ГФ №11, том 2. Общие методы анализа лекарственное растительное сырье редакционная коллегия
 Скачать 1.25 Mb.
|
|
высушенного при температуре от 100 до 105 град. С в течение 2 ч, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л, прибавляют 10 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в течение 1 мес при хранении в банке оранжевого стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до 10 град. С. 1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. 1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,001 мг тиамина хлорида. Раствор годен в день приготовления. 2. Окислительная смесь: 0,01 г калия феррицианида растворяют в 1 мл воды и доводят объем раствора 15% раствором едкого натра до 25 мл. Раствор готовят непосредственно перед употреблением. 3. Изобутиловый спирт (ч. д. а.) или изоамиловый спирт (ч. д. а.), или бутанол-1 (ч. д. а.) проверяют на отсутствие флюоресценции. В случае наличия флюоресценции спирт перед употреблением подвергают очистке следующим образом: к 1 л спирта прибавляют от 15 до 20 г активированного угля, энергично встряхивают в течение 30 мин, оставляют на сутки и отгоняют. 4. Приготовление подкисленного раствора калия хлорида: 125 г калия хлорида растворяют в 400 мл воды в мерной колбе вместимостью 500 мл, прибавляют 4,5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора водой до метки. 5. Коэффициент пересчета тиамина хлорида на тиамина бромид-1,29. 4. Определение содержания рибофлавина (витамина В2) Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок, указанных в соответствующих частных статьях, взбалтывают в горячей воде при подогревании на водяной бане, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, охлаждают, доводят объем раствора водой до метки и фильтруют; первые 10 мл отбрасывают. Из полученного раствора готовят раствор второго разведения с таким расчетом, чтобы содержание в нем рибофлавина было около 0,0004 мг в 1 мл. В кюветы флуориметра помещают: в одну - 10 мл испытуемого раствора, в другую - 10 мл раствора рабочего стандартного образца рибофлавина и измеряют флюоресценцию при длине волны около 440 нм. Параллельно в другие кюветы помещают: в одну - 10 мл испытуемого раствора и в другую - 10 мл раствора рабочего стандартного образца рибофлавина, в каждую прибавляют по 0,1 г натрия гидрокарбоната и натрия гидросульфита, перемешивают и измеряют флюоресценцию растворов. Установку проводят по раствору рабочего стандартного образца рибофлавина. Содержание C17H2ON4O6 (рибофлавина) в одном драже или одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле: (А - А1) х 0,0004 х 500 х V3 х б Х = -------------------------------- = (В - В1) х а х V2 х 1000 (А - A1) х V3 х б = -------------------------- (В - В1) х а х V2 х 5000 где А - показание флуориметра испытуемого раствора; А1 - то же после гашения флюоресценции; В - показание флуориметра раствора рабочего стандартного образца рибофлавина; В1 - то же после гашения флюоресценции; 500; V2 и V3 - разведения в миллилитрах; 0,0004 - содержание рибофлавина в 1 мл раствора рабочего стандартного образца в миллиграммах; а - навеска препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 - пересчет в граммы. Примечание. Приготовление раствора рабочего стандартного образца рибофлавина: 0,0400 г рибофлавина, предварительно высушенного при температуре от 100 до 105 град. С в течение 2 ч, растворяют в горячей воде в мерной колбе вместимостью 1 л при подогревании на водяной бане, после охлаждения доводят объем раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в течение 1 мес при хранении в банке оранжевого стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до 10 град. С. 1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки; 1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,0001 мг рибофлавина. Раствор годен в день приготовления. 5. Определение содержания пиридоксина гидрохлорида (витамина B6) Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок, указанных в соответствующих частных статьях, количественно переносят водой в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют; первые 10 мл отбрасывают. Из полученного раствора готовят раствор второго разведения с таким расчетом, чтобы содержание в нем пиридоксина гидрохлорида было около 0,01 мг в 1 мл; 5 мл полученного раствора переносят в делительную воронку вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л), 1 мл 0,1% раствора диэтил-п-фенилендиамина сульфата, перемешивают, прибавляют 10 мл этилацетата, 2 мл 1% раствора калия феррицианида и немедленно тщательно перемешивают. Дают слоям разделиться, нижний водный слой сливают в колбу и оставляют для повторного извлечения, верхний этилацетатный слой фильтруют через сухой бумажный фильтр, на который помещено около 8 г безводного натрия сульфата, в мерную колбу вместимостью 25 мл. Нижний водный слой повторно извлекают 10 мл