зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий
 Скачать 135.64 Kb.
|
|
2) характеристика дрожжей как объекта ген инж Дрожжевые грибы являются одноклеточными существами, которые сравнимы с бактериями по простоте технологических приемов их культивирования, но в то же время являются эукариотическими организмами. Их клетки способны модифицировать белковые молекулы после их синтеза на рибосомах, что не характерно для бактериальных клеток. Посттрансляционные изменения белков в эукариотических клетках заключаются: 1) в отщеплении фрагмента полипетидной цепи от первоначально синтезируемого белка-предшественника, без чего некоторые молекулы не могут приобрести свойственную функционально активному белку конформацию; 2) в катализируемом дисульфидизомеразами образовании ковалентных связей на стадиях формирования третичной, а для некоторых белков и четвертичной структуры; 3) в специфическом гликозилировании путем присоединения углевода к остаткам серина или треонина (О-гликозилирование), или к остатку аспарагина (N-гликозилирование); 4) в присоединении к различным остаткам аминокислот других дополнительных молекул, здесь возможно фосфорилирование, сульфатирование, карбоксилирование, ацилирование, ацетилирование, миристилирование и пальмитоилирование. Некоторые из ферментных систем дрожжей достаточно сходны с таковыми животных, это дает преимущества дрожжевых клеток перед бактериальными в технологиях микробного производства белков высших организмов. Дрожжи при определенных условиях могут эффективно воспринимают экзогенные молекулы ДНК, несмотря на наличие ригидной клеточной стенки. В настоящее время разработаны методы получения и регенерации дрожжевых протопластов, их трансформация похожа на стандартные методы трансформации бактерий. Возможно введение ДНК в дрожжевые клетки при использовании ацетата лития, также применяется электропарация. Самыми изученными являются пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Билет 6 1.Афинные метки. Одной из проблем при работе с клетками животных как системами для продукции чужеродных белков является выделение гетерологичного белка в чистом виде. На модели культур клеток насекомых и были отработаны подходы для улучшения очистки таких белков. Для этого использовались кодирующие короткие специфические аминокислотные последовальности фрагменты ДНК, являющиеся основой для аффинного связывания при хроматографии на колонках. Один из вариантов – это применение фрагмента, кодирующего гексагистидин (обозначается His 6 ). Эта последовательность помещается сразу же за промотором, вплотную к ней располагается так называемый спейсерный участок, кодирующий 7-10 любых аминокислот, и далее следует последовательность, кодирующая шесть аминокислот, распознаваемых специфической протеазой. Имеющий такую «надстройку» продуцируемый клетками насекомых гетерологичный белок при пропускании белковой фракции гомогената клеток через колонку с никель-агарозой задерживается на сорбенте. Элюцию белка осуществляют промыванием колонки раствором имидазола - вытесняет гексагистидин из сайтов связывания на агарозе. Полученный чистый белок обрабатывают протеазой, отщепляющей афинную метку. Если аффинная метка не вляет на функцию белка, то обработку протеазой можно не делать. Это схему используют для выделения гетерологического белка из любых трансгенных кл. Афинными метками являются : последовательности, связывающиеся с глутатионом; последовательности из мальтозосвязывающего белка или последовательности, дающие эпитопы, узнаваемые паратопами конкретных моноклональных антител. В зависимости от используемой метки подбирается сорбент в колонках и используемые для элюции растворы. 2.Получение трансгенных растений устойчивых к бактериальным и грибным заболеваниям. Устойчивость к фитопатогенным грибам пытаются создавать на основе повышения уровня экспрессии некоторых белков растений. Установлено, что при контакте с патогенами растения способны либо повышать уровень синтеза определенных белков, либо экспрессировать белки, отсутствующие в тканях растения до контакта с патогеном. Такие белки принято называть PR-белками (pathogenesis-releated proteins). Гены хитиназ и глюканаз эффективно действуют на клеточную стенку грибов. Клонирован из разных растений. И их объединяют или с последовательностями конститутивных (р35S РНК CаMV) или индуцируемых промоторов (светоиндуцрующий промотор из генов системы фотосинтеза). Экспрессируются только в зеленых частях растения. Бактериальные поражения. Ведутся пока только подготовительные исследования. Некоторые ученые считают,что ингибиторы протеаз могут противодействовать бактериям из-за того что часть ферментов пектолитического комплекса приобретают активность после воздействия сектетируемых спец. для этого протеаз. Делались различне эксперементы. Пыталиь создать растение,которое бы продуцировало антибактериальные вещества,действующие на сами клетки бактерий, а не на фактор патогенности. Например: в кортофель ввели ген лизоцима бактериофага т4 под промотором 35S рнк CaMV. Для секретирования белка в межклеточное пространство последовательности гена лизоцима присоединили послед. сигнального пептида их гена ячменя.