зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий
 Скачать 135.64 Kb.
|
|
17. Нокаут гены Эмбриональные стволовые клетки используют, чтобы получить животных с дефектом по какому-либо конкретному гену. Это необходимо для изучения функции этого гена. Для проведения так называемого «нокаута гена» конструируют специальные последовательности , в которых должен быть селективный маркерный ген (smg),ген Neo, размещают внутри последовательности гена, предназначенного для «нокаута» с таким расчетом, чтобы протяженные участки гена справа и слева от маркера обеспечивали успешную рекомбинацию с геном дикого типа в клетках млекопитающих (обычно по одному или несколько экзонов, промоторную область и сайт терминации-полиаденилирования). 18. общемировые персективы расширения посевных площадей, занимаемых трансгенными растениями Лидером в выращивании генно-инженерных сортов по-прежнему являются США.. Основными трансгенными культурами являются соя, кукуруза, хлопок и рапс. В настоящее время трансгенные растения выращивают на всех континентах, кроме Антарктиды. В 2012 году в этой сфере хозяйства было занято 28 стран на площадях 170,3 миллиона гектаров, причем прирост по отношенитю к 2011 году составил 6% или 10,3 миллиона гектаров. Среди этих 28 стран 18 перешли в разряд мега-агробиотехнологических государств – так условно называют страны, перешедшие порог в 50 000 гектаров, занятых под трансгенными растениями. Стремительный рост площадей под трансгенными растениями уже сам по себе является ярким доказательством их преимуществ над обычными сортами. выращивание трансгенных растений дало: 1) прирост доходов от реализации сельхозпродукции в размере 98,2 миллиарда долларов США; 2) экономию 473 миллионов килограммов пестицидов, что существенно снизило нежелательное воздействие на окружающую среду; 3) только в 2011 году выброс СО2 в атмосферу из-за меньшего использования с/х техники был уменьшен на 23,1 миллиарда килограммов, что эквивалентно удалению с дорог 10, 2 миллиона автомобилей; 4) было спасено от распашки 108,7 миллионов гектаров территорий, что имеет огромное значение в плане сохранения биоразнообразия и биосферы в целом; 5) более 15 миллионов фермеров и их семей (вместе оаколо 50 миллионов человек) были спасены от разорения. 20. Организация генома хлоропластов, возможности использования ДНК пластид и локализованных в ней генов для получения трансгенных растений. (спросишь может нужна будет только организация хлоропластов)(тут я вставляла все..потому что я не знаю что тут говорить) Молекулы пластидных ДНК кольцевые ковалентнозамкнутые. Число молекул ДНК в пластидах зависит от уровня организации растения. Кольцевые молекулы могут быть в форме моно-, ди-, три- и тетрамеров и это связывают с наличием в них как минимум двух инвертированных повторов, условно разделяющих всю молекулу на так называемые однокопийные районы – большой и малый . Возможность рекомбинации по этим повторам очевидно и определяет формирование и распад коинтегратов. Установлено, что составляющие собственно повторы последовательности высоко консервативны и кодируют рибосомальные РНК пластид, поэтому эти повторы есть практически у всех исследованных видов высших растений. Стратегия введения в геном пластид целевых генов заключается в осуществлении гомологичной рекомбинации между вводимой ДНК и каким-либо участком в кольцевой молекуле пластид.Для вставки районом пластидного генома используют межгенный участок между генами trnI и trnA. Для интеграции в этот район используют генетическую конструкцию, включающую ген trnI, селективный ген aadA. Каждый компонент этой конструкции выполняет свою функцию. Расположенные по краям trn-гены из пластидного генома создают гомологию для рекомбинационной замены Промотор гена 16S рРНК обеспечивает экспрессии внутри хлоропластов. Бактериальный ген aadA при экспрессии с этого промотора дает фермент аминогликозид-3’-аденилилтрансферазу, который аденилирует стрептомицин или спектиномицин, лишая тем самым их активности. Отбор трансформированных клеток или растений основан на том, что в присутствии стрептомицина хлоропласты утрачивают способность синтезировать белки из-за связывания антибиотика с белками пластидных рибосом, вследствие чего растение на селективной среде теряют зеленую окраску. Трансформированные растения на этой среде остаются зелеными, так как антибиотик в их клетках инактивируется. Целевой ген для вставки в такую конструкцию должен иметь на своем 3’-конце некодирующую последовательность из какого-либо хлоропластного гена. Чаще всего используются концевые последовательности генов psbA (одного из белков фотосистемы II), rbcL (большой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы), rps16 (одного из белков 70S рибосом с константой седементации 16S). Для получения