Тест мед ген. Lektsii генетика. Основы клинической генетики
 Скачать 0.6 Mb.
|
|
Тема 2. Методы клинической генетики. 1. Цитогенетический. Цитогенетика - область науки, изучающая структуру и функции хромосом. Для этого применяются следующие методы: световая микроскопия, электронная и конфокальная лазерная микроскопия, люминисцентная микроскопия Цитогенетический метод включает исследование кариотипа, определение частоты сестринских хроматидных обменов, частоты и типов аббераций хромосом, исследование полового хроматина. Объектом исследования служат соматические, мейотические и интерфазные клетки. В различных ситуациях применяется культивирование фибробластов, клеток костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом является культура лимфоцитов периферической крови. Для этого у консультируемого производится забор 1-2 мл. венозной крови с последующим культивированием ее на фитогемагглютинине в течение 48-72 часов. За 2-3 часа до завершения культивирования используют колцемид (колхицин), который разрушает веретено деления клетки на стадии метафазы (метод метафазных пластинок). Для более детального изучения районов хромосом применяется метод прометафазных пластинок. На следующем этапе культуру клеток обрабатывают гипотоническим раствором с целью разрушения ядерных мембран. После фиксации клеточной суспензии препарат окрашивают. Для этого используются простые, дифференциальные и флюоресцентные методы окрашивания. При простом окрашивании возможна групповая идентификация хромосом (выявляются числовые аномалии). Каждая хромосома имеет индивидуальный рисунок при дифференциальном окрашивании, который определяется специфически чередующимися гетеро- и эухроматиновыми последовательностями. К простым методам окрашивания относят Q,G,R, С. В настоящее время разработаны молекулярно-цитогенетические методы диагностики хромосомных перестроек. Один из них - метод флюоресцентной гибридизации "in situ" (FICH). Он основан на обработке денатурированной хромосомной ДНК специфическими зондами, которые обладают тропизмом к определенным сегментам ДНК. Далее проводится окрашивание флюорохромами. После этого окрашенные хромосомы визуализируются с помощью люминисцентной микроскопии. Метод более информативен по сравнению с простыми и позволяет идентифицировать незначительные по размерам внутри- и межхромосомные перестройки, а также любой вариант известных хромосомных мутаций. Кариотип человека обозначается как: 46,ХХ – для мужчин, и 46,ХУ – для женщин. Плечи хромосом: «q» - длинное плечо, «p» - короткое. Аномалии хромосом записываются следующим образом: Необходимо подчеркнуть показания для проведения цитогенетического исследования: 1) наличие случая хромосомного заболевания (ХЗ) в семье, либо подозрение на ХЗ по клиническим проявлениям: множественные микро- и макроаномалии у пробанда, особенно в сочетании с отставанием в психо-речевом и моторном развитии; задержка умственного и физического развития; 2) первичное невынашивание беременности (2 и более спонтанных аборта, либо выкидыша, мертворождения), первичная аменорея, бесплодие у женщин и мужчин, что может быть обусловлено носительством кого-либо из родителей сбалансированных хромосомных перестроек; 3) пренатальная диагностика хромосомной патологии, а также в случае, если у кого-либо из родителей имеет место наличие транслокационного синдрома; 4) подозрение на синдромы с хромосомной нестабильностью (пр.: лейкоз, наследственные анемии, иммунодефицитные состояния); 5) оценка эффективности лечения, прогноза при лейкозах; 6) оценка мутагенных воздействий. 3. Цитологический метод. К цитологическим методам относятся цитохимический, радиоавтографический (определение синтеза РНК и ДНК, анализ функциональной активности хромосом), иммуннофлюоресцентный и электронно-микроскопический (анализ структурной организации функционально активного хроматина, в том числе при гибридизации соматических клеток, РНК-полимеразная реакция на цитологических препаратах). Применение цитологических методов ограничивается диагностикой некоторых форм наследственных болезней. 