генная инженерия. Отчет. Отчет по лабораторным работам по дисциплине Генная инженерия в декоративном растениеводстве
 Скачать 1.68 Mb.
|
|
Тема 10. Производство посадочного материала из регенеранотов, полученных в культуре in vitro. Основные проблемы промышленного производства посадочного материала из регенерантов, полученных в культуре invitro; С биологической точки зрения клональное микроразмножение – очень сложный процесс, на который влияют разнообразные факторы: свойства самого растения, состав питательной среды, освещение, температура и др. Очевидно, что для каждого вида растений должна быть подобрана своя индивидуальная методика. Получаемые микрорастения требуют адаптации к условиям защищенного грунта, т.е. – пересадки в почву и доращивания в микропарниках в условиях повышенной влажности и умеренной освещенности. Себестоимость получаемого посадочного материала сильно варьируется В процессе микроклонального размножения возможны отклонения от сорта Большую проблему в технологии микроклонального размножения создают физиологические расстройства - стекловидность, некроз верхушек, нефункциональная корневая и надземная системы. Примеры фирм, занимающихся производством посадочного материала из регенеранотов, полученных в культуре invitro, а также видовой (сортовой) состав таких растений. ООО НПП «Микроклон» (ВСЕГО СОРТОВ: 435) Гейхера волосистая (Pistaсhe/ Фисташ) ЖИМОЛОСТЬ СИНЯЯ (Бакчарская) ТИАРЕЛЛА ГИБРИДНАЯ (Heronswood Mist / Херонсвуд Мист) И др. in-vitro Кусибаб Kиви Арония Aзалия Береза Сирень Mалина Ежемалина Шелковица Pододендрон Ирга канадская Клюква Kлубника Роза CИББИОТЕХ Бадан (Галина Серова) Гейхера (Art Deco / Art Nouveau / Brass Lantern / Cappuccino) Калина (Boule de Neige Roseum / Бульденеж (Розеум)) Тема 11. Методы работы с бактериальной культурой Уникальные биологические свойства Ti-плазмиды делают ее идеальным природным вектором для переноса генов. Ti-Плазмида имеет широкий круг хозяев, встраивает Т-ДНК в хромосомы растений, где она может реплицироваться, и ее гены транслируются с образованием белка. Существенно также, что границы Т-ДНК обозначены прямыми повторяющимися последовательностями длиной 25 нуклеотидных пар, и любой фрагмент чужеродной ДНК, вставленный между этими повторами, будет перенесен в растительную клетку. Однако манипуляции с Ti-плазмидой затруднены из-за больших размеров, вставить ген в плазмиду традиционными методами не представляется возможным. Поэтому Ti-плазмида была модифицирована генно-инженерными путями, и на ее основе были получены векторы для трансформации растений. Кроме того, надо отмстить, что после трансформации растений природной Ti-плазмидой трансформированные клетки не будут способны к регенерации, поскольку в них подавлена дифференцировка за счет активности шести генов Т-ДНК области, кодирующих признаки опухолеобразования. Если же последовательности генов, блокирующих дифференцировку, вырезать из Т-ДНК, трансформированные клетки обретут способность к регенерации. Поэтому при использовании Ti-плазмид для получения векторных конструкций последовательности генов, ответственных за опухолеобразование и синтез опинов, вырезают, оставляя только фрагменты Т-ДНК, необходимые для ее переноса в растительный геном (прежде всего последовательности левого и правого пограничного повторов). В область Т-ДНК в дальнейшем и 23 встраиваются чужеродные гены, которые желательно ввести в геном растения. Таким образом, вектора для трансформации растений на основе Tiплазмид агробактерий должны содержать следующие структурные элементы: ● последовательности правой и левой границы Т-ДНК, а также последовательности, необходимые для переноса и встраивания области Т-ДНК в геном растительной клетки; ● последовательность гена селективного маркера, что позволит проводить селективный отбор трансгенных растений. В качестве селективного маркера могут использоваться гены устойчивости к антибиотикам (nptll — устойчивость к канамицину, hptl l- устойчивость к антибиотику гигромицину), ген tor (устойчивость