов, убитых (инактивированных) либо мягким нагреванием («гретые» вакцины), либо химическими веществами (формалин, спирт, ацетон и др.). Они менее иммуногенны по сравнению с живыми, что определяет необходимость их многократного введения, как правило, парентерального. К числу наиболее известных убитых корпускулярных вакцин следует отнести брюшнотифозную (гретую, спиртовую), коклюшную, лептоспирозную и вакцину против клещевого энцефалита. Убитые вакцины более устойчивы при хранении, чем живые, однако их замораживание с последующим оттаиванием может привести к изменению их физических и биологических свойств. Положительные стороны: Корпускулярные убитые вакцины легче дозировать, лучше очищать, они длительно хранятся и менее чувствительны к температурным колебаниям. Отрицательные стороны: вакцина корпускулярная - содержит 99 % балласта и поэтому реактогенная, кроме того, содержит агент, используемый для умерщвления микробных клеток (фенол). Еще одним недостатком инактивированной вакцины является то, что микробный штамм не приживляется, поэтому вакцина слабая и вакцинация проводится в 2 или 3 приема, требует частых ревакцинаций (АКДС), что труднее в плане организации по сравнению с живыми вакцинами. Инактивированные вакцины выпускают как в сухом , так и в жидком виде. 65. Химические (субклеточные вакцины) вакцины. Получение и применение. Роль адъювантов. Химические вакцины -препараты, содержащие наиболее активные по иммунологическим свойствам антигены, извлекаемые из микробных клеток различными методами (например, ферментативным перевариванием с последующим осаждением антигена этиловым спиртом). Следует помнить, что термин «химическая вакцина» не вполне точен, так как подобные вакцины не являются химическими веществами в чистом виде, а представляют собой группы антигенов, эндотоксины и т. д. Химические вакцины изготовляются путем сложной химической и ферментативной обработки бактериальных культур с целью извлечения из них растворимых антигенов в чистом виде; бактериальные клетки и их фрагменты при этом отсеиваются как балластные вещества, не обладающие иммуногенными свойствами и повышающие реактогенность. Преимущества химических вакцин: 1) из микробных клеток выделяются иммунологически активные субстанции — изолированные антигены (комплекс — липополисахариды с полипептидами или протективные антигены); 2) они менее реактогенны; 3) стабильны и лучше подвергаются стандартизации, что дает возможность более точной дозировки; 4) вводятся в больших дозах и в виде ассоциированных препаратов. Одним из недостатков химической вакцины являются небольшие размеры вводимых комплексов, что приводит к быстрому выведению их из организма и краткому антигенному раздражению. Поэтому химические вакцины вводятся на адъювантах (от adjuvans — помогающий), в качестве которых используются различные минеральные адсорбенты (гидрат окиси алюминия, фосфат кальция, минеральные масла). Адъюванты способствуют повышению эффективности вакцинации, так как они укрупняют антигенные частицы, создают в месте введения «депо», из которого происходит замедленная резорбция антигена, что приводит к перманентному антигенному раздражению. Кроме того, депонирующие вещества являются неспецифическими стимуляторами, вызывают приток плазматических клеток, непосредственно участвующих в выработке антител, что связано с развитием местного воспалительного процесса и стимуляцией пролиферативной и фагоцитарной активности ретикулоэндотелиальной системы. 66.Ассоциированные и комбинированные вакцины. Достоинства. Ассоциированные вакцины – препараты, включающие несколько разнородных антигенов и позволяющие проводить иммунизацию против нескольких инфекций одновременно. Если в препарат входят однородные антигены, то такую ассоциированную вакцину называют поливакциной. Если же ассоциированный препарат состоит из разнородных антигенов, то его целесообразно называть комбинированной вакциной. Они представляют собой препараты, состоящие из микробного антигенного компонента (обычно выделенного и очищенного или искусственно синтезированного антигена возбудителя) и синтетических полиионов (полиакриловая кислота и другие) - мощных стимуляторов иммунного ответа. Содержанием этих веществ они и отличаются от химических убитых вакцин. Возможна так же комбинированная иммунизация, когда одновременно вводят несколько вакцин в различные участки тела, например, против оспы (накожно) и чумы (подкожно). Примером поливакцины можно считать живую полиомиелитную поливакцину, содержащую аттенуированные штаммы вируса полиомиелита I, II, III типов. Примером комбинированной вакцины является АКДС, куда входят инактивированная корпускулярная коклюшная вакцина, дифтерийный и столбнячный анатоксин. Комбинированные вакцины применяются в сложной противоэпидемической обстановке. В основе их действия лежит способность иммунной системы отвечать на несколько антигенов одновременно. 