Определение группы крови, резуспринадлежности, типирование антител
 Скачать 1.68 Mb.
|
|
Химическая структура антигенов системы резус Резус-полипептиды представляют собой семейство негликозилированных 30-32 кДа трансмембранных протеинов. Характерной особенностью является отсутствие терминальных углеводов. Современные представления о мембранной топологии резус-полипептидов приведена на рисунке(цитировано по P. Agre, J.Р. Cartron,1991).  Модель топологии Rhполипептидов в мембране эритроцита Как показано на рисунке, высоко гидрофобные протеины этой системы вставлены в фосфолипидный бислой мембраны эритроцита и имеют 5-6 внеклеточно расположенных гидрофильных петель. Антигенные свойства пептидов могут быть связаны с этими петлями. Предполагается также, что антигенные свойства зависят кроме того от мембранных фосфолипидов, определенным образом ориентирующих полипептидные петли. Антигенная активность полипептидов, как было показано еще ранними исследованиями, утрачивалась при действии растворителей жиров и восстанавливалась при добавлении экзогенного фосфатидилхолина. К частичной утрате антигенных свойств приводит также действие фосфолипазы А2, изменение соотношения мембранного холестерола и фосфолипидов. Эти находки предполагают сильные связи между Rh антигенами и липидами, хотя биохимический механизм связи остается не ясным. Функциональная роль антигенов системы резус остается не известной. Предполагается их участие в поддержании мембранной целостности. Иммуногенность антигенов системы резус представлена следующим образом: D>c>E>C>e. Разновидность антигена D системы резус Характерной чертой антигенов системы Резус является полиморфизм, что обуславливает наличие большого количества разновидностей антигенов. Согласно современному представлению наибольшей иммуногенностью обладает антиген D (имеет белковую природу, локализован на мембране эритроцитов), у которого выделяют следующие варианты в зависимости от выраженность антигенных и иммуногенных свойств: - нормально выраженный антиген D. - D слабый (weak) - снижено количество антигенных детерминант - D вариантный (partial)- количество антигенных детерминант не снижено, но они отличаются качественно.  Частота встречаемости слабых вариантов антигена D составляет около 1%. Для удобства в повседневной работе иммуносерологических лабораторий слабые варианты антигена D объединяют в группу Du. Ранее не существовало возможности дифференцировать D слабый и D вариантные антигены друг от друга, поэтому они обозначались общим термином DU . Но в настоящее время, благодаря использованию моноклональных антител, это стало возможно. Поэтому за рубежом термин Du больше не используется. Для выявления слабой разновидности антигена D- Du - используют Цоликлон анти-D, созданный на основе полных антител класса IgM и Цоликлон анти-D, содержащий неполные антитела класса IgG. Результат Du выдается, если Цоликлон анти-D дает положительный или сомнительный результат, с Цоликлоном анти-D Супер - реакция отрицательная. Доноры с антигеном Du квалифицируются как резус-положительные. Реципиенты, содержащие антиген Du, относятся к резус-отрицательным Им может быть перелита только резус-отрицательная кровь, так как нормальный антиген D может вызвать образование иммунных антител анти-D. Рекомендации при переливании компонентов крови: Выявлена слабая разновидность антигена D- Du- переливать только rh-(отрицательную) кровь. Резус – отрицательными донорами считаются лица, кровь которых не содержит антигенов D, С, Е. Антитела системы резус Антитела в системе резус, как уже отмечалось, обычно иммунного происхождения, относятся к классу иммуноглобулинов G, подклассам G1 и G3.Гораздо реже могут наблюдаться антитела из классов иммуноглобулинов М и А. Во многих случаях эти антитела хорошо выявляются при 37°С при инкубации в коллоидной среде, почти все антитела этой системы определяются в антиглобулиновой технике. Реактивность антител может быть усилена путем использования для их выявления эритроцитов, обработанных ферментами. Иммунные антитела в системе резус появляются после перелива- ния резус-несовместимой крови в результате сенсибилизации реципиента, чаще появляются в результате иммунокомфликтной беременности. Человек, однажды сенсибилизированный к резус - антигенам, может иметь определимые в циркуляции анти- D антитела пожизненно, а при повторной экспозиции с этими антигенами способен давать быстрый и сильный анамнестический ответ. Антитела в системе резус отличаются по своим характеристикам от антител в системе АВО по происхождению. Эти антитела являются иммунными, а не естественными, т.