Объект изучения микробиологии

• Название: Объект изучения микробиологии
• Анкор: Mikra_1-10 (2).docx
• Дата: 26.12.2017
• Размер: 6.2 Mb.
• Имя файла: Mikra_1-10 (2).docx
• Тип: Документы; #13104
• страница: 11 из 29

Аллергические пробы - биологические реакции для диагностики ряда заболеваний, основанные на повышенной чувствительности организма, вызванной аллергеном.

При инфекционных заболеваниях развивается повышенная чувствительность организма к возбудителям и продуктам их жизнедеятельности.

Все аллергические пробы подразделяют на две группы — пробы invivoи invitro.

К первой группе {invivo)относятся кожные пробы, осуществляемые непосредственно на пациенте и выявляющие аллергию немедленного (через 20 мин) и замедленного (через 24 — 48 ч) типов.

Аллергические пробы invitroоснованы на выявлении сенсибилизации вне организма больного. Их применяют тогда, когда по тем или иным причинам нельзя произвести кожные пробы, .

Для проведения аллергических проб используют аллергены(диагностические препараты, предназначенные для выявления специфической сенсибилизации организма). это очищенные фильтраты бульонных культур, реже взвеси убитых микроорганизмов или АГ, выделенные из них.

Кожные пробы. Инфекционные аллергены вводят внутрикожно или накожно, втирая в участки кожи. При внутрикожном способе в среднюю треть передней поверхности предплечья специальной тонкой иглой вводят 0,1 мл аллергена. Через 28 - 48 ч оценивают результаты реакции ГЗТ, определяя на месте введения размеры папулы(сыпь).

Неинфекционные аллергены (пыльца растений, бытовая пыль, пищевые продукты, лекарственные и химические препараты) вводят в кожу уколом (прик-тест), накожно - втирая или внутрикожной инъекцией разведенного раствора аллергена. Результаты учитывают в течение 20 мин (ГНТ) по величине папулы (иногда до 20 мм в диаметре), наличию отека и зуда. Внутрикожные пробы ставят в случае отрицательного или сомнительного результата прик-теста. По сравнению с последним, дозу аллергена уменьшают в 100-5000 раз.

Кожные пробы на наличие ГЗТ применяют для выявления инфицированности людей микобактериями туберкулеза (проба Манту), возбудителями бруцеллеза (проба Бюрне), лепры (реакция Митсуды), туляремии, сапа, актиномикоза, дерматомикозов, токсоплазмоза, некоторых гельминтозов и др.

Пробы invitro. безопасны для больного, достаточно чувствительны, позволяют количественно оценить уровень аллергизации организма.

В настоящее время разработаны тесты для определения чувствительности, основанные на реакциях Т- и B-лимфоцитов, тканевых базофилов, выявлении общих специфических IgEв сыворотке крови и др. К ним относятся реакции торможения миграции лейкоцитов и бласттрансформации лимфоцитов, специфическое розеткообразование, базофильный тест Шелли, реакция дегрануляции тканевых базофилов, а также аллергосорбентные методы (определение специфических IgEв сыворотке крови).

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ). РТМЛ основана на подавлении миграции моноцитов и других лейкоцитов под действием медиаторов, вырабатываемых сенсибилизированными лимфоцитами, в присутствии специфического аллергена.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТ). В основе этой реакции лежит способность нормальных лимфоцитов периферической крови вступать в митоз и превращаться в бластные формы при культивировании их invitroпод действием специфических факторов — аллергенов и неспецифических стимуляторов митогенеза — митогенов (фитогемагглютинин, конканавалин А, липополисахариды и другие вещества).

Реакция специфического розеткообразования. Розетки — характерные образования, возникающие invitroв результате прилипания эритроцитов к поверхности иммунокомпетентных клеток. Розеткообразование может происходить спонтанно, поскольку Т-лимфоциты человека содержат рецепторы к эритроцитам барана. Спонтанное розеткообразование здоровых людей составляет 52 — 53% и служит показателем функционального состояния Т-лимфоцитов. Этот феномен воспроизводится также и в том случае, если используют эритроциты, на которых фиксированы соответствующие аллергены.

Реакция дегрануляции тканевых базофилов. Методика основана на том, что под действием аллергена происходит дегрануляция тканевых базофилов крысы, предварительно сенсибилизированных цитофильными AT из сыворотки крови больного.

Базофильный тест Шелли. Известно, что базофильные гранулоциты человека или кролика также дегранулируются в присутствии сыворотки больного и аллергена, к которому чувствителен данный пациент.

Определение антител класса IgEinvitro. Лабораторная диагностика заболеваний, в основе которых лежит ГНТ, основана на определении аллергенспецифических IgEанти-IgE. При использовании радиоактивной метки метод носит название радиоаллергосорбентного теста (PACT), но чаще в качестве метки используют фермент или флюоресцирующее вещество (ФАСТ). Время анализа — 6 — 7 часов. Принцип метода: фиксированный на твердой основе известный аллерген инкубируют с сывороткой крови больного; находящиеся в сыворотке специфические IgEанти-IgEсвязываются с аллергеном и, таким образом, остаются фиксированными на основе и могут вступать в специфическое взаимодействие с добавляемыми мечеными анти-IgE.

39) Реакции иммунитета. Их использование для диагностики инфекционных заболеваний.

Взаимодействие антигена с антителом имеет 2 стадии: Специфическую(Соединение активного центра антитела с антигеном, идёт быстро.) и неспецифическую(внешнее проявление реакции - медленно). Прочность комплекса антигена с антителом определяется гидрофобными, ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, водородными связями и называется аффинитетом. Суммарная сила взаимодействия поливалентного антитела( т.е. антитела с несколькими активными центрами) с несколькими детерминантами антигена- есть Авидность антител.

Реакции иммунитета используются для диагностики этиологии заболевания у больных и здоровых людей. Виды реакций:

1) Реакции агглютинации

2) Преципитации/

3)Реакция нейтрализации/

4) Реакции сучастием комплемента/

5)Реакции с использованием меченых антител/антигенов/

Реакции агглютинации - выявляет корпускулярные антигены т.е. антигены, расположенные на больших частицах(микрооргарнизмы, эритроциты.) Механизм: Двухвалентное антитело реагируя двумя активными центрами связывает антигены через их детерминанты. Проходит в изотоническом растворе электроолита(0,9%NaCl). Итог- образование осадка или хлопьев. Используют для определения антител в сыворотке крови больных(при тифе и паратифах - реакция Видаля), бруцеллёз( реакция Райта, Хеддлсона), туляремии, для определения групп крови.

Развёрнутая РА - в пробирке. К разведениям сыворотки больного добавляют взвесь убитых микроорганизмов(т.е. диагностикум). при 37 градусах отмечают максимальное разведение, где есть агглютинация - называют титром сыворотки крови. Разновидность - КРОВЯНО_КАПЕЛЬНАЯ ПРОБА НА ТУЛЯРЕМИЮ(нанесение убитых микроорганизмов на каплю крови и появление белёсого осадка) и реакция Хеддлсона на бруцеллёз(нанесение на каплю сыворотки диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).

Ориентировочная - На предметном стекле. проводят Для определения возбудителя, полученного от больного. К капле диагностической имунной сыворотки в разведении1:10, 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя. При образовании осадка(положительный результат) ставят развёрнутую РА с культурой выделенной от больного и разведениями диагностической сыворотки, причём увеличивая дозу сыворотки, добавляя в каждую дозу сыворотки 3 капли взвеси микроорганизмов. Реакция положительна, если агглютинация идёт в разведении лизком к титру диагностической сыворотки. В контрольном опыте осадка нет.

