Дипом Светличной1. Оценка качества раствора кератина, полученного из различного кератинсодержащего сырья

• Название: Оценка качества раствора кератина, полученного из различного кератинсодержащего сырья
• Анкор: Дипом Светличной1.doc
• Дата: 17.09.2018
• Размер: 1.74 Mb.
• Имя файла: Дипом Светличной1.doc
• Тип: Документы; #24726
• страница: 2 из 3

1.3 Характеристика способов получения кератина

Известен ряд способов получения кератина. Однако часть из предлагаемых технологий требует применения дорогостоящих реактивов, другие приводят к полному гидролизу кератина, и соответственно, к потере ценных свойств, присущих нативному белку.

Наиболее близким к предлагаемому является способ (патент N 2007181, РФ кл. A 61 K 37/12, 1994) [8], заключающийся в обработке кератиносодержащего сырья раствором, содержащим смесь пероксида натрия, хлорида натрия и пероксида водорода, промывке, кислотной, затем повторной щелочной обработке, нейтрализации, доведении pH до 7,0-9,0, гомогенизации, фильтровании, осаждении зтанолом и выделении целевого продукта.

Цель достигается тем, что растворение исходного сырья осуществляют первоначально смесью муравьиной кислоты и перекиси водорода, а затем гидроксидом натрия в присутствии окислителя для осаждения кератина используют уксусную и/или соляную кислоту; перерастворение проводят в растворе гидрооксида натрия, а для достижения высокой степени очистки кератиновую массу диализуют против обычной или дистилированой воды.

Под действием окислительной смеси (муравьиная кислота и пероксид водорода) происходит окисление дисульфидных связей, сопроводающееся образованием производных цистеиновой кислоты, а следовательно, увеличением в белке содержания функциональных групп кислотного характера. В связи с тем, что кератин цементирующего вещества химически более активен, чем кератин фибрилл, окисление серусодержащих групп на этом этапе растворения происходит преимущественно в этом веществе. Это приводит к снижению катионной активности кератинов цементирующего вещества и к изменению ионного взаимодействия с кератинами фибрилл. Окисление дисульфидных связей является начальным процессом дестабилизации структуры белка и значительно облегчает его дальнейшую деструкцию посредством разрушения межфибриллярных пептидных связей, т.к. этот процесс значительно легче и интенсивнее протекает по месту пептидных связей, смежных с остатками цистеиновой кислоты. Получаемый полуфабрикат содержит в своем составе нативный кератин в виде макромолекул, их ассоциатов, а также в небольшом количестве продукты полного гидролиза белка и минеральные вещества [11].

Способ получения кератина, предусматривающий обработку, кератинсодержащего сырья в щелочной среде, промывку, обработку в кислотной среде, сбор полученного осадка, удаление примесей, перерастворение осадка в слабощелочной среде с последующими гомогенизацией и фильтрованием полученного продукта, отличающийся тем, что вначале исходное сырье обрабатывают раствором, содержащим 4 5% муравьиной кислоты и 0,4 0,8% пероксида водорода при жидкостном коэффициенте 15 20 и комнатной температуре в течение 7 9 ч, а после промывки раствором, содержащим 1 3% гидроксида натрия и 0,5 1,5% пероксида водорода при жидкостном коэффициенте 8 12 и 20 30oС в течение 24 48 ч с последующей обработкой в кислотной среде, содержащей уксусную и соляную кислоты или их смесь в соотношении соответственно 3 1, а после сбора осадка проводят его диализ против обычной или дистиллированной воды, причем перерастворение осадка проводят 0,01%-ным раствором гидроксида натрия до pН 6 8 с последующим добавлением консерванта [8].