67. Антимикробные сыворотки. Получение и применение. Антимикробные сыворотки содержат антитела против клеточных антигенов возбудителя. Их получают иммунизацией животных клетками соответствующих возбудителей, и дозируют в миллилитрах. Антимикробные сыворотки могут применяться при лечении: сибирской язвы, чумы, стрептококковых инфекции, стафилококковой инфекции, синегнойной инфекций. Их назначение определяется тяжестью течения заболевания и в отличие от антитоксических не является обязательным. При лечении больных с хроническими, длительно, вяло текущими формами инфекционных заболеваний, возникает необходимость стимулировать собственные механизмы специфической зашиты путем введения различных антигенных препаратов и создания активного приобретенного искусственного иммунитета (иммунотерапия антигенными препаратами). Для этих целей используются в основном лечебные вакцины, и значительно реже - аутовакцины или стафилококковый анатоксин. 68.Антитоксические сыворотки. Получение, очистка, титрование и применение. Антитоксические сыворотки содержат антитела против экзотоксинов. Антитоксические сыворотки получают путем гипериммунизации (т. е. многократной интенсивной иммунизации) животных (чаще всего лошади, ослы, иногда кролики) специфическим антигеном (анатоксином) с последующим, в период максимального антитело-образования, кровопусканием и выделением из крови иммунной сыворотки. Иммунные сыворотки, полученные от животных, называют гетерогенными, так как они содержат чужеродные для человека сывороточные белки. Для получения гомологичных нечужеродных сывороток используют сыворотки переболевших людей (коревая, паротитная, оспенная сыворотки) или специально иммунизированных людей-доноров (противостолбнячная, противоботулиническая и другие сыворотки) либо СЫВОРОТКИ из плацентарной, а также абортной крови, содержащие антитела к ряду возбудителей инфекционных болезней вследствие вакцинации или перенесенного заболевания. Естественно, что гомологичные сыворотки предпочтительнее гетерологичных. Поскольку нативные иммунные сыворотки содержат в своем составе ненужные балластные белки, например альбумин, из этих сывороток выделяют и подвергают очистке и концентрированию специфические белки — иммуноглобулины. Для очистки и концентрирования иммуноглобулинов используют различные физико-химические методы: осаждение спиртом или ацетоном на холоде, обработка ферментами, аффинная хроматография, ультрафильтрация. Титрование антитоксических сывороток может производиться тремя методами: по Району, Эрлиху и Ремеру: Метод Района. Осуществляется с помощью реакции флоккуляции по известному анатоксину или токсину, одну Lf которых нейтратизует одна единица антитоксина. Первичная, или инициальная, реакция флоккуляции наступает при соответствии количества антигенных единиц анатоксина количеству антитоксинов в исследуемой сыворотке. Исходя Из результатов первичной реакций флоккуляции и ведут расчет антитоксических единиц в 1 мл испытуемой сыворотки. Однако метод Района является только ориентировочным. Метод Эрлиха. Перед титрованием сывороток определяют условную смертельную (опытную) дозу токсина. За опытную дозу токсина (Lt) принимается то его количество, которое в смеси с 1ME стандартной сыворотки вызывает гибель 50% взятых в опыт животных. На втором этапе титрования к различным разведениям испытуемой сыворотки добавляют опытную дозу токсина, смесь выдерживают 45 мин и вводят животным. По получаемым результатам производят раечет титра испытуемой антитоксической сыворотки. Метод Ремера. Титрование также осуществляется в два этапа, но данный метод является более экономичным, так как опыт проводится на одном животном. Предварительно определяется опытная некротическая доза токсина — Ln (Limes necrosis) введением внутрикожно морской свинке различного количества токсина со стандартной сывороткой. За некротическую дозу токсина принимается то его