4. Популяционно-статистический метод (ПСМ). Основное направление метода - исследование частот генов, спектра, распространенности наследственной патологии в различных этнических группах (популяциях), а также влияния на эти показатели факторов популяционной динамики (инбридинг, дрейф генов, миграции и др.). Популяционно-статистические исследования в СССР были начаты в 70-х гг. сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии Института медицинской генетики АМН СССР, переименованный в настоящее время в Медико Генетический Научный Центр РАМН (МГНЦ РАМН). Ранее научные исследования проводились в республиках Средней Азии (Туркменинистан, Татжикистан, Узбекистан, Казахстан), в Российских регионах - Краснодарском Крае, Костромской, Кировской областях, Адыгее, Республике Марий Эл и др. регионах, а также в Мордовии (изучена группа наследственных болезней нервной системы). Результаты подобных работ имеют важное значение не только в научном плане, но и для практического здравоохранения регионов, так как в ходе исследований одномоментно проводится скрининг населения по всем формам наследственной патологии, отягощенным семьям оказывается квалифицированная медико-генетическая консультативная помощь ведущими сотрудниками МГНЦ РАМН, применяются новейшие диагностические методы (ДНК-типирование, цитогенетическое, биохимическое исследование, компьютерная диагностика). В итоге такие исследования позволяют реально оценить обьем медико-генетической, лечебно-реабилитационной помощи населению, региональные медико-генетические консультации получают возможность для формирования диагностических, профилактических и др. регистров. Иными словами результаты популяционно-статистических исследований являются залогом адекватной диспансеризации населения в области наследственной патологии. 5. Биохимический метод (БМ). Методы аналитической биохимии применяются, главным образом, для диагностики наследственных болезней обмена (НБО). Для этого выделяют несколько этапов: 1 этап: применяются ориентировочные биохимические тесты, являющиеся основой массового скрининга всех новорожденных, либо селективного "просеивания" в группах риска по конкретной наследственной патологии обмена (например – в домах-интернатах для больных). В России проводится массовый скрининг с целью раннего выявления фенилкетонурии (ФКУ) (проба Феллинга, тест Гатри) и врожденного гипотиреоза(ВГ) (исследование тироксина -Т4 и тиреотропного гормона - ТТГ). Микробиологический тест гатри разработан в 60-х гг.в США. Для диагностики применяются фильтровальная бумага, пропитанная каплей крови новорожденного, взятой на 4-5 сутки жизни из пятки или большого пальца. При проведении пробы рост бактерий на питательной среде происходит вокруг вокруг дисков с образцами крови, содержащих избыточное количество фенилаланина, концентрацию которого можно определить по контрольным образцам. Нередко в педиатрических стационарах РФ применяется проба Феллинга. Материалом для исследования служит моча предполагаемого больного, в которую добавляется треххлористое железо, изменяющее окраску мочи при избыточном содержании продуктов фенилаланина. Проба менее информативна по сравнению с тестом Гатри. Она может быть положительной при других наследственных заболеваниях: лейцинозе, тирозинозе, гистидинемии. С целью исключения ложноположительных результатов пробы рекомендуют проводить трижды. Эти исследования возлагаются на региональный уровень медико-генетического консультирования (МГК). Кроме того, в медико-генетических консультациях широко применяется большая группа тестов для раннего выявления наследственной патологии обмена. К ним относятся: - исследование плотности, прозрачности, реакции и цвета: снижение плотности утренней мочи взятой натощак до 1006 и ниже наблюдается при несахарном диабете, кислая реакция мочи – при аминоацидопатиях, изменение прозрачности наблюдается при липурии; черно-коричневая окраска мочи при добавлении щелочи имеет место при алкаптонурии, молочно-белый – при липурии, красный – при порфирии, гемоглобинурии, коричневый – при метгемоглобинурии, порфирии, билирубинурии; - проба Селиванова: выявляет избыток фруктозы (при фруктоземии); - тест на кетоновые кислоты: выявление алкаптонурии, фенилкетонурии, болезни «мочи с запахом кленового сиропа», гистидинемии, болезни «сушеного хмеля»; - иодозидная проба на цистин, гомоцистин: при гомоцистинурии, цистинурии, болезни Вильсона-Коновалова, синдрома де Тони-Дебре-Фанкони; - проба Пантуса на ионы хлора: при гипо- гиперальдостеронизме, тубулопатиях; - тест на пролин: при б. Вильсона-Коновалова, , синдромах Жозефа, де Тони-Дебре-Фанкони; - проба Бенедикта на сахара, фенольные кетокислоты: при галактоземии, с-ме де Тони-Дебре-Фанкони, цистинозе, врожденной непереносимости лактозы, почечном и сахарном диабете; - проба Гайнеса аналогична предыдущей, но более информативна в отношении сахаров; - тест с толуидиновым синим на выявление гликозоаминогликан:при мукополисахаридозах; - проба Сулковича на ионы кальция: при идиопатической гиперкальциемии; - тест Милона на тирозин: при тирозинозе, синдроме Хартнапа, галактоземии, б.Вильсона-Коновалова, цистинозе; - проба Легаля на кетоновые тела: при сахарном и почечном диабете, гликогенозах; - проба Альтгаузена: при гликогенозах - проба на медь: при болезни Вильсона-Коновалова. Спектр тестов обширен и их количество зависит от возможностей и оснащенности биохимических лабораторий медико-генетических консультаций. Разработан массовый биохимический скрининг беременных (исследование альфафетопротеина, хорионического гонадотропина, эстриола, 17-оксипрогестерона и др.) с целью пренатальной диагностики хромосомных синдромов, врожденных аномалий развития. Массовый скрининг рекомендуется осуществлять при следующих условиях: 1) тестируемое заболевание является частым (распространенность более 1 случая на 20 тыс. новорожденных); 2) наличие методов профилактической терапии (ФКУ, ВГ и др.) и пренатальной диагностики; 3) применяемые экспресс-методы диагностики экономически доступны для региона. 2 этап: уточнение диагноза с использованием высокочувствительных методик биохимического анализа (газовая, жидкостная хроматография и др.). Это позволяет определить содержание, активность конкретного субстрата, фермента (энзимодиагностика), продукта промежуточного обмена в жидких средах организма, фибробластах, гепатоцитах, эритроцитах и др. клетках. Результаты этого исследования служат основой для проведения последующей пренатальной диагностики, основанной как на методах аналитической биохимии, так и ДНК-диагностике. 3 этап: окончательный диагноз НБО основан на результатах ДНК-типирования. В настоящее время существуют методики биохимического анализа, позволяющие определить наличие любого известного на сегодняшний день субстрата организма человека. 6. Близнецовый метод. Близнецовый метод применяется для сравнительной оценки вклада генетических и средовых факторов в процесс формирования нормальных и аномальных признаков у человека. С этой целью проводится анализ идентичности (конкордантности) и различия (дискордантности) этих признаков среди пар моно- и дизиготных близнецов. Частота двоен составляет примерно 1-2% от общего числа родов, троен - 1:10-15 тыс. родов. Конкордантность по умственной отсталости у монозиготных близнецов составляет - 97%, по шизофрении - 69%, по эпилепсии - 67%; у дизиготных - соответственно 37, 10 и 30%%. Существует несколько подходов в близнецовых исследованиях: 1) диагностика зиготности, основанная на анализе сходства и различия признаков в паре (метод полисистемного сходства): сравнение цвета и плотности трабекул радужных оболочек, особенности строения лицевой и др. областей (разрез глазных щелей, форма ушных раковин, носа, черепа, характер оволосения, пигментация и т.д.); 2) экспериментальное изучение близнецов: сравнение по антигенному составу, белковым фракциям, активности ферментов, по характеристикам видов обмена (углеводный, липидный и др.), по гаплотипам HLA, по исследованию вкусовой чувствительности (например на фенилтиокарбамид), по результатам параклинических методов диагностики (РКТ, ЭМГ, ЭЭГ, допплерография и др.); 3) анкетирование близнецов (при масштабных популяционных исследованиях); 4) метод контроля по партнеру: применяется у монозиготных близнецов, позволяет сравнить влияние средового фактора (напр. лекарственного препарата) на одного из близнецов в паре, при отсутствии такого же воздействия на другого близнеца. Подобный подход позволяет более быстро и достоверно получить необходимые результаты исследования эффективности лекарственного препарата. 