В настоящее время, известно большое количество технологических приемов получения растворов кератина, которые постоянно совершенствуются. Разработаны и апробированы в промышленности несколько способов получения гидролизатов из кератинсодержащего сырья: гидротермический, щелочной, кислотный и ферментативный. При щелочном гидролизе в качестве химического реагента используют 0,25 - 10,0 % растворы едкого натра, 13 % раствор едкого калия или 25 % раствор аммиака. Гидролиз проводят с нагреванием до 95 о С, либо под давлением до 0,4 МПа. По окончании процесса гидролизат нейтрализуют соляной или ортофосфорной кислотами. В некоторых случаях проводят кристаллизацию солей, образовавшихся при нейтрализации, затем их отделяют и жидкость концентрируют в гидролизат без запаха. Полученные продукты в форме перевариваемых порошков и жидких гидролизатов применяют в пищевых продуктах и кормах. К недостаткам щелочного гидролиза относят разрушение аминокислот цистина, метионина и цистеина, частичную их рацемизацию. К другим недостаткам данного способа гидролиза кератинового сырья относятся длительность процесса, применение аппаратов для отгонки аммиака из гидролизата и для центрифугирования, использование кислот для нейтрализации щелочного гидролизата. Применение аммиака в качестве щелочного реагента исключает необходимость нейтрализации кислотой, что необходимо в случае применения других щелочных реагентов (едкого натра или едкого калия), позволяет получить продукт с низким содержанием золы(1,25 %). Вместе с тем, этот метод гидролиза сопряжен с необходимостью строгого соблюдения правилтехникибезопасностивследствиеприменениятакогоопасногоагента, как аммиак. Щелочной гидролиз находит применение в ряде технологий как самостоятельный процесс, часть смешанного или начальная стадия обработки материала. Кислотный гидролиз используют в технологических схемах изготовления кормовых гидролизатов из кератинового сырья, которые предусматривают очистку сырья и его гидролиз 2 - 6 % соляной кислотой, 10-40 % серной кислотой или 5 % ортофосфорной кислотой. Продолжительность гидролиза 6 - 10 часов. Гидролиз ведут при температурах 80 – 152 °С (0,4 - 0,8 МПа). Кератин шерсти или пуха иногда предварительно обрабатывают щелочной протеазой при рН 12. Гидролизаты очищают активированным углем и нейтрализуют кальцинированной содой, окисью кальция или щелочами; раствор отделяют от образовавшегося осадка соли и упаривают. Готовые белковые гидролизаты можно использовать в сухом и жидком виде. Кислотный гидролиз имеет некоторые преимущества перед щелочным: предотвращается распад аминокислоты аргинина на орнитин и аммиак, исключается дезаминирование таких аминокислот, как серин, треонин; интенсифицируется гидролиз сырья. Ещё одним положительным моментом является образование бактерицидных условий в ходе процесса, что предотвращает бактериальную контаминацию и позволяет хранить гидролизат без нейтрализации продолжительное время. Однако , при кислотном способе разрушаются аминокислоты триптофан и тирозин, а также некоторые из них превращаются вне усвояемую организмом животных форму. К числу химических способов переработки кератинсодержащего сырья относится гидролиз под давлением в горизонтальном вакуумном котле с использованием мочевины и дисульфатанатрия. Сырье и воду берут при гидромодуле 1:1-1:2,5 и вносят кристаллические мочевину или сульфатнатрия из расчета1-3 или5 % к массе сырья. Гидролиз проводят при давлении 0,2 М Па в течение 5 - 6 часов, затем обработанную массу сушат. В процессе гидролиза кератинсодержащего сырья образуются высокомолекулярные пептиды, которые хорошо связывают воду. Благодаря этому слив бульона исключается, что предотвращает потери сухих веществ. Гидролиз кератина можно проводить и 0,5 - 3 % раствором карбоната натрия при 10 – 70 °С. Анализ методов щелочного и кислотного гидролизов позволяет выделить некоторые их недостатки. При обработке сырья растворами щелочей не всегда сохраняется аминокислотный состав, происходит разрушение некоторых аминокислот. Кроме того, по этому способу не достигается полного разрушения прочных дисульфидных связей, в продуктах неполного гидролиза сохраняется трехмерная структура кератина, обуславливающая низкую переваримость и усвояемость продукта. Кислотный гидролиз белка давно используют для практических целей, однако из-за наличия в молекулах белка участков, трудно поддающихся действию минеральных кислот, содержащих гидрофобные аминокислоты, для целей гидролиза также используют сильные органические кислоты. Существенным недостатком кислотного гидролиза является частичное или полное разрушение, триптофана, лизина и ряда других аминокислот. Так, при 20-ти часовом гидролизе соляной кислотой разрушается 5% тирозина, треонина, 10% серина, весь триптофан, аспарагин, глутамин, что