зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий

• Название: Билет 1 1 характеристика агробактерий
• Дата: 13.05.2021
• Размер: 135.64 Kb.
• Имя файла: зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1.docx
• Тип: Документы; #204393
• страница: 1 из 9

Билет 1
1) характеристика агробактерий
Бактерии рода Agrobacterium, вызывающие заболевания растений из класса Двудольные.

Фитопатогены:

- Agrobacterium tumefaciens – корончатый галл (утолщение стебля в районе корневой шейки);

- Agrobacterium rhizogenes – бородатый корень (утолщение главного корня стержневой системы и образование на нем множества недоразвитых боковых корней);

- Agrobacterium rubi – стеблевой галл (утолщения на боковых побегах).

Сапротроф:

- Agrobacterium radiobacter.

Граммотрицательные бактерии, впервые выделенные в самостоятельный род Конном в 1942 году. Бактерии всех четырех видов морфологически сходны и представляют собой грамотрицательные палочки 1-3 мкм длиной и 0,6-1 мкм шириной, имеют 2-6 жгутиков, расположенных перетрихиально. Аэробы, могут образовывать небольшую капсулу. Местом обитания для патогенных видов являются индуцируемые ими галлы на растениях класса Двудольные, но при отсутствии растения-хозяина эти бактерии способны сохранять жизнеспособность на растительных остатках в почве в течение нескольких лет. Большинство штаммов прототрофны, хорошо культивируются на минимальных питательных средах с сахарами в качестве источника углерода, но для некоторых природных штаммов факторами роста являются витамины, в частности пантотеновая и никотиновая кислоты.

Отличительной чертой являются: 1)отсутствие выраженной хозяйской специфичности. 2)отсутствие у них факторов патогенности повреждающего действия. Эти бактерии не выделяют в окружающую среду пекто- и целлюлолитические ферменты, способные эффективно разрушать клеточные стенки растительных клеток. 3)Входными воротами могут служить только травматические повреждения растительных тканей.
2) Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC) Saccharomyces cerevisiae
Используется для вставок больших фрагментов (более 100 т.п.н.) ДНК. Они широко применяются для физического картирования ДНК высших эукариот, включая человека. В упрощенном виде плазмида для получения искусственных дрожжевых хромосом (pYAC) представляет собой: 1) фрагмент pBR322 (Ampr, oriE); последовательность, обеспечивающую автономную репликацию линейных молекул в клетках дрожжей (ARS); 2) последовательность, соответствующую центромерной области дрожжевой хромосомы (CEN); 3) гены биосинтеза аминокислот и азотистых оснований в дрожжевых клетках (TRP1 и URA3); 4) две теломерные области дрожжевой хромосомы (Т); 5) уникальный сайт рестрикции (например, для SmaI) и 2) два тоже уникальных (сайта рестрикции для другой рестриктазы, (BamHI-сайты).

ДНК такой плазмиды, выделенная из E.coli, подвергается обработке двумя рестриктазами и щелочной фосфатазой (последнее необходимо, чтобы не образовывались вновь кольцевые молекулы – щелочная фосфатаза отщепляет фосфатные группы с 5’-концов, а без них ДНК-лигаза не соединяет молекулы). ДНК организма, последовательности которого хотят клонировать в дрожжах, обрабатывают рестриктазой, для которой в pYAC имелся только один уникальный сайт, и смешивают с фрагментами плазмиды. В результате лигирования получаются линейные молекулы с теломерными последовательностями по концам, которые после введения в клетки дрожжей, дефектных по тем генам синтеза аминокислот и оснований, которые имеются в плазмиде, поддерживаются как автономные хромосомы.

Для подтверждения наличия вставки часто используют какой-либо маркерный ген, продукт которого дает цветную реакцию. В этом случае такой ген располагается так, чтобы вставка по уникальному сайту нарушала его рамку считывания, и на специальной среде отбираются неокрашенные колонии.
Билет 2
1Виргены
Расположенные в консервативной области D гены определяют способность бактериальных клеток вступать в контакт с растительными клетками и обеспечивать передачу Т-ДНК из бактериальной клетки в растительную.