этилацетата, фильтруют, фильтр промывают этилацетатом, присоединяют его к первому извлечению в мерной колбе и доводят объем раствора этилацетатом до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора синего цвета на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при длине волны 600 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют этилацетат. Параллельно проводят опыт с раствором рабочего стандартного образца пиридоксина гидрохлорида. Для этого 5 мл раствора рабочего стандартного образца пиридоксина гидрохлорида помещают в делительную воронку и далее поступают так, как описано выше. Содержание C8H11NO3 х HCl (пиридоксина гидрохлорида) в одном драже или одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле: D1 х 0,01 х 100 х V3 х б D1 х V3 х б Х = -------------------------- = --------------------, D0 х а х V2 х 1000 D0 х а х V2 х 1000 где D1 - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора рабочего стандартного образца пиридоксина гидрохлорида; 0,01 - содержание пиридоксина гидрохлорида в 1 мл раствора рабочего стандартного образца в миллиграммах; 100, V2 и V3 - разведения в миллилитрах; а - навеска препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже или одной таблетки в граммах; 1000 - пересчет в граммы. Примечания. 1. Приготовление раствора рабочего стандартного образца пиридоксина гидрохлорида: 0,0500 г пиридоксина гидрохлорида растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 250 мл и доводят объем раствора водой до метки (основной раствор). Раствор годен в течение месяца при хранении в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой при температуре от 5 до 10 град. С. 5 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки. 1 мл раствора рабочего стандартного образца содержит 0,01 мг пиридоксина гидрохлорида. Раствор годен в день приготовления. 2. Приготовление фосфатного буферного раствора (0,2 моль/л) рН 6,9 - 7,1: 1) 71,64 г натрия фосфата двузамещенного (Na2HPO х 12Н2О) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки; 2) 27,22 г калия фосфата однозамещенного (КН2РО4) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и доводят объем раствора водой до метки; 3) 150 мл раствора натрия фосфата двузамещенного смешивают со 100 мл раствора калия фосфата однозамещенного. рН полученного раствора 6,9-7,1 (потенциометрически). Раствор годен в течение 5 сут при хранении при температуре от 5 до 10 град. С. 3. Приготовление раствора сульфата диэтил - п - фенилендиамина: 0,1 г сульфата диэтил - п - фенилендиамина (ч. д. а. или ч.) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед употреблением. 6. Определение цианокобаламина (витамина В12) Содержание цианокобаламина определяют микробиологическим методом с Escherichia coli 113-3 в качестве тест - микроорганизма. Точную навеску порошка растертых драже, таблеток или количество таблеток, покрытых оболочкой, растертых в порошок, указанное в соответствующих частных статьях, количественно переносят водой в мерную колбу определенной вместимости и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают и фильтруют. Из полученного раствора делают разведение 1% раствором натрия цитрата с таким расчетом, чтобы концентрация раствора для анализа была близкой к контрольной концентрации раствора Государственного стандартного образца - 0,05 мкг в 1 мл. В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой и 3 чашки для раствора испытуемого препарата) одинакового диаметра с ровным и плоским дном, установленные на горизонтальном столе, отрегулированном по ватерпасу, разливают по 10-12 мл расплавленной и охлажденной до температуры 48-50 град. С основной среды, засеянной суспензией Е. coli 113-3 из расчета от 4 до 6 мл суспензии на 200 мл основной среды. После застывания среды на каждой чашке стерильным бором делают по трафарету под углом 60 град. С друг к другу 6 лунок диаметром 8 мм. В три лунки (через одну) 6 чашек, используемых для построения стандартной кривой, и 3 чашек - для раствора испытуемого препарата, вносят по 0,1 мл раствора Государственного стандартного образца контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В три лунки (через одну) каждых 3 чашек вносят по 0,1 мл одной из концентрации остальных растворов Государственного стандартного образца, а также раствора испытуемого препарата. Чашки выдерживают в термостате при 37 град. С от 16 до 18 ч. После этого измеряют диаметры зон стимуляции роста тест - микроорганизма для каждой концентраций растворов Государственного стандартного образца. После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают среднюю величину зоны, учитывая в каждом случае 3 чашки, т. е. 9 зон, затем рассчитывают среднюю величину зоны для контрольной концентрации, учитывая все чашки, т. е. 27 зон. По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации раствора (0,05 