существенно ухудшает биологическую ценность получаемых гидролизатов. Перечисленные недостатки кислотного гидролиза сдерживают распространение этого метода переработки кератинсодержащего сырья. Гидротермический способ является более простым и наиболее часто встречающимся способом обработки кератинового сырья, так как представляет собой термическую обработку в водной среде под давлением. Сырье обрабатывают в течение 0,5 - 5,0 часов при давлении 0,1 - 1,0 МПа. После обработки кератиновый материал сушат, измельчают и просеивают. По сравнению с щелочными кислотным гидролизом гидротермический способ имеет преимущества: непродолжительность процесса, исключение использования химических веществ, аппаратов для очистки гидролизата от соли, не требуется сложное оборудование. Но жесткие условия гидролиза разрушают некоторые незаменимые и серосодержащие аминокислоты, способствуют образованию циклопептидов, в результате чего они становятся устойчивыми к воздействию пищеварительных протеолитических ферментов. Поэтому продукт имеет низкую усвояемость животными. В последнее время в связи с внедрением безотходных технологий и необходимостьюобеспечениябезвредностипроизводствпопулярныспособы деструкции кератинсодержащих отходов сырья животного происхождения с помощью протеолитических препаратов. При ферментативном гидролизе максимально сохраняется питательная ценность получаемых продуктов, значительно повышаются их растворимость и усвояемость. Гидролиз ведут ферментами при температуре и рН, обеспечивающих максимальную активность используемых протеаз. Гидролиз проходит чаще в нейтральной, слабощелочной или слабокислой среде. Для большинства используемых в промышленности ферментных препаратов оптимум колеблется в пределах нейтральных значений от 4,5 до 7,5. Температурный оптимум промышленных протеаз находится а пределах 35-55 С. В зависимости от удельной активности используемого ферментного препарата и времени проведения процесса глубина гидролиза белкового субстрата может быть различной. Для обогащения отходов к необработанному сырью добавляют препараты ферментов и ведут гидролиз до достижения максимальной степени обогащения аминокислотами. Затем температуру поднимают до уровня, необходимого для инактивации энзимов. Термоинактивацию ферментов часто совмещают с нейтрализацией, т.е. добавление реагентов проводят при одновременном прогревании. Водный раствор отделяют от не переработанного твердого остатка, концентрируют и высушивают(при необходимости). Ферментативный гидролиз кератинов приобретает важное значение в связи с возможностью создания на его основе различны белковых добавок и гидролизатов кормового назначения. Многими учеными на протяжении последних лет проводится работа, направленная на получение растворов кератина, с использованием методов ферментативной обработки. В большинстве случаев, технологическая схема которых включает в себя следующие этапы: подготовку сырья, предварительную обработку сырья, механическое измельчение сырья, ферментативный гидролиз, инактивацию ферментного препарата и нейтрализацию гидролизата . Анализируя используемые в настоящее время биотехнологические подходы к переработке кератинсодержащего сырья и организацию рассматриваемого производственного процесса, следует отметить, что длительный ферментативный гидролиз и низкий уровень переработки сырья, как правило, указывают на необходимость специальной обработки для ослабления водородных связей в молекуле белка, а также дисульфидных связей, придающих чрезвычайную прочность кератинсодержащему сырью. В связи с этим невозможно гидролизовать нативный кератин при помощи большинства известных ферментных препаратов даже в оптимальных для их действия условиях. Чаще всего предварительная обработка сырья основывается на применении высоких температур и различных химических веществ, способствующих нарушению водородных и разрыву дисульфидных связей между полипептидными цепочками в кератине. Наиболее предпочтительно применять вещества, не изменяющие реакцию среды и исключающие последующую нейтрализацию полученных ферментативных гидролизатов. Обработка протеолитическими препаратами приводит к полному растворению исходного сырья при небольших затратах времени на стадии ферментативного гидролиза. Применение ферментных препаратов способствует созданию малоотходных технологий, позволяет улучшить качество полуфабрикатов и готовой продукции, уменьшить расход сырья на единицу выпускаемой продукции, улучшить условия труда, уменьшить загрязненность и количество сточных вод. В связи с этим биотехнологические исследования, направленные на использование щадящих методов воздействия на кератинсодержащее сырье химических веществ, с применением ферментных препаратов для оптимизации технологий получения кормовых добавок, является актуальной задачей [15].