7. Иммуннологический метод. В настоящее время существует большое направление в клинической генетике называемое иммуногенетикой, в рамках которого проводятся исследования генетических маркеров (при анализе сцепления генов и определении предрасположенности к болезням), иммунного статуса в сопоставлении с генотипом при наследственной и мультифакториальной патологии, иммунодефицитных состояниях (агаммаглобулинемия и др.), несовместимости матери и плода. 8. Метод дерматоглифики (МД). Метод дерматоглифики основан на изучении кожных рисунков на ладонях и стопах. При хромосомных заболеваниях очень часто имеют место разнообразные изменения дерматоглифики, поэтому, МД применялся ранее для диагностики ряда хромосомных синдромов (с-мы Дауна, Клайнфельтера и др.) до распространения в практику цитогенетического метода. При проведении синдромологического анализа необходимо оценивать состояние дерматоглифики. 9. Молекулярно-биологический (молекулярно-генетический) метод - один из важнейших современных диагностических методов клинической генетики, позволяющий установить окончательный диагноз на пренатальной, доклинической и субклинической стадиях моногенного заболевания. В настоящее время он все шире применяется с целью диагностики гетерозиготного носительства, мультифакториальной патологии (вариантов артериальной гипертензии, сахарного диабета, онкопатологии и др.), а также возбудителей инфекционных заболеваний (герпес, токсоплазмоз, грипп, цитомегаловирус, ВИЧ, атипичная пневмония и др.). Перспективы профилактики заболеваний связаны именно с этим методом. Кроме того, метод необходим для разработки и внедрения этиотроного лечения как моно- так и полигенных заболеваний. В судебной практике метод широко применяется для идентификации личности и решения проблемы спорного отцовства. ДНК-типирование подразумевает определение первичного генетического дефекта. По меньшей мере для 1000 форм на сегодня картированы мутантные гены и для большинства из них установлены типы мутаций. Исследования подобного рода обладают очень высокой достоверностью. Внедрение ДНК-исследований в практику здравоохранения очень важно, так как позволяет существенно повысить эффективность медико-генетического консультирования. Внутри метода выделяют прямые и косвенные подходы ДНК-диагностики. Прямые методы ДНК-типирования проводятся в том случае, когда известна точная локализация мутантного гена (еще лучше – варианты мутаций). Для исследования достаточно материала от пораженного члена семьи. 1) Метод "блот-гибридизации", предложенный в 1975 году Саузерн. Сущность его заключается в расщеплении ДНК специфическими рестриктазами, "узнающими" определенные нуклеотидные последовательности. После этого полученные фрагменты ДНК разделяют методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, далее - фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и подвергают гибридизации с олигонуклеотидным зондом, меченым изотопом, который комплементарно связывается с фрагментом ДНК. После отмывки несвязанной с фильтром радиактивной метки проводится экспозиция исследуемого фрагмента на рентгеновской пленке и анализируется полученный результат, что позволяет определить перестройки внутригенных нуклеотидных последовательностей либо тесно сцепленных с мутантным геном. 2) В настоящее время очень широко применяется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод был впервые предложен в 1983г. американским ученым Кэрри Б.