зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий
 Скачать 135.64 Kb.
|
|
Билет 15 1. получение трансгенных растений для парфюмерии, хим. и текстильной промышленности Используются растительные жиры. Основными масличными растениями являются соя, пальмы, рапс и подсолнечник. Большая часть масличных культур дает жиры со стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой кислот. Других жирных кислот – каприловой, каприновой, лауриновой,миристиновой и др.– образуется меньше. Смотря для чего нужно масло, то там будет преобладать конкретные ЖК : сорт с содержанием 40% стеариновой кислоты – для производства маргарина и шоколадного масла; 40% и 60% лауриновой кислоты – для производства детергентов косметического и технического применения; 80% олеиновой для производства пищевых продуктов, смазочных материалов и чернил; 40% миристиновой – для производства детергентов, мыла и средств для ухода за кожей; Создан сорт сои, у которого после введения дополнительной копии гена дельта-12 десатуразы той же самой сои уменьшилось количество линолевой и линоленовой кислот и увеличилось олеиновой кислоты. Такое масло считается более ценным. Делаются попытки получения растений продуцирующих основу для природно деградируемого пластика - полигидроксибутирата. Три гена, необходимые для синтеза полигидроксибутирата были клонированы из бактерий Alcaligenes eutrophus. Для этого всем трем генам были добавлены лидерные последовательности из гена малой субъединицы РБФК гороха, обеспечивающие транспорт синтезируемых в цитоплазме белков в хлоропласты, а качестве промотора был использован p35S RNA CaMV. Сообщалось также и получении трансгенных растений, у которых необходимые для синтеза полигидроксибутирата гены введены в пластидный геном. Начались работы по получению хлопковых растений, которые бы давали волокна, пригодные для производства не сильно мнущегося волокна. Для этих целей также используются гены синтеза полиоксибутирата и были сообщения, что волокно из трансгенных растений хлопка действительно содержит до 30% полимерной добавки. Плюсы таких растений: 1)для этих растений и продуктов из них получаемых легче будет получать разрешение на их применение в законодательных органах. 2) сельское хозяйство некоторых стран страдает от перепроизводства пищевых растений и приходится выплачивать огромные правительственные субсидии фермерам для предотвращения их банкротства. Переориентация фермерских хозяйств на производство технических растений может помочь решить эту проблему. 2. введение чужеродной днк с помощью бакуловирусов Последовательность нужного гена вводится в вектор в системе E.coli и здесь же нарабатывается ДНК для трансфекции (по отношению к клеткам животных введение любой ДНК называют трансфекцией, поскольку термин трансформация традиционно используется для обозначения злокачественныз изменений). Трансфекции подвергаются клетки насекомого, уже несущие AcMNPV, и если происходит двойной кроссинговер, то в ДНК вируса исходный ген полиэдрина заменяется чужеродным геном. Из-за отсутствия полиэдрина большинство образующихся вирионов инфекциозны и на газоне клеток насекомого образуются зоны лизиса. Из этих зон и выделяют рекомбинантный штамм вируса, которым потом снова инфицируют клетки и сам штамм сохраняют для дальнейшей работы. Поскольку зоны лизиса на монослое клеток не всегда хорошо различимы, были сделаны улучшенные конструкции, несущие маркерные гены, обеспечивающие образование окрашенного вещества при экспрессии в клетках насекомых. Причем экспрессию маркерного гена осуществляют с промоторов таких генов вируса, которые активны в течение всего периода репродукции вируса в клетке. Наиболее распространенный вариант маркерного гена – ген lacZ E.coli, при добавлении в среду культивирования клеток насекомого 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (XGal) зоны активной репродукции вируса окрашиваются в синий цвет. При использовании для экспрессии чужеродного гена промотора гена полиэдрина гетерологичный белок нарабатывается в культуре клеток через 4-5 суток. Билет 16 1.