( снижение повреждаемости тканей возбудителями мягкой гнили из рода Pectobacterium.) Сейчас также получают модельные растения табака,которые устйчивы и к грибным и к бактериальным поражениям. В пластидный геном ввели искусственно синтезированную последовательность, которая кодирует пептид msi-99. За счет встраивания в хлоропластный геном количество пептида msi-99 до 43%от общего белка клеток листьев. Билет 7 1) Получение растений с изменениями окраски лепестков У многих покрытосеменных растений окраска венчика обусловлена синтезомспецифических пигментов – антоцианинов, относящихся классу флавоноидов и синтезируемых из фенилаланина. Общим предшественником для таких пигментов является тетрагидроксихалкон являющимся веществом желтого цвета. тетрагидроксихалкон + халконизомеразы = нарингенин, нарингенин по д воздействием флаванон-3-гидроксилазы в дигидрокемпферол (окраска исчезает). Но зато дигидрокемпферол может превращаться в клетках различных растений либо в вещества синего цвета- производными дельфинидина, либо в вещества красного цвета – производные цианидина. У петунии превращение в цианидин- 3-глюкозид происходит под воздействием флаваноид-3’-гидроксилазы, дающей бесцветный дигидрокверцитин, который уже под воздействием дигидрофлаванол-4- редуктазы превращается в конечный красный продукт. Образование синего дельфинидин- 3-гликозида идет путем катализируемого флаваноид-3’,5’-гидроксилазой превращения в бесцветный дигидромирицетин, на который уже действует все та же дигидрофлаванол-4- редуктаза. Так же были получены чисто белые, нежно-розовые или нежно-голубые варианты хризантем, гвоздик и тюльпанов. Для этого в геном растений вводили кДНК матричных РНК халконсинтазы под конститутивно действующим промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. В обоих случаях подавлялась продукция фермента, что и приводило к формированию белоокрашенных лепестков. В 2009 году реализовался совместный японско-австралийский проект по созданию роз с лепестками бледно-фиолетовго цвета, В геном розы был внедрен один из генов фиалки трехцветной Viola tricolor. Разрабатываются растения, листовые пластинки которых испускают свет в вечернее время. Возможность их получения показана на модельных растения табака. Для придания признака автолюминисценции в ДНК пластид табака был введен lux-оперон морской бактерии Photobacterium leiognathi, поставленный под классический промотор для экспрессии в пластидном геноме P rrn . Все шесть генов этого оперона успешно функционировали в генетической системе хлоропластов, что и определило накопление в пластидах светящегося белка. 2) получение секретируемых белков с помощью дрожжей В клетках дрожжей гликозилированию и ряду других посттрансляционных изменений подвергаются только секретируемые белки, т.е. если белок проявляет свою активность только в гликозилированой форме, то его обязательно нужно сделать секретируемым. Наиболее часто используется пре-про-α-фактор –лидерная (сигнальная) последовательность белка α 1 , одного из белков, обеспечивающих спаривание дрожжей при половом размножении (фактор спаривания). Последовательность чужеродного белка объединяют с пре-про-α-фактором и затем такую конструкцию ставят под какой-либо дрожжевой промотор. Лидерная последовательность во время секреции отрезается конкретной эндопептидазой, которая которая действ на конкретное сочетание остатков на лизин и аргинин. Поэтому этикодирующие эти 2 АК кодоны должны находиться перед началом последовательности чужеродного белка. На эффективность секреции белков дрожжевыми клетками действуют дисульфидизомеразы, от которых зависит создание правильной третичной структуры секретируемого белка. Когда дисульфидизомеразный ген Saccharоmyces cerevisiae поставили под более мощный и, главное, конститутивно действующий промотор гена дрожжевой глицеральдегидфосфатизомеразы, уровень продукции фермента повысился в 16 раз, а количество секретируемого чужеродного для дрожжей фактора роста тромбоцитов В человека повысилось в 10 раз. Но сверхпродукция дисульфидизомеразы повышает уровень секреции белков с большим количеством дисульфидных связей в третичной структуре. На начало 21-го века с помощью дрожжей производили используемые в качестве медицинских препаратов эпидермальный фактор роста человека, человеческий инсулин, проинсулин, инсулиноподобный фактор роста, тромбоцитарный фактор роста, фактор роста фибробластов и др. Билет 8 1) невирусные методы введения ген.