к гербициду фосфинотрицину (BASTA) и ген ALS (устойчивость к гербициду хлор- сульфорону), ген бета-глюкуронидазы (фермент расщепляющий субстрат X-Gluc) и ряд других; ● последовательности, облегчающие встраивание целевого гена (полилинкерные последовательности, промоторные и терминаторные последовательности); ● сайты инициации для репликации в бактериальных клетках. К о и н т е г р а т и в н ы й в е к т о р. Один из способов, облегчающий введение чужеродной ДНК в геном растения, заключается в использовании коинтегративных векторов. Смысл подхода состоит в следующем. Весь процесс введения чужеродного гена в геном растений делится на два этапа: клонирование гена, который следует встроить в растительный геном, и собственно трансформация растительной клетки. Эти два этапа осуществляются с помощью различных векторов. В качестве вспомогательного (промежуточного) вектора, в котором проводят клонирование нужного нам гена, используют векторы на основе плазмиды Е. coli, в которые вставляют фрагмент Т-ДНК с пограничными последовательностями Т-ДНК и ген селективного маркера (обычно ген, кодирующий устойчивость к антибиотику (канамицину, гигромицину или гербициду), что в будущем позволит проводить селективный отбор 24 трансгенных растений. Такой вектор обладает небольшими размерами, и его используют для клонирования в нем нужного гена, вставляя его последовательность в область Т-ДНК. С помощью конъюгации такой промежуточный вектор переносят в клетки специальных штаммов A. lumefaciens, содержащих другой вектор, несущий гены, необходимые для интеграции области Т-ДНК в геном растения. Этот вектор имеет значительные размеры и представляет собой фрагмент Tiплазмиды, несущей v/r-область, пограничные последовательности Т-ДНК и фрагменты плазмиды, аналогичные промежуточному вектору. После конъюгации происходит рекомбинация между гомологичными участками двух векторов, в результате фрагмент промежуточного вектора, содержащий нужный ген и селективный маркер, переносятся во второй вектор с v/r-областью и пограничными последовательностями Т-ДНК. Таким образом, в результате рекомбинации между двумя плазмидами получается коинтегративный вектор. Клетки агробактерий, содержащие такой коинтегративный вектор, отбираются на селективных средах и используются в дальнейшем для трансформации растений. Б и н а р н ы й в е к т о р. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-область, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, vir-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая - vir-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соli (в том числе и точку 25 начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. coli и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегративному вектору целевой ген и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с virобластью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые vir-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. Векторы для трансформации растений на основе Ri-плазмид. Помимо Ti-плазмид A. lumefaciens способностью трансформировать растительные клетки обладают также и Ri-плазмиды (от англ. Root inducing - индуцирующая (избыточное] корнеобразование), выделенные из агробактерии A. rhizogenes. Riплазмиды вызывают усиленное образование корней и, также как Ti-плазмиды, приводят к синтезу опинов. Однако Ri-плазмиды в большинстве случаев не онкогенны, и после трансформации растительные клетки способны регенерировать здоровые плодовитые растения. В настоящее время на основе Riплазмид также получены вектора для генной инженерии растений. Тема 12. Методы выделения плазмид, лигирование вставок в плазмиду ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ ЩЕЛОЧНОГО ЛИЗИСА. Для выделения плазмидной ДНК пользуются различными методами, которые включают три основных этапа: выращивание бактерий и амплификацию плазмидной ДНК; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК. При выделении ДНК плазмид используют два основных различия между хромосомной и плазмидной ДНК: 1) хромосомная ДНК по размеру много больше ДНК плазмид, используемых в качестве векторов; 2) основная масса хромосомной ДНК выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как плазмидная ДНК – в виде ковалентно замкнутых кольцевых молекул. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга в тех условиях, при которых происходит разрыв водородных связей в ДНК (нагревание или рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, тогда как хромосомная ДНК остается денатурированной. Из всех векторов при работе с бактериями E.coli чаще всего используется плазмида pBR322 (4362 п. н.), которая содержит 2 селективных маркера устойчивости к ампициллину (ApR ) и тетрациклину (TcR ). При трансформации клеток E.coli может образовывать 108 трансформантов на 1 мкг плазмидной ДНК ВЫДЕЛЕНИЕ ХРОМОСОМНОЙ ДНК ПО МЕТОДУ МАРМУРА. Необходимым этапом клонирования генов является получение фрагментов хромосомной ДНК. При выделении хромосомной ДНК из бактерий для лизиса клеток чаще всего бывает достаточным использование лишь одного детергента. Иногда для лизиса бактерий приходится пользоваться более сложным приемом: вначале обрабатывать клетки лизоцимом (гидролитическим ферментом, действующим на пептидогликан клеточной стенки), а затем уже применять детергент. РЕСТРИКЦИЯ И ЛИГИРОВАНИЕ ДНК, Рестрикция ДНК. Рестриктазы – это ферменты, “узнающие” определенные последовательности в двуцепочечной ДНК и расщепляющие молекулу ДНК в этих сайтах. Их выделяют преимущественно из прокариотических клеток. Сайты узнавания и рестрикции состоят обычно из 4–6 нуклеотидов и обладают осью симметрии 2-го порядка. Многие ферменты рестрикции производят разрыв не точно по оси симметрии, а в точках двух цепей ДНК, отстающих друг от друга на несколько нуклеотидов. В результате такого разрыва образуются фрагменты ДНК с выступающими “липкими” 5'- концами. Каждый такой конец может взаимодействовать с любым другим концом, комплементарным ему. Таким образом, любые молекулы ДНК содержащие сайты рестрикции, можно соединять с другими молекулами и в результате получать рекомбинантные молекулы. Список литературы Методические указания «Культивирование изолированных тканей» «БИОТЕХНОЛОГИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ: КУЛЬТУРА IN VITRO»; О. А. АВКСЕНТЬЕВА, В. А. ПЕТРЕНКО (2011 г.) https://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/klonalnoe-mikrorazmnozhenie-rasteniy/ https://pandia.ru/text/77/474/80445-3.php https://studme.org/271471/tehnika/kallusnye_kultury_rasteniy http://www.spec-kniga.ru/tehnohimicheski-kontrol/osnovy-mikrobiologicheskogo-kontrolya-konservnogo-proizvodstva/pitatelnye-sredy-i-ih-prigotovlenie-obrashchenie-s-bakterialnymi-kulturami-i-metody-poseva-na-pitatelnye-sredy.html http://www.bio.bsu.by/genetics/files/3.molgen/molecular_genetics_metodichka_2003.pdf https://biomolecula.ru/articles/molekuliarnoe-klonirovanie-ili-kak-zasunut-v-kletku-chuzherodnyi-geneticheskii-material Высоцкий В.А. Регенерация плодовых и ягодных растений в культуре каллусной ткани, пыльников, листовых и стеблевых эксплантов// Садоводство и виноградарство. –2008. − № – С. 17-20. Орлова С.Ю. Особенности размножения сортов вишни различного происхождения в культуре in vitro / С. Ю. Орлова, А. А. Юшев // Плодоводство на рубеже XXI века: Матер. междунар. конф., посвящ. 75- летию со дня образования Белорусского НИИ плодоводства – Минск, 2000. – С. 27-28. Шорникова Д. Г. Совершенствование технологии размножения редких садовых растений в культуре in vitro и оценка их потенциала устойчивости к абиотическим стрессорам. дис. ... канд. с.-х. наук / Д. Г. Шорников. – М., 2008. – 192 с Верзилин А. В. Д. В. Иванов, Ю. В. Трунов // Использование биотехнол. методов для решения генет. -селекционных проблем. – Мичуринск, 1998. – С. 63-66. Harvey E., Grasham J.L. Procedures and media for obtaining tissue culture of 12 conifer species // Can. J. – 1969. – Bot. 47, N. 4. – Р. 547-549. https://findpatent.ru/patent/214/2141524.html https://articlekz.com/article/12636 |