Определение группы крови, резуспринадлежности, типирование антител
 Скачать 1.68 Mb.
|
|
Способы определения группы крови Групповую принадлежность крови по системе АВ0 определяют с помощью реакции агглютинации. В настоящее время используют три способа определения групп крови по системе АВ0:
Использование стандартных эритроцитов Для определения группы крови необходимо использовать стандартные эритроциты группы крови А, В и 0. При этом эритроциты заготавливают от лиц, специально отобранных для этих целей: с высокой скоростью наступления агглютинации и авидностью (характером агглютинации). Требования к стандартным эритроцитам изложены в инструкции по консервированию стандартных эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях. Недопустимо в качестве стандартов использовать кровь произвольно взятых доноров или больных с установленной группой крови. Определение групп крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток Заключение о групповой принадлежности делают на основании наличия или отсутствия антигенов А и В на эритроцитах. Для исследования используют стандартные изогемагглютипирующие сыворотки групп 0, А, В, АВ. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки должны соответствовать следующим требованиям: - сыворотка должна быть специфичной, то есть содержать определенные групповые АТ анти-А, анти-В или оба вместе, и не вызывать неспецифической агглюитинации эритроцитов одноименной группы и группы 0(I). - должна быть активной, что выражается в наступлении первых признаков агглютинации со стандартными эритроцитами групп А1 и В в течение первых 30 секунд, со стандартными эритроцитами А2 в течение первой минуты и титром агглютининов по отношению к эритроцитам групп А1 и В не ниже, чем 1:32 и группы А2 – не ниже, чем 1:16. - не должна оказывать на эритроциты гемолизирующего действия. - должна быть прозрачной (допускается небольшая опалесценция, что не влияет на качество сыворотки). - должна быть окрашена: группа А(II) – светло-зеленый или светло-синий цвет, В(III) – розовый или красный цвет, АВ (IV) – желтый цвет. - должна быть предохранена от инфицирования прибавлением консервирующих средств. Оснащение: - стандартные изогемагглютинирующие сыворотки группы крови 0 (анти-А, анти-В); группы крови А (анти-В); группы крови В (анти-А); группы крови АВ (без антител); - раствор натрия хлорида 0,9%; - пластинки со смачиваемой поверхностью; - пипетки; - стеклянные или пластмассовые палочки. Порядок проведения исследования: 1. Промаркировать пластинку, для чего указать Ф.И.О. лица, у которого определяют группу крови, а также надписать специфичность изогемагглютинирующих сывороток в порядке их нанесения: 0 (анти-А+В), А (анти-В), В (анти-А). 2. Нанести по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки соответствующей группы. Для исследования используют по две серии сывороток каждой группы. 3. Рядом со стандартными сыворотками поместить маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови. 4. Капли перемешать, наблюдать за ходом реакции, покачивая пластину. Агглютинация обычно наступает на первой минуте наблюдения, однако, результат реакции оценивают через пять минут. Перед чтением результатов в капли, где наступила агглютинация, добавить но 0,05 мл раствора натрия хлорида. Трактовка результатов реакции Реакция агглютинации в каждой капле может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции в смеси появляются видимые мелкие агтлютинаты, состоящие из эритроцитов, соединенных антителами. Мелкие агглютинаты постепенно сливаются в более крупные. При отрицательной реакции смесь остается равномерно окрашенной в красный цвет без присутствия агглютинатов.  Исследование со стандартными сыворотками может дать четыре различных варианта:
Для исключения неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов проводят дополнительное контрольное исследование с сывороткой АВ группы крови. Для чего необходимо нанести на пластинку большую каплю (0,1 мл) стандартной сыворотки АВ и добавить маленькую каплю исследуемой крови, перемешать и наблюдать за ходом реакции в течение 5 минут. Отсутствие агглютинации свидетельствует об отсутствии неспецифичности исследуемых эритроцитов, что позволяет отнести исследуемую кровь к группе крови АВ. Определение группы крови перекрестным способом (со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами) Заключение о групповой принадлежности делают на основании наличия или отсутствия антигенов А и В на эритроцитах, а также присутствия анти-А и анти-В антител в исследуемой крови. Для исследования используют стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп 0, А, В, АВ, а также стандартные эртроциты групп крови 0, А и В. Оснащение: - стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп крови 0 (анти-А, анти-В); А (анти-В); В (анти-А); АВ; - раствор натрия хлорида 0,9%; - пластинки со смачиваемой поверхностью; - пипетки; - стеклянные или пластмассовые палочки; - стандартные эритроциты А, В, 0. Порядок проведения исследования: 1. Промаркировать пластинку, для чего указать Ф.И.О. лица, у которого определяют группу крови, а также надписать специфичность изогемагглютинирующих сывороток в порядке их нанесения: 0 (анти-А+В), А (анти-В), В (анти-А). 2. Нанести по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки соответствующей группы. Для исследования используют но две серии сывороток каждой группы. 3. На нижнюю часть пластинки под соответствующим обозначением нанести по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов 0, А, В. 4. Из пробирки с исследуемой кровью осторожно взять пипеткой сыворотку и поместить по одной большой капле на подготовленные стандартные эритроциты. 