информации к клетки млекопитающих Невирусными системами доставки генов: - бомбардировка определенных тканей через разрез микрочастицами золота..С помощью специальных приборов покрытые ДНК частицы разгоняют до скорости 300 – 600 м/с и направляют поток таких частиц на изолированные клетки млекопитающих. Для создания потока летящих с указанной скоростью частиц используют газы, или гелий. Частицы пробивают клеточную стенку и мембраны животной клетки. При этом их скорость и размеры таковы, что клетки практически не повреждаются. Доставленная в клетки ДНК частично переходит в свободное состояние и может взаимодействовать с молекулами ДНК в ядре, митохондриях. - использование липосом – Липосомами называют везикулы, которые можно получить суспендируя в растворе фосфолипидные молекулы по особой методике. Если в таком растворе присутствуют молекулы ДНК или РНК, они оказываются внутри везикул. Комплексы из положительно заряженных липидов и отрицательно заряженных ДНК, предлагаемые для этих целей, называются липоплексы, входят они в клетку хорошо, но в клетке из-за слияния с ними лизосом большая часть ДНК в них разрушается; - использование ДНК-конъюгатов – ДНК смешивают с поли-L-лизином, к которому ковалентно пришито много молекул. Поли-L-лизин образует вокруг ДНК оболочку, и такая структура после введения в организм взаимодействует с рецептором. Далее этот комплекс поглощается путем эндоцитоза, и поэтому образовавшаяся эндосома не сливается с лизосомами, а находящаяся в ней ДНК не повреждается; - простое введение суспензии молекул ДНК в мышцу с помощью шприца. Частота трансфекции значительно ниже, чем при использовании вирусных систем. Но они снимают одно из ограничений - емкость вектора. Трудноти процессов генной иженерии животных. 1) Более сложное взаимодействие генов и их продуктов при реализации генетической информации. Предсказать изменения сложнее. 2) Невозможность использовать регенеративные свойства для восстановления целостного организма из одной клетки. 3) Отсутствие у высших животных бесполого размножения, которое можно было бы использовать для поддержания линии генетически модифицированных организмов. 4) Абсолютная раздельнополость высших животных, что не позволяет использовать самооплодотворение. 5) Невозможность осуществления полного развития организма высших млекопитающих из зиготы в искусственных условиях (вне материнского организма). 2) вирусы растений для создания векторных систем Наиболее пригодными яаляется Caulimoviridae - каулимовирусы.(их генома, представляет собой двунитевую ДНК до 8300 п.н.). Их ДНК имеет вид кольцевой ковалентко замкнутой суперскрученной молекулы. Эта ДНК транскрипционно активна и основными транскриптами являются 35S и 19S РНК. 35S РНК соответствует по длине всему геному вируса и служит матрицей для синтеза ДНК, которая может упаковываться в вирусные капсиды. Наличие в геноме вирусов гена обратной транскриптазы и этапа обратной транскрипции в жизненном цикле сближает каулимовирусы с ретровирусами животных, из-за чего их объединяют в супергруппу параретровирусов. Сейчас известно более десятка каулимовирусов. Наиболее изученным вирус мозаики цветной капусты. Успешными примерами экспрессии чужеродных для растений генов с вирусных векторов на основе каулимовирусов были: - бактериальный ген дигидрофолатредуктазы =>(введенный в) турнепс; - ген человеческого α-интерферона. - ген неомицинфосфотрансферазы I (бактериальный транспозон Tn 903) => табак; - гена хлорамфениколацетилтрансферазы (бактериальный транспозон Tn 9) => табак; - ген металлотионеина млекопитающих; С помощью таких векторов можно вводить в растения только небольшие фрагменты (не более 300 п.н.), и что полученные путем вирусной трансформации растения не способны передавать приобретенный признак в рядах поколений. Можно прочитать еще про вирус мозаики цветной капусты..минимально..это билет 9, 1 вопрос. Билет 9 1) Генет.инженерия вируса мозаики цветной капусты Наиболее изученным вирусом является вирус мозаики цветной капусты.