Реакции Прямой геммаглютинации. Прямая. т.к. исследуемые антигены- естественные компоненты эритроцитов. используется для установления групп крови. Используют стндартные сыворотки с анти-А и анти-B-агглютининами

непрямой ГемАгглютинации(РНГА, РПГА). Названы так, потому что используются антитела/антигены, искусственно сорбированные на разных корпускулярных часттицах. В основе лежит взаимодействие антиген+антитело. На эритроцитах находятся антитела/антигены, что из-за реакции с соответсвующими антителами/антигенами образуют фестончатый осадок. Используют для определения повышенной чувствительности к лекарствам, беременности, выявления инфекционных болезней.

реакция торможения пассивной(непрямой)гемангглютинации. Механизм: Антиген реагирует с антителом. Затем в смесь вносят эритроциты, что чувствительны к этому антигену. Если в среде не осталось свободных антигенов, то эритроциты не агглютинируются. Используется ля диагностики вирусных - корь краснуха, грипп, кл.энцефалит.

Коагглютинации- Антигены возбудителя определяют с помосчью стафиллококков,обработанных иммунной диагностической сывороткой. В ходе реакции образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител сыворотки и определяемого микроорганизма.

Метод Латекс -Агглютинации. Антиген/антитело взаимодействует с частицами латекса, что нагружены специфическими моноклальными Антигенами/антителами. через 15 мин - образуются видимые агрегаты(учёт ведётся при косом освещении на тёмном фоне). Используется для обнаружения менинго/стафило/стрептококков.

2)Преципитации - осаждение комплекса антиген - антитело(образование осадка или помутнение среды. В пробирках, нанесением раствора антигена на иммунную сыворотку.Реагент- гипериммунная сыворотка с высоким титром антител. при постановке разводят не сыворотку а антиген. Чувствительна.

реакция кольцепреципитации- на слой антисыворотки наслаивают жидкость с рвстворимым антигеном, через несолько секунд образуется кольцо преципитации. Разновидность это - Термопреципитация по Асколи - на сибирскую язву. В качестве антигенов используют прокипячённые и профильтрованные водные экстракты органов и тканей. В остальном не отличается от предыдущей.

Микропреципитации - для выявления низких титров антител(например при повышенной чувствительности к лекарству). Механизм - В сыворотку крови вносят антиген в убывающей концентрации, и если присутствует хоть какое-то(малое) количество антител, то оптическая плотность среды будет увеличена.

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони - растопленный агаровый гель выливают на стеклянную пластинку, после его затвердевания вырезают лунки(2-3мм), куда раздельно вмещают антигены и иммунные сыворотки, что диффундируя в агар образуют преципитат в виде белой полосы.

Радиальная иммуннодиффузия - сыворотку вносят в гель из агара. В лунки геля помесчают антиген, что диффундируя в гель, образует кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Используется для определения содержания иммуноглобулинов разных классов.

иммуноэлектрофорез - слой агара наносят на предметное стекло. На разных краях вырезают по лунке, куда вносят антигены,в центре - разделяющую их канавку. Далее проводят электрофорез 1-2 часа. Разные антигены перемещаются с разной скоростью между катодом(старт) и анодом (финиш).Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку, и через 5-7сут в геле образуются зоны преципитации. Для визуального эффекта огар окрашивают(амидо чёрный).

3)Реакция нейтрализации.

В основе этой реакции лежит способность специфической антитоксической сыворотки нейтрализовать экзотоксин. проводят путем введения смеси антиген/антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело. исследуемый материал, в котором предполагается наличие экзотоксина, смешивают с антитоксической сывороткой, выдерживают в термостате и вводят животным (морским свинкам, мышам).

Виды реакции:

иммобилизации - Антитела подавляют подвижность микроорганизмов. Для бледной трепоными и холерного вибриона.

Имунного лизиса - Активация системы комплемента, из-за взаимодействия антител с соответствующими клетками, вызывает лизис. Пр- гемолиз, вибриолиз.

Сложные реакции(состоят из простых).

4) Реакции сучастием комплемента - основаны на активации комплемента, из-за присоединения его к антителам, что связаны с антигеном.