Обязательными для инфицирования растения являются продукты 21 vir-гена. Эти гены образуют несколько опиронов, активирующихся при контакте с раневой поверхностью растения. Совокупность этих генов рассматривают как регулон. Активность генов vir-регулона регулируется двухкомпонентной сенсорной системой.VirA является сенсорный белком двухкомпонентной системы.

Состоит из двух одинаковых субъединиц. Начиная от NH2-конца, в каждой субъединице имеется цитоплазматический домен, затем короткий трансмембранный участок, периплазматический домен, второй трансмембранный участок и далее три расположенных в цитоплазме домена: линкерный домен, киназный домен и ресиверный домен. В пределах киназного домена в положении 474 имеется остаток гистидина, который фосфорилируется при взаимодействии с молекулами АТФ.Ресиверный домен в отсутствии индукторов закрывает эту часть киназного домена, но при их наличии она становится доступной для белка VirG. Фосфорилированный VirG-белок активирует транскрипцию пяти vir-оперонов – virВ, virС, virD, virE, virH и трех vir-генов – virА, virG и virF.
VirB1 Расщепление пептидогликана на первом этапе формирования аппарата системы секреции типа IV

VirB2Структурный белок Т-пилюса

VirB3 способствующий сборке Т-пилюса

VirB4Участие в сборке аппарата системы секреции типа IV

VirB5Определяет закрепление Т-пилюса в наружной мембране

VirB6Участие в сборке аппарата системы секреции типа IV и транспорте субстратов

VirB7Липопротеин, связывающийся с наружной мембраной, определяет локализацию Т-пилюса

VirB8Определяет локализацию входа в канал во внутренней мембране

VirB9Формирует стенки секреторного канала на его периплазматическом участке

VirB10Стабилизирует совместно с белком VirВ8 соединение белка VirВ11с периплазматической частью секреторного канала

VirB11Формирует входные ворота секреторного канала во внутренней мембране, обладает АТФ-азной активностью

VirС1Способствует прикреплению белка VirD2 к Т-ДНК

VirС2Способствует перемещению Т-комплекса в растительную клетку

VirD1Действует совместно с белком VirD2 при формировании Т-комплекса

VirD2Эндонуклеаза, никирование и связывание с 5’концом одной нити Т-ДНК; доставка Т-комплекса в ядро растительной клетки

VirD4Ориентирование Т-комплекса для вхождения в канал системы секреции типа IV

VirE2Связывание с однонитевой ДНК Т-комплекса в цитоплазме растительной клетки, доставка Т-комплекса в ядро растительной клетки

VirЕ3Шаперон для транспорта белка VirЕ2 в растительную клетку, связывание с общим транскрипционным фактором растительных клеток

VirFПодготовка находящегося в ядре растительной клетки Т-комплекса для интеграции в хромосомную ДНК

VirGРегулятор транскрипции vir-оперонов из двухкомпонентной сенсорной системы VirА/ VirG

VirH1Цитохром Р450-содержащая монооксигеназа

VirН2цитохром Р450-содержащая монооксигеназа, деметилирующая фенольные индукторы vir-регулона

VirJАналог продукта хромосомного гена acvB
2.Бакмиды принцип конструирования и использования
включение чужеродного фрагмента в ДНК бакуловируса осуществлялось в клетках насекомого, что затрудняло контроль за этим процессом. Поэтому была разработана система, обеспечивающая осуществление всех рекомбинационных событий в клетках E.coli. Для этого была создана специальная конструкция, включающая: 1) 5’-конец гена полиэдрина; 2) ген LacZ E.coli, 3) ген устойчивости к канамицину; 4) oriV для клеток E.coli; 5) 3’-конец гена полиэдрина.

В клетках насекомого было осуществлено образование рекомбинантной ДНК, включающей такую конструкцию и весь геном бакуловируса AcMNPV и затем, после выделения такой ДНК и трансформации клеток E.coli, получена так называемая бакмида.

Для вставки в состав бакмиды гена для экспрессии используется две вспомогательных плазмиды. Первая, несущая ген устойчивости к ампициллину, имеет в своем составе: 1) правый фрагмент последовательности(attR); 2) ген устойчивости к гентамицину (Gmr); 3) промотор гена полиэдрина (p); 4) полилинкер; 5) сайт терминации-полиаденилирования гена полиэдрина (t); 6) левый фрагмент последовательност (attL). Вторая плазмида, несущая ген устойчивости к тетрациклину, имеет в своем составе гены, продукты которых обеспечивают транспозицию.