4. 
   Рациональное использование белковых препаратов
   

Возможность лечения кератиносодержащими препаратами с давних времен интересовала ученых. И только в России в 90-х годах кератинотерапия была внедрена в клиническую практику и показала свою высокую эффективность при лечении и профилактике многих заболеваний.

Кератин получается из экологически чистого и натурального материала – шерсти, волоса, пера и т.д. и родственен всем кератинсодержащим оболочкам, включая кожный покров, слизистые и синовиальные оболочки, ногти и волосы. Белковые препараты используют как в пищевой промышленности, так и в других отраслях: медицине, косметологии, легкой промышлености.

Перспективность использования модифицированных кератинов в качестве пищи для человека показана в работах Шорланд и Бейтли [23]. Они исследовали возможность замены 2/3 обычной муки мукой, полученной из ферментативных гидролизатов шерсти. Бисквиты, выпеченные из муки, которая на 37 % состояла из упомянутых выше видов белковой муки, не уступали по своим свойствам обычным бисквитам [4].

Кератиновый гидролизат - это порошок светло- кремового цвета со слабым грибным запахом, мясным вкусом, присущим глютаминату. К особенностям белкового гидролизата относят: полноценный аминокислотный состав; хорошая растворимость в воде; Экономическая эффективность ферментативного гидролиза обеспечивается низкой стоимостью исходного сырья, высоким содержанием азотистых веществ, возможностью использования его для эквивалентной замены дефицитных и дорогостоящих белков (обезжиренного молока, рыбной муки) в составе рациона для кормления раннего возраста телят и поросят.

Применяемый для выращивания бактериальных культур пептон, состоящий из смеси различных ди-, трипептидов, а также свободных аминокислот и получаемый ферментативным гидролизом мясных продуктов может быть заменен гидролизатом из кератинсодержащего сырья, при этом экономятся пищевые ресурсы, не требуется дополнительных затрат на оборудование. В результате аммиачного и ферментативного гидролиза всех видов кератинсодержащего сырья получен препарат - порошок желтого цвета, хорошо растворимый в воде, гигроскопичный, со специфическим запахом. Выход составляет 30-45 % от исходного сырья.

Были предприняты попытку изменить пищевые привычки человека, применив кератинсодержащее сырье, которые провели ряд экспериментов с кератиновыми гидролизатами. Есть данные об использовании белкового продукта, полученного в результате экстракции с ДМФ,с различными добавками для приготовления печенья, кофейного торта, блинов. Белковый продукт получаемый по предлагаемому способу, содержит все незаменимые аминокислоты. При необходимости его смешивают с 1,75 % триптофана или 15 % (весовых или объемных) белкового концентрированного гидролизата и с 85 % дистиллированной воды в смесителе и получают эмульсию. Белковый продукт можно применять в виде суспензий для многих напитков, соков. Эти суспензии стабильны, не дают осадков и могут быть использованы для приготовления апельсинового и виноградного соков и шоколадных напитков [4].