5. Этой же пинеткой из пробирки взять исследуемые эритроциты и поместить рядом с каждой каплей стандартных сывороток маленькие капли (0,01 мл) исследуемой крови. Капли перемешать, наблюдать за ходом реакции, покачивая пластину. Агглютинация обычно наступает на первой минуте наблюдения, однако, результат реакции оценивают через пять минут. Перед чтением результатов в капли, где наступила агглютинация, добавить по 0,05 мл раствора натрия хлорида. Трактовка результатов Реакция агглютинации в каждой капле может быть положительной или отрицательной. При положительной реакции в смеси появляются видимые мелкие агглютинаты, состоящие из эритроцитов, соединенных антителами. Мелкие агглютинаты постепенно сливаются в более крупные. При отрицательной реакции смесь остается равномерно окрашенной в красный цвет без присутствия агглютинатов. Сопоставляют результаты реакций, полученных со стандартными сыворотками, с результатами реакций, полученных со стандартными эритроцитами. Эти результаты должны указывать на содержание антигенов и антител, соответствующих одной и той же группе крови. Исследование может дать четыре различных комбинации:
2. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови выявлен антиген А. При этом исследование со стандартными эритроцитами групп крови 0 и А дает отрицательную реакцию, но положительную с эритроцитами группы крови В. Это указывает на наличие в исследуемой крови анти-В антител, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе крови А. 3. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови выявлен антиген В. При этом исследование со стандартными эритроцитами групп крови 0 и В дает отрицательную реакцию, но положи тельную с эритроцитами группы крови А. Это указывает на наличие в исследуемой крови анти-А антител, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе крови В. 4. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови выявляются антигены А и В, исследование с контрольной сывороткой АВ подтверждает специфичность реакции. При этом исследование со стандартными эритроцитами свидетельствует об отсутствии анти-А, анти-В антител в исследуемой сыворотке, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к АВ группе.  Определение группы крови с использованием Цоликлонов (или моноклональных антител другого производителя) Оснащение: - цоликлоны анти-А+В, анти-А, анти-В; - раствор натрия хлорида 0,9%; - пластинки со смачиваемой поверхностью; - пипетки; - стеклянные или пластмассовые палочки. Порядок проведения исследования: 1. Отмаркировать секции на пластинке или планшете, указав Ф.И.О. исследуемого лица и специфичность реагента. 2. Нанести по одной большой капле (около 0,1 мл) каждого реагента: анти-А, анти-В и анти-АВ. 3. Нанести по 1 маленькой капле (около 0,03 мл) исследуемой крови (эритроцитов) рядом с каждым реагентом. 4. Смешать отдельными чистыми стеклянными палочками каждую кайлю крови (эритроцитов) с соответствующим реагентом. 5. Мягко покачивать пластинку. Несмотря на то, что при использовании стандартных реагентов четкая агглютинация наступает уже в первые секунды, результаты реакции учитывают через 3 минуты после окончания смешивания, чтобы не пропустить слабые варианты антигенов. 6. Записать результаты реакции немедленно после определения.  При наличии агглютинации со всеми тремя цоликлонами анти-А, анти-В, анти-АВ необходимо исключить неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для чего смешивают на плоскости одну каплю исследуемой крови или эритроцитов с каплей физиологического раствора натрия хлорида. Заключение о принадлежности исследуемой крови к АВ группе крови делают при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе. Определение анти-А, анти-В антител в сыворотке со стандартными эритроцитами Оснащение: - стандартные эритроциты 0, А, В; - раствор натрия хлорида 0,9%; - пластинки со смачиваемой поверхностью; - пипетки; - стеклянные или пластмассовые палочки. Порядок проведения исследования: 1. Приготовить 5% взвесь стандартных эритроцитов в физиологическом растворе. 2. Промаркировать две пробирки, написав Ф.И.О. исследуемого лица. Поместить в пробирки 1 и 2 по две капли исследуемой сыворотки. Исследование можно проводить и на плоскости, описание методики смотри выше в разделе «Определение групповой принадлежности крови с помощью изогемагглютинирующих сывороток перекрестным способом со стандартными эритроцитами». 3. Добавить одну каплю стандартных эритроцитов группы А в пробирку 1 и каплю эритроцитов группы крови В в пробирку 2, тщательно смешать и выдержать при комнатной температуре в течение 5 минут. 4. Центрифугировать пробирки при 1500 оборотов в течение 30 секунд. 5. Взболтать мягко содержимое пробирки и оценить результат. Наличие агглютинации определить, просматривая пробирку на свет. 6. Записать результат исследования и сопоставить с результатами определения группы крови по цоликлонам.  ПРИЧИНЫ ОШИБОК ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ГРУППОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
Наиболее частой причиной технических ошибок является: • неправильная маркировка пробирок с кровью, взятой на исследование (перепутывание пробирок от разных индивидов); • ошибочный порядок нанесения агглютинирующих сывороток и цоликлонов на пластинку, неправильная регистрация результатов исследования; • нарушение техники исследования: неправильное соотношение сыворотки и исследуемых эритроцитов; использование сывороток с истекшим сроком годности; сокращение времени наблюдения за реакцией; проведение исследования при температуре окружающей среды выше 25°С, что может приводить к ложноотрицательной реакции.