Мюллису Различают три этапа проведения ПЦР: 1) выделение ДНК из исследуемого материала (венозная кровь и другие клетки организма, содержащие хромосомный материал ); 2) амплификация, сущность которой заключается в многократном синтезе определенного участка гена; 3) электрофорез аплифицированного фрагмента в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием препарата и анализом характера внутригенной перестройки либо ее исключением. Метод прост, экономичен, являясь в тоже время высокочувствительным. В России ДНК-типирование проводится при следующих моногенных заболеваниях: хорея Гентингтона, миодистрофии Дюшенна/Беккера, Эрба-Рота, Ландузи-Дежерина спинальные, невральные мышечные атрофии, адреногенитальный синдром, фенилкетонурия, муковисцидоз, мукополисахаридозы и др. (возможна разработка методики исследования любого заболевания, для которого картирован мутантный ген). Косвенные методы основаны на семейном анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (метод ПДРФ) исследуемых районов ДНК. Он применим в тех случаях, когда известна приблизительная локализация мутантного гена, т.е изучены участки близкосцепленные с предполагаемым геном. Основная сложность заключается в подборе тесно сцепленных с маркером болезни ПДРФ-зондов. Для исследования необходим материал от членов "ядерной" семьи (т.е. пробанда и его родителей). Метод применим для проведения пренатальной диагностики. Безусловно современные возможности молекулярной биологии не исчерпываются вышеописанными методами и происходит постоянное внедрение новых технологий. Кроме вышеотмеченных методов применяются также молекулярно-биологические исследования на уровне белков (энзимодиагностика, иммунохимическая диагностика и анализ физико-химических свойств белков) и промежуточных продуктов метаболизма (флюорометрия, хроматография и др.). Лаборатории, позволяющие проводить вышеописанные исследования в России имеются только в федеральных центрах. 10. Генотерапия. Основные понятия. ВВЕДЕНИЕ. Проблемы генотерапии наследственных и мультифакториальных болезней на современном этапе решаются в сфере молекулярной медицины, которая рассматривает проблемы здоровья и болезней человека на уровне функции нуклеиновых кислот. Основные разделы молекулярной медицины - это молекулярная диагностика, привентивная (профилактическая) медицина и генная терапия. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Согласно современным представлениям генную терапию (ГТ) понимают как введение нуклеиновых кислот в клетку с целью воздействия на медицинский статус организма и/или лечения болезни. При этом сам ген уже воспринимается как новый фармацевтический препарат для лечения многих заболеваний, не только моногенных, но и полигенных, мультифакториальных и других патологических состояний. Если к этому добавить безусловную перспективность генов и их ДНК-фрагментов в создании нового поколения вакцин против многих инфекционных болезней и даже опухолей, то потенциальные возможности ГТ представляются безграничными! Предполагается, что на современном этапе развития молекулярной медицины, фармакология может пополнится 60-70 тысячами новых генно-инженерных препаратов! Поэтому ведущие фармацевтические фирмы мира, особенно США, не скупятся на вложении сотен млн. долларов в разработку сотен проектов генотерапии. Следует отметить, что из нескольких сотен проектов около 66% еще находятся на фазе I клинических испытаний (оценка токсичности генной конструкции), около 33% - между фазами I/II (ограниченные испытания на небольшом контингенте больных) и только 2 проекта, касающиеся лечения смертельной опухоли мозга - глиобластомы - на фазе III (широкомасштабные клинические испытания в нескольких центрах). Естественно, что среди выполняемых проектов ГТ более 60% приходится на лечение опухолей, примерно по 15% на лечение инфекционных болезней (СПИД, гепатит В, туберкулез и др.), столько же на лечение моногенных заболеваний (муковисцидоз, болезни накопления (мукополисахаридозы), семейная гиперхолестеринемия, гемофилия В и др.). Остальные эксперименты касаются, главным образом, изучения возможностей использования генных конструкций с целью клеточного маркирования в опытах in vivo. Такие эксперименты были начаты еще в 1989г. и позволили получить важную информацию об иммунологических свойствах опухолевых клеток и их чувствительности к Т-лимфоцитам. В целом история ГТ как нового направления медицины может быть разделена на три этапа. Этап I - (1970-1990) характеризуется попытками лечения дефицита фермента аргиназы заражением клеток вирусом папилломы Шоупа. В это же время предпринята неудачная попытка лечения бета-таллассемии пересадкой клеток костного мозга, трансформированных ex vivo бета- глобиновым геном; генетическое маркирование Т-лимфоцитов. Начало этапа II знаменуется единственной до настоящего времени успешной попыткой лечения врожденного иммунодефицита, осуществленной в США в сентябре 1990 г. В 1992 г. предприняты попытки лечения методом ex vivo семейной гиперхолестеринемии (мутация в гене рецептора липопротеинов низкой плотности) и гемофилии В, в 1993 г. - муковисцидоза и в 1995 г. - первые попытки лечения глиобластомы. Эти исследования по ГТ и попытки клинических испытаний до 1996 г. все еще оставались единичными. С 1997 г. и по настоящее время (этап III), когда наметился качественный прорыв в технике доставки чужеродных генов и, как казалось многим, появились реальные шансы быстрого терапевтического эффекта при самых разных заболеваниях,) число проектов, одобренных в США Комитетом RAC (Recombinant Advisory Committee) увеличилось до 200 и продолжает стремительно возрастать, достигнув к концу 1999г уже 400. Вместе с тем, по справедливому замечанию одного из пионеров ГТ американского исследователя Фрэнча Андерсона " За исключением нескольких непроверенных случаев ни один из протоколов ГТ пока не оказался успешным в лечении болезней человека ". Краткий анализ результатов ГТ на сегодняшний день позволяет прийти к следующим основным выводам: 1) ГТ пригодна для лечения широкого спектра заболеваний; 2) ГТ- в применяемом объеме имеет низкий риск осложнений; 3) Эффективность ГТ пока весьма разочаровывает. В чем же основная причина таких неудач? Главное - до сих пор практически ни в одном проекте ГТ не удалось получить успешной трансформации (трансдукции) достаточно большого числа клеток-мишеней и добиться терапевтически значимой длительности экспрессии чужеродного гена. ПРОБЛЕМА ВЕКТОРОВ - ОСНОВНАЯ ПРОБЛЕМА ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Проблема доставки нужного гена в нужную клетку с целью получения правильной дозы необходимого белкового продукта, обладающего терапевтическим эффектом, до настоящего времени не решена и по сути, продолжает оставаться центральной проблемой ГТ проектов. Трудность достижения этой цели по образному выражению Фрэнча Андерсона определяется тем, что "организм человека затратил много тысяч лет, чтоб защитить себя от нападения факторов вненешней среды, в т.ч. от чужеродной ДНК, пытавшейся проникнуть в его геном". Естественно, что преодолеть эти барьеры оказывается очень сложно. Не случайно технология доставки генов является главным препятствием на пути успеха ГТ. Для решения этой проблемы в настоящее время существуют самые разные методы (физические, химические, биологические). Рассмотрим основные из них, которые активно совершенствуются и представляются наиболее перспективными на сегодняшний день. 1) Хорошо известно, что наиболее популярными в проектах ГТ до настоящего времени являются векторы на основе вирусов и липидов (липосом). При этом из 396 ГТ проектов на сентябрь 1999г. в более 40% используют различные варианты ретровирусов (РВ), в 20% - модифицированные аденовирусы (АВ), в 20% липосомы (Л). В остальных 20% проектов применяют, адено-ассоциированный вирус (ААВ), вирус оспы, генное ружье (ГР) и даже "голую" ДНК. Каждый из векторных систем имеют свои преимущества и недостатки. Учитывая, что основным недостатком АВ был выраженный иммунный ответ организма на введение АВ конструкций, прогресс в этой области коснулся создания АВ векторов, лишенных практически всех собственных генов АВ (gutted AdV vectors) и АВ, с резко ослабленным антигенными свойствами, провоцирующим иммунный ответ. Последние по аналогии с военным самолетом-невидимкой получили название Стелс ( Stealths AdV). Естественно, что удаление собственных генов АВ позволило резко увеличить размеры переносимых генных конструкций, однако, и создало