Кератины находят все большее применение и в непищевых отраслях народного хозяйства, медицине. Например, щелочные гидролизаты кератинового сырья используют в литейном производстве в качестве быстротвердеющего вещества.Этот материал обладает большой относительной прочностью, скоростью твердения и меньшей прилипаемостью. Основой для производства быстротвердеющего связующего крепителя из кератина послужили его свойства под действием щелочей давать высокомолекулярные растворы частичного гидролиза в виде вязких и клейких продуктов при их упаривании. Это же свойство кератина используется при изготовлении клея из рого-копытного сырья. Щелочные гидролизаты применяются при производстве пенообразователя для тушения огня. Регулятор травления металлургических и металлообрабатывающих заводов для химического травления металла кислотами, изготавливают также из кератиновых отходов. Заметим, что эти направления использования гидролизатов имеют тенденцию к свертыванию из-за внедрения синтетических аналогов.

Белковый продукт на основе кератина можно применять как составную часть различных косметических препаратов, в том числе шампуней, кремов для кожи, средств ухода за волосами. В настоящее время эти производства значительно расширены из-за высокого спроса на компоненты и добавки натурального происхождения [6].

В медицинской практике известно использование препаратов "амино-пептид", "аминосол" для парентерального белкового питания. Полученные из кератиновых гидролизатов, они содержат до 70 % свободных аминокислот и обладают высокой питательной эффективностью. Последние разработки в использовании продуктов ферментативного гидролиза кератинсодержащего сырья связаны с модификацией аминокислоты цистеина в таурин (2-аминоэтансульфоновую кислоту) и его применение в виде 4 % -го водного раствора (лекарственная форма "тауфон") в медицинских целях.

Особый интерес представляют пути применения дисперсий фибриллярных белков в легкой промышленности.

В текстильной промышленности белковые препараты применяют достаточно давно в составе композиций специальных видов отделки шерстяных тканей для получения так называемых временных эффектов (в составе шлихтующих средств). Чаще всего для шлихтования основ тканей используют природные и модифицированные крахмалы, водорастворимые синтетические полимеры. Но в последнее время разрабатывают шлихтующие композиции, которые позволили бы не только сократить потребление пищевого сырья, но и частично или полностью исключить использование дорогостоящих импортных материалов при сохранении технологических свойств шлихты. Все чаще в качестве заменителя крахмала для шлихтования используют белковые гидролизаты.

По аналогии с применением кератина в медицине и косметологии в качестве матрицы для лекарств с эффектом замедленного выделения возможно их использование в меховой промышленности как носителей химических веществ и защитных реагентов.

В технологии выделки меха также были реализованы попытки использования дисперсий кератина. Для улучшения физико-механических свойств волоса крашеного каракуля применялся кератин, полученный путем кипячения волоса в течение 12 ч в 25%-ном растворе серной кислоты при соотношении волоса и кислоты 1:10. Сернокислый экстракт кератина вводился в раствор при протравлении взамен серной кислоты.

Биологическое происхождение кератина, инертность в организме, большая сорбционная емкость, способность перевариваться ферментами и высокие механические свойства открыли широкие возможности применения продуктов их растворения, из которых получают волокна, пленки, губки в медицине и косметике.

К положительным свойствам кератина следует отнести также способность химически взаимодействовать с лекарственными веществами за счет большого числа функциональных групп. Создан ряд лекарственных форм, в которых кератин как биоадекватныей полимер, выполнякт роль матрицы. При этом не только улучшаются свойства иммобилизирующих веществ, но и оказывается благоприятное воздействие на организм. Благодаря уникальным свойствам кератиновые губки используются в качестве носителей лекарств замедленного выделения с эффектом резервуара, а в смеси с лекарственными препаратами — для лечения ожогов, ран, пролежней, язв.

На основе кератина выпускаются препараты для послеоперационного лечения рубцов и шрамов, особенно на лице (Byderm -США, Koken Atelocollagen — Япония).