История открытия системы резус Система эритроцитарных антигенов резус (Rh), имеющая не менее важное значение в практической трансфузиологии, чем система АВ0, была открыта в 1940 году Ландштейнером и Винером в результате опытов по иммунизации кроликов и морских свинок эритроцитами макаки резус. Оказалось, что полученная иммунная сыворотка агглютинирует не только эритроциты макаки, но и эритроциты 85% жителей Нью-Йорка белой расы. Выявленный на эритроцитах человека антиген, совпадавший по специфичности с антигенами эритроцитов макаки резус, был обозначен Rh (резус). Эритроциты, содержащие этот антиген, были обозначены как Rh+, а не содержащие его, соответственно как Rh-. Спустя 20 лет оказалось, что антитела иммунной сыворотки, полученной от экспериментальных животных путем их иммунизации эритроцитами макаки резус, а также антитела, полученные путем иммунизации животных эритроцитами человека, реагируют с разными антигенами. Однако историческое наименование антигена осталось, хотя Levine предлагал антитела анти - Rh, полученные от животных, иммунизированных эритроцитами макаки, обозначить как анти - LW в честь Landsteiner и Wiener. В 1940 году Винер и соавторы обнаружили антитела анти – Rh в сыворотках реципиентов, полностью совместимых с донорами по АВ0 системе, но имевших посттрансфузионные осложнения при переливании крови. Тогда же Левином им Стетсоном было сделано предположение о связи иммуноконфликтной беременности, закончившейся смертью плода, с наличием у матери антител к антигенам, экспрессированным на тканях плода, предположительно отнесенных к анти Rh - антителам, т.к. AB0, MN и Р - совместимость у женщины и плода была доказана. К 1943 году стало ясно, что система резус является сложной по своему составу. A. Wiener с помощью 5 основных антисывороток (анти - D, анти - С, анти - Е, анти - с и анти - е) установил 5 различных антигенных факторов этой системы. Сегодня Rh - система является одной из наиболее сложных групповых систем крови, насчитывающей около 50 антигенов, множество фенотипических вариантов, и имеющей сложные серологические отношения. КЛАССИФИКАЦИИ АНТИГЕНОВ ЭРИТРОЦИТОВ СИСТЕМЫ РЕЗУС Классификация Винера основана на предположении, что в Rh хромосоме имеется только одно место, которое может быть занято одним из восьми аллелеморфных генов. Каждый ген кодирует продукцию агглютиногена, состоящего из комплекса антигенов. Антигены можно выявить с помощью антисывороток. Обозначение антигенов по Винеру сложное и широко не используется в иммуногематологии. Исключение составляет обозначение специфичности антител в иммуноглобулине антирезус «Rh0(D)», которое применяется на практике. Классификация Фишера-Рейса основана на предположении наличия в Rh хромосоме трех мест для трех генов. В настоящее время обозначение антигенов по Фишеру-Рейсу рекомендовано экспертным комитетом по биологическим стандартам ВОЗ для широкого применения во всем мире. Эта номенклатура легко запоминается и позволяет сразу увидеть, как данный образец эритроцитов будет реагировать с моноспецифической антисывороткой. Так, например, сыворотка анти-с реагирует с эритроцитами cde/cDE, но не взаимодействует с эритроцитами CDE/CDe.  Исследованиями последних десятилетий установлено существование двух генов: RHD и RHCE, отвечающих за продукцию всех антигенов эритроцитов системы Резус. Наличие большого количества антигенов системы Резус объясняется мутациями в генах. Ген RHD контролирует продукцию антигена D, ген RHCE антигенов С, с, Е, е. Не подтверждено существование антигена d, т.к. не имеется гена, отвечающего за синтез указанного антигена. Несмотря па это, символ d применяется в иммуногематологии для обозначения факта отсутствия антигена D на эритроцитах при описании фенотипов. Лица с резус-положительной принадлежностью крови имеют два гена: RHD и RHCE, лица с резус-отрицательной принадлежностью крови имеют один ген RHCE.  Антигены эритроцитов системы Резус могут быть выявлены при добавлении к ним антисывороток соответствующей специфичности, что проявляется в реакции агглютинации и характеризует определенный фенотип антигенов. Гены.контролирующие синтез АГ системы резус, картированы в 1 хромосоме, на ее коротком плече в участке Р36-р34. Rh гены контролируются набором из 2 тесно связанных генов, расположенных на одной хромосоме. В гаплотип входит ген D и ген CcEe. У родителей, имеющих резус-положительную принадлежность эритроцитов, может родиться ребенок, имеющий резус-отрицательную принадлежность.  |