дополнительные сложности с наработкой и очисткой таких векторов. В связи с тем, что ретровирусы успешно инфицируют только митотически делящиеся клетки, заметно повысился интерес к другим вирусам, таким как ленти-вирусы и особенно адено-ассоциированные вирусы, которые хорошо проникают и в неделящиеся клетки . Большое внимание в последние годы уделяется разработке комбинированных векторов с адресной доставкой, совмещающих преимущества вирусных и невирусных носителей. В частности, особенно активно изучаются комбинации АВ + полилизин + белок (асиалогликопротеин для рецепторов клеток печени, трансферрин (мышечные фибриллы), Fab-полилизин (эпителий бронхов, кишечника). Весьма перспективным представляется использование не самих вирусов, а только отдельных пептидов их оболочки, контролирующих процесс проникновения в клетку и интернализацию в ядро. Некоторые вирусные олигопептиды использованы в экспериментах по ГТ миодистрофии Дюшенна (см. ниже). В качестве перспективных векторов на сегодняшний день рассматриваются синтетические полимеры типа полиэтиленоксид - полиэтилэтилен, а так же биологические полимеры типа декстрана, желатина, образующие при определенных условиях упаковки микросферы, называемые так же полимеросомы. Размеры таких микросфер можно регулировать в зависимости от условий упаковки. Кроме того, их неограниченные возможности в отношении размеров плазмидной ДНК, растворимость в живых тканях (биодеградируемость) и выраженная способность к проникновению внутрь клеток и даже в ядра (см. ниже) привлекают к полимеросомам все больше специалистов по ГТ. Один из вариантов таких полимеросом оказался особенно перспективным для ГТ миодистрофии Дюшенна (см. ниже). Другой биологический полимер - ателоколлаген - с успехом применен в создании депо для экспрессирующихся генных конструкций в скелетных мышах. НОВЫЕ ПОДХОДЫ К КОРРЕКЦИИ ГЕННЫХ ДЕФЕКТОВ Сравнительно недавно предложен ряд принципиально новых вариантов ГТ. При этом основное внимание обращено не на доставку нормального гена в клетки-мишени, а на коррекцию повреждений ДНК в самих клетках. 1) Согласно новой технологии, получившей название химерапластика, в культуру клеток добавляют небольшие по размерам синтетические ДНК/РНК гибридные молекулы (химеропласты), состоящие из короткой (25 нуклеотидов) цепочки ДНК и комплементарной ей цепочки нуклеотидов РНК. При этом в последовательность ДНК/РНК шпилечной структуры включают нужное основание, по которому планируется замена. Обе нуклеотидные последовательности шпилечной структуры комплементарны фрагменту двухцепочечной геномной ДНК, несущей мутацию. Высокая концентрация олигонуклеотидов в ядре, и наличие бактериального RecA белка позволяет на несколько порядков повысить частоту гомологичной рекомбинации. По некоторым данным успешная конверсия (замещение нужного кодона в геномной ДНК) происходит в 25-40% клеток. Примененный ex vivo метод позволяет высокоэффективно осуществлять коррекцию генных дефектов. Клетки-мишени с восстановленной структурой генома могут быть возвращены в организм больного. Подобный подход может быть очень перспективным. Предполагается, что метод химеропластики может найти применение для ГТ не менее 2 000 различных наследственных заболеваний. Разработкой метода химеропластики наиболее активно занимается американский ученый Майкл Блайз - один из ближайших сотрудников пионера генной терапии Френча Андерсена. 2) Концептуально близок к химерапластике и второй ГТ подход, направленный на коррекцию последовательности самого гена. Для многих генов показано, что отсутствие целого экзона функционально менее катастрофично для функции белка, чем сайтовые мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания, либо резко нарушающие конформацию белкового продукта, например, нонсенс мутации (возникновение стоп-кодона) при миодистрофии Дюшенна или delF508 в гене СFTR при муковисцидозе. Суть метода, получившего название exon-skipping (перепрыгивание, выбрасывание экзона) сводится к применению методики, приводящей к выбрасыванию из мРНК экзона, несущего мутацию до сплайсинга. Такой подход был с успехом