наименьшее количество, которое при внутрикожном введении морской свинке в смеси с 1/50 MEстандартной антитоксической сыворотки вызывает на месте введения некроз на 4—5-й день. Затем различные объемы испытуемой сыворотки в смеси с оттитро ванной некротической дозой токсина вводят внутрикожно морской свинке и по результатам производят расчет титра сыворотки. По методу Ремера титруется противодифтерийная сыворотка. Активность антитоксических сывороток выражают в антитоксических единицах, в титрах вируснейтрализующей, гемагглютинирующей, преципитирующей, агглютинирующей и т. д. активности, т. е. тем наименьшим количеством антител, которое вызывает видимую или регистрируемую соответствующим способом реакцию с определенным количеством специфического антигена. Антитоксические сыворотки применяют с лечебной и профилактической целью. Особенно эффективно применение сывороточных препаратов для лечения токсинемических инфекций (столбняк, ботулизм, дифтерия, газовая гангрена), а также для лечения бактериальных и вирусных инфекций (корь, краснуха, чума, сибирская язва и др.) в комплексе с другими способами лечения. 69.Иммуноглобулины. Получение и применение. Иммуноглобулины- это растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены. Иммуноглобулины синтезируются В-лимфоцитами (плазматическими клетками) в ответ на чужеродные вещества определенной структуры — антигены. Ig получают осаждением сыворотки крови, что освобождает их от балластных компонентов. Затем препараты очищают и концентрируют. Иммуноглобулин применяют для лечения и профилактики кори, клещевого энцефалита, стафилококковых инфекции, столбняка и др. Выделяют пять классов антител (иммуноглобулинов) — IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, различающихся между собой по строению и аминокислотному составу тяжёлых цепей и по выполняемым эффекторным функциям. Иммуноглобулин G. Количество иммуноглобулинов G составляет около 70% всех сывороточных иммуноглобулинов. Функции иммуноглобулинов G: • проникают через плацентарный барьер, обеспечивая организму новорожденного естественный пассивный иммунитет; • активно участвуют в развитии иммунного ответа и одновременно регулируют его; • являются поздними антителами против полисахаридных антигенов бактерий; • участвуют в активации комплемента; • усиливают фагоцитоз. Иммуноглобулины G вырабатываются при обязательном участии Т-лимфоцитов. Поэтому воздействия на иммунную систему, такие, как облучение и прием иммунодепрессантов подавляют синтез иммуноглобулинов G. Иммуноглобулин М. Составляют 5 -10% от общего количества. Функции иммуноглобулинов М: • первыми синтезируются в организме новорожденного; • являются ранними антителами против вирусов и грамотрицательных бактерий; • участвуют в активации комплемента; • усиливают фагоцитоз. К классу иммуноглобулинов М принадлежат холодовые агглютинины, антитела против стрептококка,ревматоидный фактор, агглютинины групп крови. Иммуноглобулины М привлекают фагоциты в очаг инфекции и активируют фагоцитоз. Являются слабоспецифичными, могут связывать одновременно пять молекул антигена. Это приводит к образованию больших иммунных комплексов, что способствует более быстрому выведению антигенов из циркуляции, и предотвращает прикрепление антигенов к клеткам. Агглютинирующая и комплементсвязывающая способности иммуноглобулинов М в сотни раз выше, чем у иммуноглобулинов G. Иммуноглобулин А. Составляют 10 -15% от общего количества. Функции иммуноглобулинов А: • защищают слизистые оболочки; • нейтрализуют вирусы и бактериальные токсины. Иммуноглобулины А в больших количествах содержатся в слюне, слезах, желудочном и кишечном секретах, желчи, во влагалище, легких, бронхах, мочеполовых путях. Богатым источником иммуноглобулина А является грудное молоко. Этим обеспечивается защита детей первых месяцев жизни при естественном вскармливании. Иммуноглобулин Е. Составляют около 0,2% от общего количества иммуноглобулинов. Функции иммуноглобулинов Е: • индуцируют аллергическую реакцию и анафилаксию; • защищают от паразитов; • активируют тканевые базофилы. Иммуноглобулины Е защищают слизистые оболочки, контактирующие с окружающей средой. Они прикрепляются к специфическим рецепторам поверхности тучных клеток и базофилов, и если происходит связывание с антигеном, то образуется комплекс, стимулирующий освобождение из клеток медиаторов аллергических реакций. Иммуноглобулин D. Составляют около 0,2% от общего количества иммуноглобулинов. Функции иммуноглобулинов D: • функционируют почти исключительно в качестве мембранных рецепторов для антигенов; • участвуют в дифференцировке лимфоцитов. 