Для получения пригодной для экспрессии в клетках насекомого нужного гена конструкции этот ген вставляют по уникальному сайту рестрикции полилинкера несущей ген ампициллинрезистентности плазмиды. Затем ДНК такой «нагруженной» плазмиды смешивают с ДНК плазмиды, несущей ген тетрациклинрезистентности и гены транспозиции, и этой смесью трансформируют штамм E.coli, в клетках которого находится бакмида. Высев после трансформации на среду с канамицином, гентамицином позволяет отобрать клоны с «нагруженной нужным геном» бакмидой. Из-за разрыва последовательности гена lacZ сформированные такими клонами колонии имеют белую окраску. Клетки таких клонов проверяются на ампициллин- и тетрациклин устойчивость и для дальнейшей работы оставляются чувствительные к этим антибиотикам, но устойчивые к гентамицину варианты. После размножения таких клонов в присутствии канамицина и гентамицина из их клеток выделяют ДНК, которой и трансфецируют клетки насекомого. В последних транскрипции подвергается только та часть чужеродного фрагмента, которая включает вводимый для экспрессии ген.

Билет 3
3.1Молекулярные механизмы, обеспечивающие введение Т-ДНК в растительную клетку.
Перенос Т-ДНК в растительную клетку осуществляется продуктами плазмидных vir-генов. Для формирования канала, пронизывающего оболочку бактериальной клетки, и так называемого Т-пилюса, продлевающего этот канал непосредственно до цитоплазмы растительной клетки, необходимы VirВ-белки.

Сначала с помощью белка VirВ8 белок VirВ1выводится через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство и начинает перестройку пептидогликанового слоя в данном месте. Затем белки VirВ4, VirВ10 и VirВ11 встраиваются во внутреннюю мембрану рядом с белком VirВ8, что способствует выходу в периплазму гетеродимера из белков VirВ7-VirВ9 и дальнейшему расщеплению пептидогликана.От белка VirВ1 отщепляется фрагмент VirВ1*, который закрепляется в наружной мембране, определяя место формированияТ-пилюса. Гетеродимеры VirВ7-VirВ9, благодаря наличию в белке VirВ7 липидного компонента, закрепляются в наружной мембране таким образом, чтобы белок VirВ9 был направлен в периплазматическое пространство. Белки VirВ3 и VirВ5 также связываются с наружной мембраной в месте закрепления VirВ7 и создают условия для сборки циклических олигомеров из белка VirВ2 и формирования из них Т-пилюса. Во внутреннюю мембрану дополнительно встраиваются VirВ6 и VirD4, а новые молекулы VirВ9 связываются между собой и с молекулами VirВ11 так, чтобы образовался сплошной канал, соединяющий внутреннюю и наружную мембраны. Продолжением этого канала является полый Т-пилюс, пронзающий в конечном итоге цитоплазматическую мембрану растительной клетки. Тем самым формируется путь, соединяющий цитоплазмы двух клеток и позволяющий в один этап транслоцировать из бактериальной клетки в растительную субстраты системы секреции типа IV (T4SS) - белки и нуклеопротеины.

VirВ4, VirВ11 и VirD4 могут потенциально снабжать энергией процесс сборки секреции и сам процесс секреции.

Параллельно в клетках осуществляется процессинг Т-ДНК. Суть: формирование Т-комплекса. С Т-ДНК Тi-плазмид взаимодействуют белки VirС1, VirD1(нужны для прикрепления VirD2 к концевым повторам Т-ДНК) и VirD2(основной).

Эндонуклеаза VirD2 делает надрез одной нити ДНК и начинается остоединение этой нити от комплементарной ей в направлении левого концевого повтора. Одновременно заполняются образующейся в Т-ДНК бреши новыми нуклеотидами. Отделившейся нить с VirD2-белком на 5’-конце представляет собой Т-комплекс,который направляется к секреторному каналу системы секреции типа 4.