Перспективы и методы получения трансгенного крупнорогатого скота Для изучения механизмов болезней белков чаще всего используют коров. В молоке которых около 35 г/литр белка, а в год примерно 10 000 литров молока. Методика: Ооциты коров вымывают из яичников убитых на бойнях животных и in vitro создают им условия для созревания в яйцеклетки. Здесь же проводится их оплодотворение спермой быка, после чего клетки особым образом центрифугируют, чтобы уплотнить желток и сделать тем самым видимым мужской пронуклеус. Далее проводят микроинъекции необходимой генетической конструкции и переносят зиготы в условия, обеспечивающие развитие зиготы в эмбрион. Полученные in vitro эмбрионы вводят в матку коровы, находящейся на стадии течки и они без хирургического вмешательства имплантируются в стенку матки. На определенной стадии развития эмбриона в матке отбирают небольшое количество клеток и посредством ПЦР удостоверяются в присутствии в геноме плода последовательности трансгена. В медицинском аспекте нужно получение из молока необходимых для терапии тех или иных болезней человека белков, а в сельскохозяйственном – получение не содержащего лактозу молока путем экспрессии гена лактазы, получение молока обогащенного κ-казеином посредством гиперэкспрессии собственно коровьего гена (необходимо для производства сыров), получение животных, устойчивых к различным инфекционным заболеваниям. 2. Характеристика опухолей агробактерий. Морфология опухолей. Инфицирование растений представителями рода Agrobacterium приводит к развитию опухолеподобных образований. Известны три связанных с этими бактериями заболевания: корончатый галл, представляющий собой утолщение стебля в районе корневой шейки (Agrobacterium tumefaciens). Ученые получили чистую культуру присуствующих в опухоли бактерий и подтвердили их патогенность путем введения в здоровое растение. Из-за проявляемых симптом их назвали опухолеобразующими. бородатый корень. При развитии этого заболевания на сильно утолщенном главном корне стержневой корневой системы образуется множество укороченных недоразвитых боковых корней, что и послужило основанием для наименования болезни (Agrobacterium rhizogenes). стеблевые галлы - утолщения на боковых побегах пораженных растений (Agrobacterium rubi). Бактерии морфологически сходны и представляют собой грамотрицательные палочки 1-3 мкм длиной и 0,6-1 мкм шириной,2 – 6 жгутиков, расположенных перетрихиально. Аэробы, могут образовывать небольшую капсулу. Прототрофны, хорошо культивируются на минимальных питательных средах с сахарами в качестве источника углерода, но для некоторых природных штаммов факторами роста являются витамины, в частности пантотеновая и никотиновая кислоты. Отличительной чертой бактерий является отсутствие выраженной хозяйской специфичности. Поражают растения из класса двудольные. Однодольных не заражают, потому что: 1) на клетках нет сайт специфического прикрепления агробактерий; 2) у Однодольных не образуется ацетосирингон – один из главных индукторов агробактериальной трансформации. У этих бактерий также отсутствуют факторы патогенности повреждающего действия. Они не выделяют в окружающую среду пекто- и целлюлолитические ферменты, способные эффективно разрушать клеточные стенки растительных клеток. Входными воротами – только травматические повреждения растительных тканей. На основании морфологических признаков различают три основных варианта корончатого галла: - шероховатые опухоли (округлая форма опухоли и наличие на ее поверхности небольших по размерам утолщений, из которых развиваются укороченные придаточные корни; внутри – однородная масса паренхиматических клеток); - гладкие опухоли (на поверхности имеются небольшого размера выступы, напоминающие сильно утолщенные и укороченные листья; внутри – однородная масса паренхиматических клеток); - тератомы/уродства (поверхность, как правило, не отличается от поверхности исходного здорового стебля, но внутри них наблюдается неупорядоченное смешение тканей, формирующееся из недоразвитых побегов, корней или листьев). Билет 17 1. характеристика плазмид агробактерий. В ходе постороения физич карты выявлены 4 области гомологии А,В,С,Д. Области Ti- и Ri-плазмид консервативны. Наиболее консервативны области А и Д. Область Д- область вирулентности. Гены этой области отвечают за контакты