Реакция связывания комплемента РСК - 2 фазы. 1-ая : Антиген реагирует с диагностической сывороткой (или диагностикумом,т.е. с микроорганизмами с специфическим антителом). и комплементом. Образующийся комплекс Антиген/ Антитело связывает комплемент. 2 фаза - индикаторная - определяется количество оставшегося, свободного комплемента. внесением его в реакционную среду гемолитической системы - эритроцитов барана и сыворотки, содержащей антитело к ним. если антиген не соответствует антителу, связывание комплемента не идёт и он реагирует с гемолитической сывороткой, вызвая гемолиз крови и феномен Лаковой крови( т.е реакция отрицательна.) Используют для диагностики сифилиса(р-ия Вассермана).

Реакция радиального гемолиза. - ставится в геле агара, содержащего эритроциты баранов и комплемент. После внесения в лунки геля гемолитической сыворотки вокруг них в результате радиальной диффузии антител образуется зона Гемолиза, чьи размеры зависят от титра. так опредедляется активность комплемента и гемолитической сыворотки и антитела в сыворотке урови больных краснухой, кл.энцефалитом, гриппом. Для этого на эритроцитах адсорбируют антигены вируса, а в лунке геля с данными эритроцитами добавляют сыворотку крови больного. противовирусные антитела реагируют с вирусными антигенами , после чего к этому комплексу присоединяется комплемент. вызывая гемолиз.

Реакция иммунофлюоресценции(РИФ) - применение антител, меченых флюорохромными красителями. При связи с антигеном образуется свечение иммунных комплексов в УФ спектре(бактерии святятся по периферии в виде каймы зелёного цвета). имеет 3 метода : прямой, непрямой, с комплементом.

5)Реакции с использованием меченых антител/антигенов

Иммуноферментный анализ(ИФА)-Выявление антигенов через антитела, связанные с ферментом(пероксидаза хрена, бета - галактаза, щёлочная фосфатаза) После образования комплекса с антителом добавляют субстрат, что расщепляется ферментом, окрашивая раствор в жёлто-карий(пероксидаза) или жёлто-зелёный (фосфатаза). Высоко чувствительный метод. Используют для обнаружения Клостридий, хламидий, стрептококков.

Радиоиммунологический анализ.(РИА) - количественное определение антител/антигенов, меченных радионуклидом, с использованием аналогичных антител/антигенов. После образования комплекса, определяют его радиоактивность по счётчику импульсов.

Иммуноблоттинг - определение антигенов / антител помсчью известных сывороток или антигенов. Механихзм - выделение антигена через электрофорез в полиакриламидном геле. потом антиген переносится на активированную бумагу или нитроцеллюлозу. Антиген проявляется с помощью ИФА(появление окрашенных пятен). Используется для диагностики.

40) Механизмы лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Пути ее преодоления.

Антибиотикорезистентность — это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.

Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно устойчивы к определенным семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувствительны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (например, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соединений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).

Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в разной степени, справедлива для всех бактерий и всех антибиотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микробы — от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множественная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).

Генетические основы приобретенной резистентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:

• мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) мутантов. Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, которые чувствительны к препарату. Мутации возникают независимо от применения антибиотика, т. е. сам препарат не влияет на частоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя резистентные штаммы. Мутации могут быть: 1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются измененные белки) и 2) множественные (серия мутаций, в результате чего изменяется не один, а целый набор белков, например пени-циллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентного пневмококка);

• переноса трансмиссивных плазмид резистентности (R-плазмид). Плазмиды резистентности (трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описана японскими исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться между бактериями разных видов, поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространена у грамотрицательных бактерий и встречается у кишечной палочки и других кишечных бактерий, а также у гонококка, резистентного к пенициллину, и гемофильной палочки, резистентной к ампициллину;

• переноса транспозонов, несущих r-гены (или мигрирующих генетических последовательностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с плазмиды на другую плазмиду. Таким образом гены резистентности могут передаваться далее дочерним клеткам или при рекомбинации другим бактериям-реципиентам.