Из-за VirD4 Т-комплекс поступает в канал системы екреции типа 4 и транспортируется в цитоплазму растительной клетки. Так же переносятся белки VirE2,VirE3,VirF.

VirЕ3-считается вспомогательным белком. Молекулы VirЕ2 присоединяются к Т-комплексу по всей длине,защищаяоднонитевую ДНК от расщепления растительными эндонуклеазами и совместно с VirD2 определяют транспорт Т-комплекса в ядро. Далее VirЕ2 связывается с двумя растительными белками VIP1 и VIP2. Эти белки определяют перемещение Т-комплекса из цитоплазмы в нуклеоплазму. Далее VirD2 и VirЕ2 участвуют в процессе интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения.
3.2 Микроинъекции в клетках животных
К физическим методам следует отнести и метод микроинъекций. Он успешно применяется для доставки чужеродной генетической информации в клетки животных и заключается в непосредственном введении растворов ДНК в клетку или ее ядро с помощью полых стеклянных микроигл. Процесс введения микроиглы в зафиксированную на твердой поверхности отдельную клетку осуществляется под визуальным контролем на специальном микроскопе, оборудованном микроманипулятором. После проникновения кончика иглы в объект с помощью специальной гидравлической системы через иглу подается от 1 до 5 пиколитров раствора ДНК с концентрацией от 0,1 до 1,0 мкг/мл.

Применение этого метода для генно-инженерных манипуляциий с растениями сдерживалось отсутствием методик закрепления растительных клеток или их протопластов на поверхности стекла. С разработкой методик иммобилизации с помощью тонких пленок поли-L-лизина или слоя легкоплавкой агарозы микроинъекции стали применимы в генетической инженерии растений, но не получают широкого распространения из-за сложности используемого оборудования и трудоемкости. Важной является и квалификация оператора, непосредственно осуществляющего микроинъекции, поскольку от точности введения и удаления иглы существенно зависит выживаемость клеток.
Билет 4
1) векторы вируса простого герпеса.
Геном состоит из двунитевой ДНК длиной 152 т.п.н. и у него хорошо выраженна нейронотропность. Он размножается в нервных клетках человека, куда проникает за счет слияния вириона с поверхностью тела нейрона, Он относится к латентным вирусам.

Введение ДНК непосредственно в геном вируса затрудняется его существенными размерами. Поэтому создана специальная, система, состоящая из двух компонентов. Первый компонент – это плазмиды E.coli, несущая два участка из генома HSV: последовательность, необходимую для упаковки вирусной ДНК в капсид, и точку начала репликации ДНК вируса. Между этими участками располагается полилинкер, по которому и встраивается в выбранный для введения в клетки млекопитающих ген. Второй компонент – вирус простого герпеса, из генома которого удалены последовательности, обеспечивающие инициацию репликации и упаковку вирусной ДНК в капсид.

Для получения несущих нужный чужеродный ген вирусных частиц этим вирусом инфицируют клетки, а затем трансфецируют их ДНК плазмиды с нужным геном. За счет кодируемых генами вируса белков начинается репликация ДНК плазмиды, происходит по модели «катящегося кольца»: в точки инициации репликации происходит однонитевой разрыв и к 3’-концу присоединяются новые нуклеотиды, тогда как вторая нить остается ковалентно замкнутой матрицей. Отходящая новая нить становится матрицей для построения второй нити. По достижении растущей двунитевой ДНК нужного размера (до размера вирусного генома) происходит отрезание фрагмента, а процесс продолжается дальше. Параллельно идет наработка белков вирусного капсида и отрезанные фрагменты упаковываются. Таким образом чужеродный ген не только попадает в вирусные частицы, но и амплифицируется: поскольку длина плазмидной ДНК примерно в 10 раз меньше длины нормальной ДНК HSV, в каждой вирусной частице оказывается 10 копий вводимого гена. Поэтому такие плазмиды назвали ампликон-плазмидами.