мкг/мл), выведенной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации раствора Государственного стандартного образца, выведенной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если она отрицательная. Аналогичным образом делают поправку к концентрации раствора испытуемого препарата. Содержание C63H88CoN14O14P (цианокобаламина) в одном драже или одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле: С х б х К Х = -------------, а х 1 000 000 где С - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора, найденное по стандартной кривой, в микрограммах; К - коэффициент разведения; а - навеска препарата в граммах или количество таблеток, покрытых оболочкой; б - средняя масса одного драже в граммах; 1 000 000 - пересчет в граммы. Примечания. 1. Приготовление раствора Государственного стандартного образца цианокобаламина: 0,0250 г Государственного стандартного образца цианокобаламина в пересчете на 100% вещество растворяют в 25% спирте в мерной колбе вместимостью 250 мл и доводят объем раствора тем же спиртом до метки. 1 мл полученного раствора содержит 100 мкг цианокобаламина (основной раствор). Раствор годен в течение 2 мес при хранении при температуре 4-6 град. С в банке оранжевого стекла с притертой пробкой. 1 мл основного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Раствор годен в течение 5 сут при хранении при температуре от 12 до 15 град. С. 1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг цианокобаламина. Из рабочего раствора Государственного стандартного образца в день определения готовят растворы, содержащие 0,025; 0,05 и 0,075 мкг цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5 и 7,5 мл рабочего раствора Государственного стандартного образца помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов в колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают. Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают за раствор Государственного стандартного образца контрольной концентрации. 2. Построение стандартной кривой: по исправленным значениям величин зон приготовленных концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации из всех чашек строят стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а на оси ординат - соответствующие им величины диаметров зон роста. По полученным точкам вычерчивают кривую. Применяемые для построения кривой концентрации не должны отличаться от контрольной концентрации более чем на -40 или +50%. 3. Хранение и подготовка тест - культуры для анализа: музейную культуру выращивают на скошенной агаровой среде и хранят в холодильнике. Один раз в месяц культуру пересеивают на свежую среду и после переноса выдерживают от 16 до 18 ч при 37 град. С. Состав среды для хранения культуры: казеинового кислотного гидролизата 10% 6 мл калия фосфата двузамещенного (х. ч.) 0,02 г железа сульфата (х. ч.) 0,0005 г магния сульфата (х. ч.) 0,02 г L-аспарагина (ч.) 0,02 г глицерина (ч.) 0,2 г агара микробиологического 1,5 г цианокобаламина 10 мкг воды до 100 мл рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически). Ингредиенты растворяют последовательно в воде. Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с прибавлением 2 капель раствора хлористоводородной кислоты (1 моль/л) при слабом подогревании и прибавляют к раствору солей; устанавливают рН полученной смеси до 7,0 15% раствором едкого натра, доводят объем среды водой до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара микробиологического. Смесь подогревают на водяной бане до полного растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина. За сутки до проведения анализа тест - культуру пересевают на скошенный пептонно - солевой агар следующего состава: пептона ферментативного сухого 2 г натрия хлорида (х. ч.) 0,5 г агара микробиологического 1,8 г воды до 100 мл рН среды до стерилизации 7,0 (потенциометрически). Обе среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при 1 ати (0,1 МПа) 20 мин. Пробирки охлаждают в наклонном положении. На скошенный агар делают посев музейной культуры. Тест - культуру инкубируют от 16 до 18 ч при 37 град. С и используют для приготовления посевного материала. 4. Приготовление 10% казеинового кислотного гидролизата: 100 г казеина размолотого смешивают в колбе вместимостью 1 л с 500 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты. Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5-8 ч до растворения казеина нагревание проводят на кипящей водяной бане, а затем на электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому остатку прибавляют 300 мл воды, перемешивают и снова отгоняют до получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды, растворяют оставшуюся массу приблизительно в 100 мл воды, устанавливают рН 3,5 при помощи раствора едкого натра (5 моль/л) и объем раствора доводят водой до 1 л. К раствору прибавляют 20 г угля активированного осветляющего, встряхивают в течение 1 ч, |