R614
R614
голубоватым оттенком - как отношение ----. Степень яркости
R459
(бета') характеризуют величиной максимального коэффициента
отражения образца лекарственного вещества в видимой области Rmax.
Оценка интенсивности цветового и сероватого оттенков
проводится в соответствии с табл. 1 и 2.
Таблица 1
Оценка интенсивности цветового оттенка
по величине степени белизны альфа'
┌───┬────────────────┬───────────────────────────────────────────┐
│ N │Пределы значений│ Оценка интенсивности цветового оттенка │
│п/п│ альфа' │ │
├───┼────────────────┼───────────────────────────────────────────┤
│ 1 │ 1,00 - 0,96 │ Отсутствует оттенок │
│ 2 │ 0,96 - 0,94 │ Едва заметный оттенок │
│ 3 │ 0,94 - 0,90 │ Слабый оттенок │
│ 4 │ 0,90 - 0,86 │ Отчетливый оттенок │
└───┴────────────────┴───────────────────────────────────────────┘
Примечание. При величине (альфа') < 0,86 лекарственное вещество не следует рассматривать как имеющее белый цвет.
Значения степени белизны ("альфа" и альфа') и степени яркости ("бета" и бета') являются объективными характеристиками качества белых и белых с оттенками лекарственных веществ. Пределы их допустимых значений могут быть регламентированы в частных статьях.
Методика определения. Подготовка пробы. В зависимости от поставленной задачи определение степени белизны и степени яркости может производиться на образцах порошкообразных лекарственных веществ без предварительной обработки или после их измельчения в течение 2 мин на лабораторной электрической мельнице ЭМ-3А (ГОСТ 5.692-70). Масса пробы, необходимая для проведения измерений, составляет 2-3 г.
Таблица 2
Оценка интенсивности сероватого оттенка
по величине степени яркости бета'
┌───┬────────────────────┬───────────────────────────────────────┐
│ N │ Пределы значений │ Оценка интенсивности │
│п/п│ бета' │ сероватого оттенка │
├───┼────────────────────┼───────────────────────────────────────┤
│ 1 │ 1,00 - 0,98 │ Отсутствие оттенка │
│ 2 │ 0,98 - 0,97 │ Едва заметный оттенок │
│ 3 │ 0,97 - 0,95 │ Слабый оттенок │
│ 4 │ 0,95 - 0,92 │ Отчетливый оттенок │
└───┴────────────────────┴───────────────────────────────────────┘
Примечание. При величине (бета') < 0,92 лекарственное вещество не следует рассматривать как имеющее белый цвет.
Порошок лекарственного вещества помещают в кювету и легкими ударами по дну последней уплотняют пробу. После этого стеклянным матированным плоским пестиком прижимают поверхность порошка, избегая горизонтальных перемещений пестика относительно поверхности пробы. Затем при необходимости кювету накрывают бесцветным плоским стеклом (лучше кварцевым).
Измерение на приборах типа лейкометра. Измерение коэффициентов отражения проб проводят в соответствии с инструкцией по пользованию прибором при белом свете (без светофильтра) и при красном, синем и зеленом светофильтрах или настройке монохроматора соответственно на длины волн 614, 459 и 522 нм. Перед каждым измерением прибор настраивают по эталону, имеющему коэффициенты отражения в видимой области
= 0,85. Каждое измерение повторяют не менее 2 раз.
Результаты измерений коэффициентов отражения представляют в
_
виде среднего арифметического rх и вычисляют значение "альфа".
Принимают "бета" = rб или "бета" = r522.
┌─────────────┬───────────────────────────────────┬───────┬──────┐
│ │ Показания лейкометра │ │ │
│Лекарственное├─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┤"альфа"│"бета"│
│ вещество │ │ _ │ │_ │ │_ │ │ │
│ │ rб │ rб │r459 │r459 │r614 │r614 │ │ │
├─────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼───────┼──────┤
│ │92,10│ │91,49│ │92,87│ │ │ │
│ Этазол │92,35│92,20│91,28│91,39│93,11│92,97│ 0,98 │ 0,92 │
│ │92,15│ │91,43│ │92,93│ │ │ │
└─────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴───────┴──────┘
Поскольку "альфа" < 1, a "бета" > 0,85, этазол имеет цветовой оттенок и не имеет сероватого оттенка.