Принимая во внимание основной принцип гомеопатии «подобное лечится подобным», косметологи широко используют в составе косметических и моющих средств кератин. По статистике более 42 % современных шампуней содержат кератин. Он ограничивает набухание волос в растворах ПАВ, особенно в щелочной среде, снижает их раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки глаз, обладает кондиционирующим эффектом для волос, выполняет защитную и пеностабилизирующую функции в составе пенных препаратов для ванн и душа.

Косметические средства, содержащие солюбилизированные эластин и кератин, полученные с помощью нового пероксидно-щелочного метода обработки белоксодержащих отходов, имеют высокую эффективность. Они хорошо проникают в кожу и волос, блокируя свободные радикалы молекул, разрушенных в процессе старения и под действием агрессивных факторов внешней среды, обеспечивая коже надежную защиту, улучшая механические свойства поврежденных волос.

Средство для укрепления волос на основе кератина и мукополисахаридов усиливает обмен веществ, улучшает кровообращение, насыщает корни волос питательными веществами, уменьшает сухость кожи головы и восстанавливает поврежденную структуру волос. Микроэлементы в виде растворимых в воде химических соединений (например, CuCl2, ZnCl2, СоС12 и т.д.) значительно повышают эффективность косметических средств, предотвращающих полное облысение и восстанавливающих волосы.

Бальзам с биоактивной добавкой глиастин, которая представляет собой комплекс растительных протеинов, равномерно распределяются по всей поверхности волоса, покрывают и сглаживают чешуйки кутикулы, как бы склеивают их. В результате волосы легко расчесываются, не спутываются, приобретают блеск и пышность.

Кератинсодержащие отходы мясной и птицеперерабатывающей промышленности после чисто водного гидролиза используются в качестве белковых кормовых добавок в рацион сельскохозяйственным животным. Гидролизаты кератина в смеси с содой, ацетатом алюминия, сульфатом железа, водой, применяют в качестве пенообразующих средств с усиленным пенообразованием для огнетушителей [2].

Кератинсодержащие отходы мехового и кожевенного производства используют в небольших количествах в виде продуктов кислотного, щелочного, водного или ферментативного гидролиза в производстве кормовых добавок, органоминеральных удобрений, пеногасителей, строительных материалов [3].

Весьма перспективным следует считать использование молекулярно-диспергированного кератина для защиты меховых шкур от неблагоприятного воздействия агрессивных сред в ходе отдельных жидкостных процессов производственного цикла.

Такой подход является вполне правомочным ввиду использования белкового продукта, практически не отличающегося по своей химической природе от кератина волоса. Его реализация будет способствовать значительному улучшению эстетических и эксплуатационных свойств, получаемого мехового полуфабриката за счет использования в ходе жидкостных обработок композиций, содержащих кератин, и, что не менее существенно, позволит включать в хозяйственный оборот белоксодержащие отходы мехового производства, давая перерабатывающим предприятиям дополнительный доход, открывает новые возможности на пути к созданию экологически чистых технологий.

На кафедре товароведения и технологии сырья животного происхождения была проведена работа по получению и оценке возможностей применения растворов кератина в меховом производстве.

2. Экспериментальная часть

2.1. Объекты исследования

Объектами исследования в дипломной работе служили:

• 
  кератинсодержащие отходы (волос кролика и северного оленя)
  
• 
  раствор кератина, полученный из кератинсодержащих отходов.
  

Исследуемый материал был взят на кафедре товароведения, технологии сырья и продуктов животного и растительного происхождения

имени С.А. Каспарьянца.

Схема получения представлена на рисунке




















Рисунок 1 – Схема эксперимента

2.2 Методы исследования

2.2.1 Определение содержания влаги

Процент влаги определяли в бюксах, предварительно доведенных до постоянной массы, при тех же условиях, что и высушивание вещества. Содержание влаги определяли путем измерения потери массы 100-105⁰С.