е. они образуются не от рождения, а при иммунизации в результате переливания резус- отрицательным реципиентам несовместимой (резус-положительной) крови или при иммуноконфликтной беременности (беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом). Резус антитела чаще бывают неполными и представлены иммуноглобулинами вторичного иммунного ответа (IgG), которые не вызывают агглютинации стандартных эритроцитов в солевой среде, хотя и прикрепляются к ним. Реакция внешне ничем не проявляется, для ее выявления необходимо проведение реакции агглютинации со стандартными эритроцитами в присутствии различных усилителей коллоидного характера, либо проведение непрямой реакции Кумбса. Неполные антитела являются по своим характеристикам тепловыми, т.е. для их обнаружения требуется температура, близкая к температуре тела (37°-48°С), в то время как полные антитела реагируют лучше при комнатной температуре, либо на холоду. Среди резус - антител могут быть и полные антитела, относящиеся к иммуноглобулинам первичного иммунного ответа (IgM) и вызывающие агглютинацию стандартных эритроцитов в обычной солевой среде. Это делает необходимым при тестировании сывороток постановку обеих реакций : для выявления полных и неполных резус антител. Человеческий иммуноглобулин G (анти - D) используется для приготовления резус - иммуноглобулина, который используется для профилактики сенсибилизации к D антигену у Rh - отрицательных женщин после рождения у них Rh - позитивного плода. Этот иммуноглобулин может быть также введен, если Rh негативному пациенту ошибочно перелили Rh+ эритроциты или большое количество тромбоцитов, контаминированных Rh+ эритроцитами от Rh+ доноров. Один флакон, содержащий 300 мг анти - D иммуноглобулина G, рекомендуется вводить на каждые 15мл D+ эритроцитов (не цельной крови), введенных в организм. Иммуноглобулин назначают в течение 72 часов после попадания D+ крови, что позволяет предупредить активную иммунизацию пациента и быстро удалить иногруппные эритроциты из организма. МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-НРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ Для определения резус-принадлежности крови необходимо иметь стандартные высокоактивные реактивы. В настоящее время применяют реактивы двух видов: приготовленные из сыворотки крови лиц, иммунизированных к антигенам системы Резус, и реактивы на основе моноклональных антител. Для практического применения выпускают моноклональные антитела (получают с помощью биотехнологии гибридом) следующей специфичности: анти- D и анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е. Цоликлон анти-D-Супер содержит полные (IgM) анти-D АТ. Стандартные диагностические сыворотки для определения резус-принадлежности получают из крови резус-отрицательных лиц, сенсибилизированных резус-АГ в результате гемотрансфузии или при беременности. Определение резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева с моноклональными антителами IgMанти-D Оснащение: - моноклональные антитела IgM анти-D; - белая смачиваемая поверхность; - раствор натрия хлорида 0,9%; - стеклянная палочка. Порядок проведения исследования: 1. На белой пластине со смачиваемой поверхностью написать Ф.И.О. исследуемого лица. 2. На левом краю пластины надписать серию реактива анти-D, используемого для исследования. Рядом сделать надпись: контроль. 3. Соответственно надписям поместить под ними по одной капле реактива IgM анти-D и одну каплю контрольного реактива (если контрольный реактив входит в комплект и поставляется производителем). 4. Во все капли добавить по маленькой капле исследуемых эритроцитов и перемешать стеклянной палочкой до образования капли диаметром 1,5 см. Палочку каждый раз вымыть и тщательно вытереть досуха. Перемешивание начинают с контроля. 