Измерение на спектрофотометре с интегрирующей сферой. Измерение коэффициентов отражения проводят в соответствии с инструкцией по пользованию спектрофотометром, в следующем порядке. В правую и левую кюветы помещают эталон белизны бария сульфат квалификации "для отражательной спектрофотометрии" и настраивают прибор. Регистрируют спектр отражения исследуемого лекарственного вещества. Исходя из полученной спектрограммы определяют значения R459, R614 и Rmax.
Каждое измерение повторяют не менее 2 раз. Результаты
измерений коэффициентов отражения представляют в виде средних
_ _ _
арифметических R459, R614, Rmax. По получении указанных
коэффициентов отражения рассчитывают значение (альфа'); величину
_
бета' принимают равной Rmax.
Пример:
┌─────────────┬───────────────────────────────────┬──────┬───────┐
│ │ Показания спектрофотометра │ │ │
│ │ │ │ │
│Лекарственное├─────┬─────┬─────┬─────┬─────┬─────┤альфа'│ бета' │
│ вещество │ │_ │ │_ │ │_ │ │ │
│ │R459 │R459 │R614 │R614 │Rmax │Rmax │ │ │
├─────────────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼─────┼──────┼───────┤
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │
│ │0,802│ │0,853│ │0,980│ │ │ │
│Этазол │ │0,800│ │0,853│ │0,980│ 0,93 │ 0,98 │
│ │0,798│ │0,853│ │0,980│ │ │ │
└─────────────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴─────┴──────┴───────┘
Найденное значение (альфа') находится в пределах 0,94 - 0,90, следовательно, образец имеет слабый цветовой оттенок (см. табл. 1). Найденное значение (бета') составляет 0,98, следовательно, у образца отсутствует сероватый оттенок (см. табл. 2).
СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР -
спектроскопия) - физический метод, основанный на регистрации
индуцированных радиочастотным полем переходов между ядерными
магнитными энергетическими уровнями молекул вещества, помещенного
в постоянное магнитное поле. Переходы между ядерными магнитными
уровнями возможны для ядер, обладающих магнитным моментом, т.е.
имеющих спиновое квантовое число 1, не равное нулю. Такими
1 13 19 31
свойствами обладают ядра Н, С, F, P, у которых 1 = 1/2, и
др. Совокупность сигналов переходов между энергетическими уровнями
ядер молекул составляет спектр ЯМР. Каждый отдельный спектр ЯМР
регистрируется для одного типа ядер. Спектр ЯМР специфичен для
каждого вещества. Наибольшее распространение в исследовании
органических лекарственных веществ имеет спектроскопия протонного
13
магнитного резонанса (ПМР) и ЯМР С.
Основные характеристики спектра ЯМР
Основными характеристиками спектров ЯМР являются химический
сдвиг, мультиплетность, константа спин - спинового взаимодействия
и площадь сигнала резонанса. Эти характеристики зависят от
химического окружения данного ядра или группы ядер, от числа
соседних ядер, обладающих магнитным моментом, от их относительного
расположения, а также от числа анализируемых ядер в различных
структурных фрагментах молекулы.
Химический сдвиг ("дельта") определяет положение сигнала
резонанса в спектре ЯМР и зависит от химического окружения данного
ядра или группы ядер. Химический сдвиг выражается в миллионных
долях (м.д.) и измеряется относительно сигнала резонанса
эталонного соединения (эталона измерения химического сдвига),
добавляемого к анализируемым растворам (менее 1%). Для растворов в
органических растворителях в качестве эталона используют
1 13
тетраметилсилан (ТМС), химические сдвиги сигналов ЯМР Н и С
1 13
которого приняты за начало отсчета, "дельта " ( Н, С) = 0,00
ТМС
("дельта" - шкала химических сдвигов). Для водных растворов в
1
качестве эталона измерения химических сдвигов ЯМР Н используют
2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия (ДСС) с химическим
1
сдвигом метильных протонов "дельта " ( Н) = 0,015, а для
ДСС
13 13
измерения сдвигов ЯМР С - диоксан (ДО), "дельта " ( С) = 67,4.
ДО
Химические сдвиги могут быть измерены относительно сигналов
резонанса других эталонов и пересчитаны в "дельта" - шкалу по
формуле:
"дельта" = "дельта " + "дельта ",
х ст
где "дельта" - химический сдвиг сигнала анализируемого
вещества в "дельта" - шкале; "дельта " - химический сдвиг сигнала
х
анализируемого вещества относительно сигнала используемого эталона
X; "дельта " - химический сдвиг сигнала эталона в "дельта" -
ст
шкале.
Для большинства органических веществ сигналы ПМР регистрируются в диапазоне от "дельта" = 0,0 до "дельта" = 14,0. Значения химических сдвигов отсчитывают по оси абсцисс спектра справа налево.