Для определения влаги брали навески массой 1,0 -1,5 мл раствора кератина. Взвешивали в бюксе с закрытой крышкой на аналитических весах, сушили в сушильном шкафу при температуре 100-105⁰С в течение 4 часов в бюксах с открытой крышкой. Затем бюкс закрывали и переносили в эксикатор для охлаждения до температуры воздуха помещения. После этого взвешивали, повторяли сушку в течение 2 часов, вновь охлаждали бюкс в эксикаторе, взвешивали и снова сушили. Сушку повторяли до достижения постоянной массы (пока разность между результатами двух последовательных взвешиваний не будет превышать 0,001 г.). Минимальную массу бюкса с навеской принимали за окончательный результат [8].

Содержание влаги вычисляли в процентах по формуле:

W = H-H₁/H x 100, где (1)

W – содержание влаги;

H – навеска до сушки;

H₁ – высушенная навеска.


2.2.2. Определение содержания жировых веществ растворов кератина

Навеску дисперсии кератина массой 2 г растирали в ступке с 4 г безводного сульфата натрия. Затем количественно переносили в колбу. Приливали 15 мл четыреххлористого углерода. Колбы устанавливали на площадку встряхивателя и экстрагировали в течение одного часа.

По истечении экстрагирования содержимое колбы фильтровали. Далее отбирали 5 мл фильтрата для дальнейшего высушивания. Количественно переносили в бюкс, предварительно доведенный до постоянной сухой массы. Бюкс с фильтратом ставили в сушильный шкаф и высушивали до постоянно сухой массы при температуре 105 ⁰С. После этого бюкс охлаждали и взвешивали [4].

Количество жира (Х) определяется по формуле:

Х = (m₁ – m) * v₁ * 100 (m₀ * v), (2)

где m₁ – масса с жиром;

m – масса бюкса;

v₁ – объем четыреххлористого углерода;

v – объем фильтрата.
2.2.3 Определение содержания минеральных веществ (золы)

Под золой подразумевают минеральную составную часть вещества, которая не удаляется в процессе сжигания органической части.

Определение содержания золы производили в тиглях, предварительно доведенных до постоянной массы, прокаливанием в муфельной печи.

В тигель помещали предварительно измельченную навеску(2,0-3,0г). Приготовленную навеску в тигле сжигали в муфельной печи.

Начальную стадию сжигания – обугливание - проводили в муфеле при температуре, не вызывающей покраснения (от раскаливания) внутреннего помещения печи. По прекращении выделения газообразных продуктов повышали температуру муфеля до температуры, соответствующей слабо-красному калению, но не выше 600^оС. При этих условиях осторожно вели прокаливание до полного сжигания частиц и черного налета на стенках (вторая стадия сжигания).

Конец прокаливания (сжигания) определяли по отсутствию в тигле следов несгоревшего угля. По окончании прокаливания цвет золы был светло-серым.

Конец сжигания устанавливали путем взвешивания тигля на аналитических весах с предшествующим охлаждением в эксикаторе.

После того, как исчезли черные крупинки, тигель взвешивали и затем ставили на полчаса для повторного прокаливания. После получасового прокаливания тигель с золой охлаждали в эксикаторе и взвешивали снова и так до получения постоянного веса.

Содержание золы вычисляли по формуле в процентах:

З= А/Н х100 (%); (3)
где З – процент золы;

А - масса золы; Н – масса навески вещества в г .
2.2.4. Определение рН потенциометрическим методом

При потенциометрическом определении рН измеряли электродвижущую силу, возникающую на элетородах при погружении их в исследуемый раствор и зависящую от концентарции в нем ионов водорода.

В работе использовали рН-метр фирмы “Piccolo” со стеклянным электродом. Он обеспечивает быстрое измерение с точность, соответствующей 0,01-0,03 единицы рН. Область оптимального использования рН-метра-в пределах рН от 1 до 9; при рН от 9 до 11 получается приближенные результаты, при рН выше 11- ошибочные, что зависит от концентрации ионов натрия. В растворах 50-70%-ного спирта в интервале рН 4-8 точность измерений такая же, как и в водных растворах, но других значениях рН и более высоких концентрациях спирта стеклянный электрод не применяют [9].