В вирусных частицах ДНК CaMV представляет собой кольцевую, но не ковалентно замкнутую молекулу. В ее составе имеются 7 открытых рамок считывания. Рамка I несет информацию о белке, обеспечивающем перенос вирусных частиц по плазмадесмам из одной растительной клетки в другую, то есть системное распространение по растению. Рамки II и III кодируют протеины Р2 и Р3, которые отвечают за перенос вирионов тлями от растения к растению и называются факторами трансмиссии. Рамка IV соответствует предшественнику капсидных белков, рамка V – предшественнику протеиназы, обратной транскриптазы и РНКазы Н, которые нужны для построения ДНК на матрице 35S РНК. Рамка VI кодирует белок телец включения, которые появляются в цитоплазме инфицированной растительной клетки и служат местом синтеза геномной ДНК и сборки вирусных частиц. Для белка, кодируемого рамкой VII функции не известна.С точки зрения генетической инженерии особый интерес представляют две межгеномные области , в которых находятся промоторы 19S РНК и 35S РНК. Именно в эти области осуществляли вставки фрагментов ДНК с целью оценки возможностей использования каулимовирусов как векторных молекул для генетической трансформации растений. Помимо межгеномных областей пригодными для инсерций генетического материала без последующего нарушения цикла репродукции вируса являются рамки считывания II и III. 2) Получение и применение трансгенных овец Нужно для использования их молока для получения медицинских препаратов, поскольку генетические конструкции для экспрессии генов человека в клетках молочной железы этих животных получены и апробированы. В гибридных ДНК используются промоторы гена бетта-лактоглобулина, гена бетта-казеина и гена альфа S1-казеина, а среди клонированных генов человека – ген активатора плазминогена, ген альфа-антитрипсина (при отсутствии этого белка развивается эмфизема, дефицит ингибитора сывороточных протеаз, поражение легких, цирроз печени), ген фактора IX системы свертывания крови (белок нужен для лечения гемофилии В), ген лактоферрина, ген интерлейкина-2. Из трансгенного мелкого рогатого скота упоминают только овец с повышенной скоростью роста шерсти. Этот вариант был получен путем введения кДНК гена инсулиноподобного фактора роста 1 овцы под промотором гена кератина мыши. Билет 10 1. Получение и направление их использования трансгенных коз. ( вроде так) Нужно для использования их молока для получения медицинских препаратов, поскольку генетические конструкции для экспрессии генов человека в клетках молочной железы этих животных получены и апробированы. В гибридных ДНК используются промоторы гена бетта-лактоглобулина, гена бетта-казеина и гена альфа S1-казеина, а среди клонированных генов человека – ген активатора плазминогена, ген альфа-антитрипсина (при отсутствии этого белка развивается эмфизема, дефицит ингибитора сывороточных протеаз, поражение легких, цирроз печени), ген фактора IX системы свертывания крови (белок нужен для лечения гемофилии В), ген лактоферрина, ген интерлейкина-2. Из трансгенного мелкого рогатого скота упоминают только овец с повышенной скоростью роста шерсти. Этот вариант был получен путем введения кДНК гена инсулиноподобного фактора роста 1 овцы под промотором гена кератина мыши. 2. Методы введения генетической информации в растения с помощью агробактерий (трансформация изолированных растительных клеток, кокультивация, слияние бактериальных сферопластов и протопластов растительных клеток). Кокультивация - для получения трансгенных двудольных растений. Для исходного материала нужно иметь штамм агробактерии с векторной конструкцией. Вектор должен содержать последовательность гена, который нужно ввести в геном растения. В качестве эксплантов для трансформации берут стерильные листовые диски. Экспланты инокулируют жидкой средой. В этой среде находится агробактерия с векторной конструкцией. Происходит заражение клеток раневой поверхности экспланта и после 24-48 ч. культивирования происходит встраивание в растительный геном фрагмента т-ДНК с чужеродным геном. Затем экспланты переносят в стерильную воду и затем подсушивают на поверхности стерильной фильтровальной бумаги (удаление агробактерий). Далее экспланты переносят в жидкую каллусиндуцирующую среду с канамицином и антибиотиком, к которому чувствительны агробактерии (например, ампициллином), и культивируют. После отмывания экспланты переносят на агаризованную каллусиндуцирующую среду с обоими антибиотиками (канамицин + ампициллин) и продолжают культивирование до формирования хорошо выраженных каллусов. |