Мультиплетность сигнала резонанса (М) определяется числом компонент сверхтонкой структуры сигнала, на которые он расщепляется под влиянием соседних ядер, обладающих спиновым квантовым числом 1, не равным нулю. Мультиплетность сигнала ПМР (для протона 1 = 1/2) в спектрах первого порядка определяется по формуле:
M = n + 1,
где n - число протонов в соседней группе.
Спектрами первого порядка являются спектры, в которых разность химических сдвигов мультиплетных сигналов резонанса взаимодействующих ядер, выраженная в герцах, значительно превышает константу спин - спинового взаимодействия ("ДЕЛЬТАдельта" "ни" / J > 10, где "ДЕЛЬТАдельта" - разность химических сдвигов, м.д.; "ни" - рабочая частота спектрометра, МГц; J - константа спин - спинового взаимодействия в герцах) и каждая из групп ядер магнитно эквивалентна.
В случае магнитной неэквивалентности ядер соседних групп
n
мультиплетность сигнала определяется по формуле М = 2 .
В спектрах высших порядков, для которых разность химических сдвигов сигналов взаимодействующих ядер незначительно превышает константу спин - спинового взаимодействия, определение мультиплетности в ряде случаев затруднено. Интенсивности компонент в мультиплетах спектров первого порядка пропорциональны биномиальным коэффициентам. Для дублетных сигналов отношение интенсивностей компонент составляет 1:1, для триплетных - 1:2:1, для квартетных 1:3:3:1 и т. д. В близко расположенных мультиплетах взаимодействующих ядер, когда разность химических сдвигов незначительно превышает константу спин - спинового взаимодействия, наблюдается отклонение от указанной пропорциональности. Это проявляется в увеличении интенсивности компонент, ближайших к соседнему мультиплету, за счет уменьшения интенсивности более удаленных компонент.
Константа спин - спинового взаимодействия (J) выражается в герцах и определяется расстоянием между компонентами мультиплетов спектров первого порядка. В спектрах высших порядков определение констант спин - спинового взаимодействия в ряде случаев затруднено и требует привлечения специальных расчетов с использованием ЭВМ. Значения констант спин - спинового взаимодействия зависят в основном от электроотрицательности заместителей и взаимного пространственного расположения групп взаимодействующих ядер, в частности от числа химических связей, отделяющих эти ядра, и от углов между химическими связями. Для большинства органических веществ константы протон - протонного спин - спинового взаимодействия имеют значения от 0 до 16 Гц.
Площадь сигнала резонанса (S) спектра ЯМР пропорциональна числу ядер, обусловливающих данный сигнал. Площади сигналов спектров ПМР используют для определения числа протонов в соответствующих группах молекул для измерения концентраций анализируемых соединений или примесей.
Приборы и методы эксперимента
Спектры ЯМР высокого разрешения регистрируют для легкоподвижных жидкостей или растворов твердых веществ в определенных растворителях. Выбор растворителя определяется растворимостью анализируемого вещества и наиболее полным разделением сигналов резонанса вещества и растворителя, если последний содержит ядра, по которым проводится регистрация спектра ЯМР. Для уменьшения интенсивности сигналов растворителей в спектрах ПМР используют дейтерированные, или апротонные, растворители. Химические сдвиги сигналов остаточных протонов используемых дейтерированных растворителей: хлороформ -- d1 ("дельта" = 7,26), бензол -- d6 ("дельта" = 7,16), вода -- d2 ("дельта" = 4,7 <*>), метанол -- d4 ("дельта" = 3,35; 4,8 <*>), диметилсульфоксид -- d6 ("дельта" = 2,50; 3,7 <**>), уксусная кислота -- d4 ("дельта" = 2,05; 8,5 <*>), ацетон -- d6 ("дельта" = 2,05).
--------------------------------
<*> Химический сдвиг зависит от рН и температуры раствора.
<**> Сигнал протонов примеси воды.
Для регистрации спектров ПМР используют спектрометры с рабочими частотами 60 МГц и более. Спектрометр ЯМР состоит из следующих основных функциональных узлов: магнита с системой стабилизации и коррекции магнитного поля, которые обеспечивают заданное значение напряженности и высокой однородности постоянного магнитного поля в объеме анализируемого образца, системы генерации радиочастотного электромагнитного облучения образца и системы регистрации спектра.