5. Пластину покачивать в течение 5 минут, затем в каждую каплю добавить 5-6 капель раствора натрия хлорида 0,9% для снятия возможной неспецифической агглютинации. После чего пластину покачивать еще 5 минут. Трактовка результатов: Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации невооруженным глазом. Наличие агглютинации в капле с реактивом анти-D свидетельствует о положительной реакции и указывает на резус-положительную принадлежность. Отсутствие агглютинации с реактивом анти-D свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности. Результат считается истинным при отсутствии агглютинации в капле с контрольным реактивом. IgM анти-D (цоликон анти-D-супер)не взаимодействуют с некоторыми образцами D слабого и D вариантного антигенов, поэтому при исследовании резус-принадлежности крови доноров все отрицательные результаты необходимо исследовать с реактивами анти-D, содержащими IgG. Проба Кумбса для определения неполных анти-резус антител При постановке непрямой пробы Кумбса материалом для исследования служит сыворотка пациента, в которой следует определить присутствие неполных антител. Непрямая проба Кумбса состоит из двух этапов, первый из которых заключатся в создании условий для фиксации неполных антител предположительно присутствующих в испытуемой сыворотке, на поверхности стандартных эритроцитов с известной антигенной специфичностью. Второй этап реакции - выявление фиксированных антител на поверхности стандартных эритроцитов с помощью антиглобулиновой сыворотки. - При проведении реакции в штатив устанавливают пробирки по числу образцов эритроцитов, с которыми проводится испытание сыворотки и во все пробирки вносят по 0,15 мл (3 капли) испытуемой сыворотки. - Затем вносят по 0,01 мл (очень маленькая капля из тонкой пастеровской пипетки) из отмытых стандартных эритроцитов со дна пробирки в соответствии с обозначениями и нумерацией пробирок. - Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют при 370С 30 минут, что необходимо для фиксации неполных антител на поверхности стандартных эритроцитов. - После извлечения пробирок из термостата в них добавляют до верха изотонический раствор NaCl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют и проводят такое отмывание трижды. - Затем к отмытым эритроцитам в каждую пробирку добавляют 4-7 капель физиологического раствора для получения 5% взвеси - Каплю взвеси (0,05 мл) эритроцитов из каждой пробирки переносят на плоскость белого цвета со смачиваемой поверхностью и добавляют к ним по капле (0,05 мл) антиглобулиновой сыворотки (АГС). - Эритроциты и АГС перемешивают стеклянной палочкой учитывают реакцию, наблюдая за нею при покачивании пластины Агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд однако наблюдение продолжают до 20 минут, т.к. при низких титрах анти - резус антител реакция может наступать замедленно. Интерпретация результатов При наличии агглютинации исследуемой сыворотки с образцами стандартных резус-положительных эритроцитов и отсутствии реакции с резус-отрицательными образцами и собственными эритроцитами можно делать вывод о наличии в сыворотке обследуемого неполных резус - антител. Отсутствие агглютинации со всеми образцами стандартных и аутоэритроцитов свидетельствует об отсутствии анти - резус неполных антител. Ложноотрицательные результаты при определении резус-принадлежности крови • наличие D вариантного и D слабого антигенов. • ослабление антигенов при заболеваниях. • недостаточное качество реактивов (низкая активность антител; узкий спектр антител, выявляющих не все варианты антигенов). • нарушение методики исследования резус-принадлежности (неправильное соотношение реактивов, несоблюдение температуры и времени). ДЕЙСТВИЯ ВРАЧА ПЕРЕД ГЕМОТРАНСФУЗИЕЙ, ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ НЕСОВМЕСТИМОСТИ ПРИ ПЕРЕЛИВАНИИ КРОВИ Алгоритм проведения мероприятий строго регламентирован: - Перед назначением переливания крови врач, проводящий трансфузию, должен внимательно собрать анамнез больного для выявления возможных в прошлом посттрансфузионных осложнений у больного, а у женщин наличия в прошлом иммуноконфликтной беременности. - У больного обязательно проводят общий анализ крови и мочи (не ранее, чем за 3 дня до процедуры переливания крови). - Врач записывает в историю болезни предтрансфузионный эпикриз, включающий показания для переливания компонентов крови, ее группу АВО и Rh, дозу и способ переливания. - На основе знания группы крови больного, записанной в предтрансфузионном эпикризе врач должен правильно выбрать кровь для трансфузии: одногруппную по системе АВО и резус - принадлежности. Переливание крови «универсального донора» -0(I) группы, реципиентам с другой группой крови допускается лишь в исключительных случаях. Только в порядке исключения допускается «универсальному реципиенту», т.