бактериальной клетки и клетки растений и обеспечивают передачу Т-ДНК из бактериальной клетки в растительную. Эти гены называются виргенами или вирбелками. Виргены Ти-плазмид нопалинового и октопинового типа практически одинаковые и перенос Т-ДНК в растительные клетки осуществляется сходным образом. Для инфицирования растения обязательным являеются продукты 21 вир-гена. Эти гены образуют несколько опиронов,которые активируются при контакте с раневой поверхностью растения. Совокупность тих генов рассматривают как регулогн. Активность генов вир-регулонов регулируется двух компонентной сенсорной системой. Сенсорными белками являются ВирА и ВирG. ВирА представлен трансмемьранной гистидиновой киназой и состоит из двух одинаковых субъединиц. Начиная с NH2 конца в каждой субхединице есть: небольшой цитоплазматический домен,короткий трансмембранный участок, пееплазматический домен, второй трансмембранный участок, линкерный домен,киназный домен,ресиверный домен. Между киназынм и ресиверным есть остаток гистидина (фосфорилируется при взаимодействии вирА с АТФ). Ресиверный домен в отстутсвии индукторов закрывает часть киназного домена,но при их наличии она становится доступной для 2-ого компонента сенсорной системы-ВирG. ВирG фосфорилируется и активирует транскрипцию пяти вир-оперонов Вир B,C,D,E,H и трех вир-генов A,G,F. В них есть вир-боксы к которым и присоединяется вирG-белок. Индукторами фосфорилирования-фенольные соединения,моносахариды, низкие значения рН. Доменом белка ВирА является внитриклеточный линкерный домен. Моносахариды связываются с ChvE-белком,затем этот комплекс присоединяется к белку ВирА. В результате меняется конформация белка и линкерный домен ВирА-белка становится более пригодным для активации фенолами. Область В- для использования опинов в качестве пит веществ необходимо примерно 40 генов. Эти гены разделяют на: 1)распознавание токсинов в окружающей среде (их продукты действуют совместно с системой хемотаксиса агробактериальной клетки), 2)гены АВС-пермеаз (обеспечивают энергозависимое поглащение соответствующих опинов в агробактериальной клетке), 3)гены катаболизма соответствующих опинов. Суть катаболизации:превращение опинов в обычные сахара и аминокислоты. ПРИМЕР: продукты гены agaE переводят агролиновую кислотув маннополиновую кислоту, затем продукты генов F и G расщепляют маннополиновую кислоту доманнозы и глютаминовой кислоты. Область С. Точка ori(как правило находится в области В,но может быть и в области С) обеспечивает репликацию плазмиды. Так же в этой области есть гены tra-оперона. Их гены кодируют белки определяющие способность агробактериальной клетки передавать копии плазмидной ДНК другими бактеральными клетками при конъюгации. Есть участок ape- отвечает за устойчивость бактериальной клетки к бактериофагу Ap1. Для нопалиновых плазмид локус agr. От него зависит чувствительность к агроцину. Делятся плазмиды на: плазмиды октопинового типа. При инфицировании растений штаммами с плазмидами этой группы развиваются шероховатые опухоли, клетки которых продуцируют опины октопинового и агропинового семейств. нопалиновые плазмиды, обеспечивающие образование гладких опухолей (реже – тератом), в которых обнаруживаются опины нопалинового снмейства, а также агроцинопины А и В. агропиновые плазмиды, определяющие образование корончатых галлов с различной поверхностью, но без придаточных корней, в которых синтезируются опины агропинового семейства и агроцинопины D и С. Опухоли, вызванные штаммами с плазмидами этой группы, отличаются более выраженным отмиранием клеток в центральной части. 2.