Если это система по тем или иным причинам недоступна (нет возможности купить вирус-помощник) возможно получение вектора с нужным для перенесения геном на основе рекомбинации. В этом случае используется плазмида, в которой вводимый ген находится между двумя последовательностями из так называемой незначащей области вирусного генома (удаление одного из участков генома HSV длиной 30 т.п.н. не приводит к нарушению его репродукции и упаковки). Гомологичная рекомбинация при совместном введении ДНК такой плазмиды и ДНК HSV дикого типа в культивируемые клетки может привести к включению содержащего чужеродный ген фрагмента в геном вируса. Далее нужно отобрать рекомбинантный вариант вируса. Это делают путем проверки вирусов из каждой отдельной бляшки на наличие нужной вставки либо гибридизацией по Саузерну, либо с помощью ПЦР. Это более трудоемкий путь и при этом вирус несет только одну копию вводимого гена, а также необходимо гарантировано очищать культуру рекомбинантного вируса от вируса дикого типа, поскольку тот патогенен. Предпочтительнее первый вариант.
2) Ti-плазмиды нопалинового типа
Обеспечивают образование гладких опухолей (реже – тератом), в которых обнаруживаются опины нопалинового снмейства (производные аминокислот и альфа-кетоглютарата), а также агроцинопины А и В.

Функциональный состав Т-ДНК Ti-плазмид: в них всегда имеются две группы генов – гены опухолеобразования и гены синтеза опинов.

Во всех Ti-плазмид обязательным является участок, обеспечивающий репликацию плазмиды (точка ori или oriV).а так жде в плазмиде находятся гены tra-оперона. Гены этого оперона кодируют белки, определяющие способность агробактериальной клетки передавать копии плазмидной ДНК другим бактериальным клеткам при конъюгации.есть участок ape , от наличия которого зависит устойчивость бактериальных клеток к бактериофагу Ар1
Не знаю что еще,может про ти плазмиды вообще..
Билет 5
1) характеристика ti плазмид октопинового типа
Т-ДНК имеет концевые прямымые повторы длиной 25 пар нуклеотидов, между которыми располагаются гены, не способные транскрибироваться в прокариотической клетке. Отличительной чертой октопиновых плпзмид Т-ДНК является наличие внутри Т-ДНК еще двух таких же повторов, что приводит к разделению Т-ДНК на ТL-ДНК (левая Т-ДНК) и ТR-ДНК (правая Т-ДНК). Может переноситься и интегрироваться в растительный геном и как единая последовательность и как два отдельных фрагмента.

В левой части Т-ДНК Ti-плазмид находятся гены, определяющие способность опухолевых клеток к интенсивному делению. В плазмидах октопинового типа это два гена iaaM и iaaH, продукты которых катализируют превращение триптофана сначала в индолацетамид, а затем в индолилуксусную кислоту . Кодируемый геном ipt белок соединяет изопентинилфосфат и аденозинмонофосфат (АМФ) и далее изопентиладенозинмонофосфат под воздействием растительных ферментов превращается в цитокинин зеатин. Вспомогательную роль в опухолеобразовании играют ген 5(образование индол-3-лактата, регулятор деления опухолевых клеток) и ген 6b (повышает чувствительность раст.кл. к гормонам роста).

В конце левой части октопиновых плазмид расположены два Гена(Ген ocs кодирует октопинсинтазу и ген ons, продукт которого обеспечивает выделение синтезируемых опинов из опухолевых клеток в межклеточное пространство). Остальные гены синтеза опинов mas1, mas2 и ags - расположены в правой Т-ДНК октопиновых плазмид. Геном mas2 фермент катализирует реакции конденсации глютамина с глюкозой, а затем продукт гена mas1 доводит полученные соединения до маннопин. Ген ags кодирует фермент, превращающий маннопин в агропин. И маннопин, и агропин могут самопроизвольно превращаться в агропиновую кислоту, таким образом в опухолях, вызванных агробактериями с плазмидами октопинового типа можно обнаруживать восемь опинов – четыре из октопинового сесмейства и четыре из агропинового (маннитилового) семейства.

Во всех Ti-плазмид обязательным является участок, обеспечивающий репликацию плазмиды (точка ori или oriV).а так же в плазмиде находятся гены tra-оперона. Гены этого оперона кодируют белки, определяющие способность агробактериальной клетки передавать копии плазмидной ДНК другим бактериальным клеткам при конъюгации.есть участок ape , от наличия которого зависит устойчивость бактериальных клеток к бактериофагу Ар1.