е. носителю АВ (IV) группы крови, переливать кровь другой группы. Количество переливаемой цельной крови в этих исключительных случаях должно быть небольшим. Особенно осторожно следует проводить такое переливание больным после острой кровопотери, недопустимо такое переливание детям. В случае необходимости можно переливать тщательно отмытые от плазмы эритроциты 0(I) группы, в этом случае при переливании эритроцитарной массы отсутствуют антитела аир, способные повредить эритроциты реципиента. Врач должен также правильно выбрать кровь в отношении резус – фактора. При этом следует помнить, что резус-отрицательным реципиентам (Rh-) может быть перелита только резус-отрицательная кровь для предупреждения посттрансфузионного осложнения. - В день переливания крови, непосредственно перед гемотрансфузией у больного берут 5 мл крови в пробирку для проведения контрольных исследований, предупреждающих возможную несовместимость крови донора и реципиента. На пробирке врач подписывает ФИО больного, группу крови. - Параллельно врач проводит контрольные исследования донорской крови, в этом случае кровь из флакона, или флаконов, если используются несколько флаконов (даже от одного и того же донора), забирают в пробирки, подписывая на них ФИО донора группу крови и номер флакона. - Флакон с остатками трансфузионной жидкости и пробирку с сывороткой крови больного, взятой до переливания крови для контрольных исследований, следует сохранять в холодильнике в течение 48 часов, т е срок в течение которого реализуются возможные посттрансфузионные иммунологические или бактериологические осложнения, для последующего анализа которых необходимы эти пробы. Несовместимость крови донора для реципиента определяется присутствием в сыворотке последнего антител к переливаемым эритроцитам в результате действия которых эти эритроциты могут быть разрушены Для предупреждения возможной несовместимости перед проведением процедуры гемотрансфузии необходимо обязательное проведение целого ряда проб на совместимость крови донора и сыворотки реципиента, которые делает врач, осуществляющий гемотрансфузию. Для того, чтобы не допустить переливания несовместимой крови, необходимо выполнять следующий алгоритм действий: 1. Врач должен тщательно проверить всю документацию, имеющую отношение к переливанию крови у пациента, т.е. - сравнить запись в истории болезни по определению группы крови АВО у пациента с данными на этикетке флакона с кровью донора, убедиться, что кровь донора и реципиента совместимы по системе АВО. - проверить запись в истории болезни о резус - принадлежности реципиента, если кровь больного резус-отрицательная, то убедиться, что на флаконе с кровью указано, что кровь донора резус-отрицательная. 2. Провести контрольные исследования, включающие все пробы на совместимость. Контрольные исследования обязательны вне зависимости от ранее проведенных и зафиксированных в истории болезни результатов и включают следующие этапы: а) Определение групповой принадлежности крови больного по системе АВО и сопоставление полученных данных с записями о групповой принадлежности крови больного в истории болезни, а также с обозначением группы крови донора, указанным на флаконе. б) Определение группы крови донора, взятой из флакона, по системе АВО проводится аналогично, результат сопоставляется с обозначением группы крови, указанном на флаконе. в) Проведение пробы на индивидуальную АВО совместимость эритроцитов донора и сыворотки реципиента. г) Проведение пробы на индивидуальную резус – совместимость эритроцитов донора и сыворотки реципиента. д) После проведения вышеуказанных этапов и при полной совместимости крови донора и реципиента перед самым переливанием крови проводят также биологическую пробу. ПРОБЫ НА СОВМЕСТИМОСТЬ ПЕРЕЛИВАЕМОЙ КРОВИ Для проведения проб на совместимость переливаемой крови по системе АВО и резус используют сыворотку (не плазму) крови реципиента и консервированную кровь донора (причем ее исследуют из каждого флакона, из которого будет переливаться кровь донора, даже если она получена от одного и того же донора). Сыворотка реципиента должна быть получена и исследована в тот же день, либо накануне, но при условии хранении крови при температуре 4-60 С. Для получения сыворотки у больного кровь берут в количестве 4-5 мл без консерванта, на пробирке пишут фамилию, инициалы больного, группу крови и дату. Врач, осуществляющий гемотрансфузию должен лично убедиться в том, что надписи на пробирке сделаны правильно и относятся к тому больному, у которого взята кровь. Сыворотку для исследования забирают после ретракции сгустка и отстаивания жидкой части крови, для ускорения процесса можно провести центрифугирование при 1500 оборотах в минуту - 5 минут. Кровь донора получают из флакона, для чего из него спускают кровь через иглу в количестве 5-10 капель на борт пластины, где будет проведена проба. |