эписомные эксперессирующие векторы на основе 2 мкм плазмид Sacchromyces 2 мкм-плазмиды используются для введения в дрожжевые клетки стабильно наследуемой чужеродной генетической информации. Для того что бы проводить различные манипуляции по комбинированию последовательностей ДНК в клетках E.coli были получены стандартные дрожжевые вектора. Они включали в себя сайты начала репликации в прокариотических клетках (oriV из pBR322), сайт инициации репликации в клетках дрожжей и селективный маркер для отбора трансформированных дрожжевых клеток. В качестве такого маркера, служит ген биосинтеза аминокислоты (лейцина, гистидина, триптофана) или азотистого основания (урацила). Селективным маркером для поддержания вектора в бактериальных клетках является ген ампициллинрезистентности из pBR322. Вставка предназначенного для введения в дрожжевые клетки гена осуществляется по сайтам полилинкера pBR322. Такие векторы известны как эписомные экспрессирующие векторы. Но в промышленности в сконструированных таким образом штаммах при длительных и масштабных процессах клетки начинают терять плазмиду. Поэтому на основе эписомных векторов были сделаны интегрирующие векторы. Они обеспечивают встраивание вводимого фрагмента ДНК в ДНК дрожжевых хромосом. Отличие таких молекул заключается в том, что в их состав вводятся последовательности какого-либо известного хромосомного гена либо как единый фрагмент, либо в виде двух фрагментов, окаймляющих предназначенную для введения в геном последовательность. В качестве примеров таких векторов наиболее часто упоминают конструкции, разработанные для другого вида дрожжей - Pichia pastoris. Билет 18 1. векторы на основе аденоассоциированных вирусов Аденоассоциированные вирусы неспособны репродуцироваться в клетках человека. Не патогенны, их геном представлен одноцепочечной ДНК , которая становится двунитевой после попадания в ядро клетки-хозяина и сайт специфически встраивается в 19-ю хромосому. После интеграции происходит транскрипция, трансляция и формирование вирионов. Но главным условием является наличие в клетке аденовируса, белки которого и используются для правильной репродукции аденоассоциированного вируса. Концы ДНК генома аденоассоциированного вируса представляют собой инвертированые повторы длиной 125 нуклеотидов, в которых находятся сайты инициации репликации и инициации транскрипции. Если поместить между этими повторами какой-либо предназначенный для введения в клетки человека ген, эта конструкция будет воспроизводиться клеткой. Если емкость такого вектора большая, приходится использовать плазмиду-помощник. На этой плазмиде должны располагаться rep- и cap-гены аденоассоциированного вируса, поставленные под активный в клетках млекопитающих промотор, с которого происходит экспрессия обоих генов одновременно. Заканчивается этот блок из двух генов сайтом терминации-полиаденилирования. Для получения нагруженных нужной генетической информацией вирусных частиц зараженные аденовирусом клетки трансфецируют ДНК двух таких плазмид одновременно, в результате чего образуются вирусные частицы обоих вирусов, но вирионы аденоассоциированного вируса несут только предназначенный для введения в клетки млекопитающих ген. Эти вирионы отделяют от вирионов аденовируса центрифугированием и диализом. Очищенную таким образом суспензию аденоассоциированных вирусов дополнительно прогревают для инактивации не полностью удаленных частиц аденовируса, а затем используют для получения генетически измененных клеток. 2. биобаллистика как метод введения ДНК в клетки Биобаллистика – это бомбардировка микрочастицами. В качестве микрочастиц используют сферические частицы благородных металлов – золота или вольфрама. ДНК на частицах закрепляют путем обработки растворами нуклеиновой кислоты и CaCl2, или спермидина, или полиэтиленгликоля. С помощью специальных приборов покрытые ДНК частицы разгоняют и направляют поток таких частиц на изолированные клетки, фрагменты растения или целостное растение. Для создания потока летящих с указанной скоростью частиц используют либо газы либо сжатый воздух или гелий. Частицы пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их скорость и размеры таковы, что клетки практически не повреждаются. Доставленная в клетки ДНК частично переходит в свободное состояние и может взаимодействовать с молекулами ДНК в ядре, митохондриях или пластидах, то есть такой метод введения генов может быть использован не только для введения в пластидный геном. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения практически любых видов. Но при этом известно, что происходит она с невысокой частотой, а интеграция и экспрессия чужеродных генов может зависеть от вектора, используемого для их введения. Например, частота трансформации повышается, если используется линейная, а не кольцевая ДНК. |