Анализ проводили в трех параллельных пробах.

Перед началом работы на рН-метре проводили корректировку показаний прибора по буферным растворам с известной величиной рН. Буферные растворы готовили из специальных стандарт-титров, для получения которых используют реактивы, имеющие квалификацию “для рН-метрии”. Температура анилизируемого раствора устанавливали с помощью автомотического термокомпенсатора. Промытый дистиллированной водой электрод сушили фильтровальной бумагой, а затем помещали в сосуд с испытуемым раствором и измеряли его рН. По окончанию работы электроды, тщательно промыли и оставили до последующего использования в дистиллированной воде.
2.2.5 Количественный учёт микроорганизмов микробиологическим ме­тодом

Для количественного определения микроорганизмов использовали чашечный метод. Образцы растворов кератина . Из усредненной пробы на технических весах взвеши­вали 1 мл,. материала, который вносили в стерильную пробирку и заливали 9 мл. сте­рильного физиологического раствора, тщательно взбалтывали и термостатировали 2 ч. при температуре 37° С. Таким образом получали первое разведение 1:10. Далее стерильными пипетками готовили серийные разведения: из 1-ой пробирки брали 1 мл. экстрагированного раствора и вносили во 2-ю пробирку с 9 мл. физ. раствора (1:100), из 2-ой - 1мл. в 3-ю (1:1000) и.д. до разведения со степенью предпола­гаемого обсеменения микробами.

Для определения общего количества бактерий использовали среду МПА. 1 мл. необходимого разведения вносили в пустую стерильную чашку Петри и зали­вали (10-15 мл.) стерильным расплавленным и охлаждённым до температуры 43-45° С агаром. Осторожно перемешивая чашки круговыми движениями, засеянный материал равномерно распределяли в среде. После застывания агара чашки дном вверх помещали в термостат при температуре 37 °С. После термостатирования в течение 24-72 ч. подсчитывали (пользуясь лупой) выросшие на чашке колонии. Для учёта обсеменения плесневыми грибами и дрожжевыми формами мик­роорганизмов использовали среду Сабуро. 1 мл. исследуемого экстракта или его разведения вносили в стерильную чашку Петри с уже астывшей средой. Тщатель­но распределяли засеянный материал по поверхности агара. Термостатировали дном вверх при температуре 26-28° С в течение 3-7 суток.

При наличии на чашке небольшого числа колоний (не более 100) их подсчи­тывали со стороны дна, отмечая учтённые колонии чернилами. При более высоком количестве колоний (200-300) для удобства подсчёта дно чашки делили восковым карандашом на секторы и подсчитывали число колоний в каждом секторе. Резуль­таты, полученные при подсчёте колоний в отдельных секторах, суммировали, на­ходили среднее арифметическое и, умножая полученное число на разведение, оп­ределяли количество микробов в 1 мл. или в 1 г. Для учёта обсеменения плесневыми грибами и дрожжевыми формами мик­роорганизмов использовали среду Сабуро. 1 мл. исследуемого экстракта или его разведения вносили в стерильную чашку Петри с уже остывшей средой. Тщатель­но распределяли засеянный материал по поверхности агара. Термостатировали дном вверх при температуре 26-28° С в течение 3-7 суток.

При наличии на чашке небольшого числа колоний (не более 100) их подсчи­тывали со стороны дна, отмечая учтённые колонии чернилами. При более высоком количестве колоний (200-300) для удобства подсчёта дно чашки делили восковым карандашом на секторы и подсчитывали число колоний в каждом секторе. Резуль­таты, полученные при подсчёте колоний в отдельных секторах, суммировали, на­ходили среднее арифметическое и, умножая полученное число на разведение, оп­ределяли количество микробов в 1 мл. или в 1 г.