применен для выбрасывания экзона 23 с мутацией типа стоп-кодон у мышей mdx- биологических моделях миодистрофии Дюшенна Естественно, что оба метода (химерапластика и exon-skipping) могут быть применены только для коррекции генома мутантных клеток вне организма. Последние в случае успешной трансформации могут быть пересажены пациенту обратно. Данный подход получил названия ex vivo и уже нашел применение в клинических проектах по ГТ. Удельный вес проектов ГТ с применением метода ex vivo пока невелик и составляет около 10%. Основная часть проектов по ГТ использует непосредственное введение генноинженерных конструкций в ткань опухоли (25%), внутривенно (15%) и подкожно (15%). Другие способы доставки генов включают внутритрахеальный, внутримышечный, внутриназальный и др. Некоторые из этих подходов были применены в экспериментах по генной терапии миодистрофии Дюшенна . ПЕРВЫЕ ПОПЫТКИ ГЕНОТЕРАПИИ МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Наряду с моногенными заболеваниями, где в основе терапевтического эффекта лежит доставка в клетки-мишени неповрежденной экспрессирующейся генной конструкции, все более широкое внимание привлекают ГТ подходы к лечению мультифакториальных заболеваний, патогенетическую основу которых составляют не один, а много разных генов, повреждения которых реализуются в определенных неблагоприятных внешних условиях. Именно при таком варианте ГТ гены выступают как лекарственные препараты, обеспечивающие симптоматическое лечение. Естественно, что в значительной мере сказанное относится к опухолям, подавляющее большинство которых относится к мультифакториальным заболеваниям. Отметим только, что при лечении многих опухолей мультифакториальной природы все чаще используют целый набор различных экспрессирующихся генно-инженерных конструкций, продукты которых воздействуют на разные факторы и механизмы прогрессии опухоли. Так, для лечения рака простаты широко применяют стратегию замены генов -супрессоров опухолей p53, H-ras, Rb, p21, антисмысловые олигонуклеотиды к гену Bcl2 (для блока антиапоптозных генов), традиционные гены-самоубийцы (вирусная тимидинкиназа или цитозин-дезаминаза), а также ген меМЗранного белка е-кадхерина, который обычно утрачивается при прогрессии опухоли, гены, корректирующие чувствительность опухолевых клеток к андрогенам. Значительный прогресс в последнее время достигнут в лечении нейродегенеративных заболеваний таких как боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона и др. Смысл ГТ вмешательства, проходящего клинические испытание заключается во вживлении в определенные подкорковые отделы мозга при помощи стереотаксического аппарата полупроницаемых пластмассовых капсул содержащих культуры клеток, продуцирующих целый набор белков, препятствующих дегенерации нервных клеток, таких как ген цилиарного нервно-трофического фактора (hCNTF), нейротрофические гены MNTF-BDNF, NT-3, mNT 4/5; антиоксидантные гены - SOD-2, CP-2; антиапоптозные гены - Bcl2, BclK. При необходимости в эти же экспрессирующиеся конструкции включается и ген тимидинкиназы вируса герпеса, позволяющий ликвидировать инкапсулированные клетки-продуценты с помощью ганциклавира. Весьма обнадеживающие результаты получены на лабораторных кроликах по лечению ревматоидного артрита. Известно, что более 30 млн американцев страдают ежегодно от этого тяжелого заболевания. Решающая роль в воспалении суставов и их последующей деформации принадлежит различным цитокинам и другим воспалительным клеточным факторам. Для ГТ ревматоидного артрита предполагается использовать TGF, IGF, BMP-2. Самым перспективным, как показали эксперименты на кроликах, является ген IL-1Ra, отвечающий за синтез белка-антагониста рецептора интерлейкина IL-1. Существенный прогресс достигнут в экспериментах по профилактике тромбообразования путем введения в клетки эндотелия сосудов гена тканевого активатора плазминогена (фактора V свертывания крови), и профилактики рестеноза артерий после трансплантации (шунтирования) коронарных сосудов, введение гена МuLv, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток интимы сосудов. |