70. Методы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний проводится в трех основных направлениях: 1) поиски возбудителя заболевания в материале, взятом у больного (испражнения, моча, мокрота, кровь, гнойное отделяемое и др.); 2) обнаружение специфических антител в сыворотке крови — серологическая диагностика; 3) выявление повышенной чувствительности организма человека к возбудителям инфекционных заболеваний — аллергический метод. Для выявления возбудителя инфекционного заболевания и его идентификации (определения вида возбудителя) используют три метода: микроскопический, микробиологический (бактериологический) и биологический. Микроскопический метод позволяет обнаружить возбудителя непосредственно в материале, взятом у больного. Этот метод имеет решающее значение при диагностике гонореи, туберкулеза, заболеваний, вызываемых простейшими: малярии, лейшманиозов, балантидиаза, амебиаза. Возможности микроскопического метода при этих инфекциях обусловлены значительными морфологическими различиями возбудителей данных заболеваний. Особенности морфологии возбудителей играют основную роль в постановке диагноза. Однако микроскопический метод не позволяет поставить диагноз при таких инфекциях, как, например, брюшной тиф и паратифы, дизентерия, потому что различить их возбудителей по морфологическим признакам невозможно (все они грамотрицательные палочки). Для того чтобы различить сходные между собой по морфологии микроорганизмы, их надо получить в чистой культуре и идентифицировать, что можно сделать с помощью микробиологического (бактериологического) метода исследования. Микробиологический метод заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации. Определение вида и типа возбудителя производят по ряду признаков: морфологии, способности окрашиваться различными красителями (тинкториальные свойства), характеру роста на искусственных питательных средах (культуральные свойства), ферментации углеводов и белков (биохимические свойства). Окончательную принадлежность выделенной культуры к определенному виду (типу) микроорганизмов устанавливают после изучения антигенной структуры, используя различные иммунологические реакции (агглютинации, преципитации, нейтрализации и др.). Если возбудители инфекционных заболеваний (риккетсии, вирусы, некоторые простейшие) не растут на искусственных питательных средах или необходимо выделить возбудителя из микробных ассоциаций, то используют метод заражения восприимчивых животных биологический. Биологический метод осуществляют путем выделения возбудителя заболевания или его токсина при заражении лабораторных животных, восприимчивых к данному заболеванию. Диагноз устанавливают по воспроизведению у животного типичной картины заболевания и по выделению чистой культуры возбудителя из различных органов путем посева на питательные среды в случае заражения животного микробными ассоциациями. Идентификацию выделенного возбудителя проводят до вида (типа), используя бактериологический метод. Биологический метод используют также при определении вирулентности возбудителей. Серологические методы диагностики инфекционных заболеваний основаны на выявлении специфических иммунных антител в сыворотке крови больного. Для этого используют различные иммунологические реакции: реакцию агглютинации при брюшном тифе (Видаля), реакцию Райта при бруцеллезе, реакцию связывания комплемента (Вассермана) при сифилисе, реакцию непрямой гемагглютинации при многих инфекционных заболеваниях, реакцию нейтрализации и торможения гемагглютинации при вирусных заболеваниях. Аллергический метод позволяет поставить диагноз инфекционного заболевания с помощью аллергических проб — накожных и внутрикожных. Метод выявляет повышенную чувствительность замедленного типа, возникающую в организме при многих инфекционных заболеваниях. Введение аллергена накожно или внутрикожно используют для диагностики бруцеллеза, туляремии, токсоплазмоза и других заболеваний. Для того чтобы правильно поставить диагноз инфекционного заболевания, чаще всего используют комплекс всех лабораторных методов: выделение возбудителя, определение антител в крови больного и выявление повышенной чувствительности замедленного типа. |