Перед проведением анализов необходим контроль чувствительности, разрешающей способности и стабильности работы прибора, соответствия этих параметров требованиям, оговоренным в технической документации. Раствор анализируемого вещества готовят, как указано в частной статье. Раствор переносят в спектральную ампулу и проводят регистрацию заданной области спектра на бланке. Усиление подбирают таким, чтобы высота наиболее интенсивного сигнала анализируемого вещества почти достигала верхнего края диаграммного бланка, т.е. составляла около 90% по высоте.
Области применения
1 13
Спектры ЯМР Н и С представляют обширную информацию о
молекулярной структуре анализируемого вещества. Положение сигналов
резонанса в спектре, их тонкая структура и площади позволяют
определять число атомов водорода и углерода в отдельных группах,
ближайшее химическое окружение, сочленение отдельных структурных
фрагментов молекулы, наличие примесей.
Многообразие структурной информации спектров ПМР практически исключает совпадение спектров разных соединений. В связи с этим метод спектроскопии ЯМР применяется для идентификации лекарственных веществ. Для этого используют наиболее полный набор спектральных параметров, характеризующих структуру вещества. Если вследствие сложности спектра ЯМР его полная интерпретация затруднена, ограничиваются лишь характерными сигналами спектра анализируемого вещества, по которым и судят о структуре данного соединения или о наличии возможной примеси. В отдельных случаях для подтверждения подлинности лекарственного вещества (примеси) к анализируемому раствору после первичной регистрации спектра добавляют определенное количество стандартного образца исследуемого вещества (примеси) и проводят повторную запись спектра в аналогичных условиях. Полное совпадение спектров указывает на идентичность анализируемого вещества и стандартного образца.
Спектры ЯМР могут быть использованы для количественного определения относительного или абсолютного содержания лекарственного вещества (примеси) в анализируемом лекарственном средстве. При определении относительного содержания вещества (примеси) измеряют площади сигналов резонанса анализируемого вещества (примеси) и вещества, по отношению к которому проводится количественное определение. Относительное мольное процентное (А) или относительное весовое процентное (Б) содержание отдельных веществ (примеси) в анализируемых лекарственных средствах вычисляют по формулам:
100Si/ni
А = ---------------,
i=k
SUM (Si/ni)
i=1
100SiMi/ni
Б = ---------------,
i=k
SUM (Si/ni)
i=1
где Si - площади сигналов резонанса веществ (примеси); i, ni - число ядер в структурных фрагментах молекул веществ (примеси), которые обусловливают сигналы резонанса с площадями Si; Mi - молекулярные массы вещества (примеси) i.
Для определения абсолютного содержания лекарственного вещества (примеси) анализируемые образцы готовят количественно. К навеске анализируемого вещества добавляют точно взвешенное количество вещества, играющего роль внутреннего стандарта количественных измерений. Дальнейшая процедура приготовления анализируемого раствора и регистрация спектра проводится, как было описано выше. По спектру измеряют площади сигналов анализируемого соединения (примеси) и стандарта. Абсолютное процентное весовое содержание вещества (примеси) в лекарственном средстве вычисляют по формуле:
В = 100 (Sа/Sст) (Ма nст mст/Мст nа mа),
где Sа/Sст - отношение площадей сигналов анализируемого вещества (примеси) и стандарта; М - молекулярные массы; n - число ядер в структурных фрагментах молекул веществ, обусловливающих сигналы резонанса с соответствующими площадями; m - навески анализируемого вещества и стандарта.
Эталон количественных измерений должен удовлетворять следующим требованиям: растворяться в используемом растворителе при концентрациях, соответствующих приблизительному равенству площадей сигналов Sа и Sст; не взаимодействовать с растворителем и анализируемым веществом; иметь постоянный состав, описываемый химической формулой. Сигнал резонанса стандарта количественных измерений должен регистрироваться в виде пика, не перекрывающегося другими сигналами. Значения химических сдвигов характерных сигналов веществ, используемых в качестве стандартов количественных измерений по спектрам ПМР: малеиновая кислота (2СН, "дельта" = 6,60), бензилбензоат (СН2, "дельта" = 5,30), малоновая кислота (СН2, "дельта" = 3,30), сукцинимид (2СН2, "дельта" = 2,77), ацетанилид (СН3, "дельта" = 2,12), трет - бутанол (3СН3, "дельта" = 1,30), гексаметилциклотрисилоксан (6СН3, "дельта" = 0,15). Относительная точность количественных измерений методом ЯМР в основном определяется точностью измерений отношения площадей резонансных сигналов и в общем случае составляет +/- (2 - 5%).
|
Скачать 1.83 Mb.