трансгенного растения ДНК плазмиды с описанной выше конструкцией вводят: • либо методом бомбардировки • либо методом обработки протопластов смесью ДНК с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Эффективность доставки «нагруженной» плазмиды в хлоропласты при использовании обоих методов не высока, но, благодаря тому, что в одной клетке около сотни хлоропластов, а в одном хлоропласте десятки копий молекул пластидной ДНК, отбор трансгенного растения оказывается возможным. При осуществлении рекомбинационной встройки вводимой генетической конструкции хотя бы в одну из копий пластидной ДНК на среде с антибиотиком происходит элиминация из клеток исходных пластид и постепенная замена их на устойчивые к антибиотику. С помощью переноса генов в хлоропластную ДНК возможно обеспечивать синтез в растениях таких веществ как природно деградируемый полимер поли-β-гидроксибутират и самый сладкий белок в мире монеллин. Во всех этих случаях повышение дозы гена (количества его копий в одной клетке) за счет пластидной локализации создает существенное преимущество по сравнению с интеграцией гена в ядерный геном. При интеграции в пластидный геном показана экспрессия не отдельных генов, а оперонов, включающих несколько генов, чего не удается достигать при интеграции генов в хромосомную ДНК растений. 30. Различия в морфологии индуцируемых агробактериями опухолей. На основании морфологических признаков различают три основных варианта корончатого галла. Первый из них - это шероховатые опухоли. Для них характерны округлая форма и наличие на поверхности небольших по размерам утолщений, из которых развиваются укороченные придаточные корни. Второй вариант называется гладкие опухоли, так как на их поверхности не формируются придаточные корни, а имеются небольшого размера выступы, напоминающие сильно утолщенные и укороченные листья. Внутри и шероховатые, и гладкие опухоли представляют собой однородную массу паренхиматических клеток. Третий вариант корончатого галла – это так называемые тератомы (уродства). Поверхность таких опухолей, как правило, не отличается от поверхности исходного здорового стебля, но внутри них наблюдается неупорядоченное смешение тканей, формирующееся из недоразвитых побегов, корней или листьев. 31. Растения устойчиые к гербицидам (писала все что нашла) Гербициды по механизму действия они делятся на: 1) ингибиторы процесса фотосинтеза; 2) ингибиторы биосинтеза ароматических аминокислот; 3) ингибиторы биосинтеза разветвленных аминокислот. Наиболее широко применяемыми ингибиторами фотосинтеза являются симметричные S-триазины (атразин, симазин) и производные фенилмочевины (диурон). Эти вещества способны подавлять процесс нециклического фотофосфорилирования, присоединяясь к тиллакоидным мембранам и блокируя перенос электронов ко вторичному акцептору электронов белку Qβ. Среди ингибиторов биосинтеза ароматических аминокислот наиболее широко применяемым является глифосат (N-фосфонометилглицин), производимый названием Раундап. Это вещество подавляет активность 5-енолпирувил-3-фосфатсинтетазы - одного из ключевых ферментов пути биосинтеза ароматических аминокислот в хлоропластах. Гербициды хлорсульфурон и сульфометуронметил (производные сульфонилмочевины) - ингибиторы биосинтеза синтеза разветвленных аминокислот (изолейцина и валина). Они также в огромных масштабах производятся фирмой Du Pont. Сходным действием обладают и имидазолиновые гербициды. Мишенью для всех гербицидов с таким механизмом действия является изофермент II ацетолактатсинтетазы (ALS II) – первый фермент пути биосинтеза изолейцина и валина. У растений кодирующие ALS II гены имеют хромосомную локализацию, но продукт их трансляции имеет транзитный пептид для транспортировки в хлоропласты. Для создания растений, устойчивых к гербицидам этой группы, путем селекции на средах с этими веществами были получены мутанты бактерий (Salmonella typhimurium), дрожжей (Sacharomyces cerevisiae), а также клеточные линии Nicotiana tabacum и Arabidopsis thaliana. В допущенных до коммерческого использования сортах нашли применение гены из арабидопсиса (усточивый к имидазолинам рис) и табака (одна из линий трансгенной кукурузы). Методами генетической инженерии в растениях заменяли чувствительный к гербициду белок (мишень для гербицида) на устойчивый. Еще одна возможность сделать растение резистентным – это придать ему способность разрушать или химически модифицировать поступающие в клетку молекулы гербицида так, чтобы они не могли оказывать свое губительное действие. Это второе стратегическое направление кажется более предпочтительным с точки зрения уменьшения засоренности почв гербицидами, но для его реализации необходим поиск особых специфических генов. Успешно реализовать такой подход в создании резистентности удалось в отношении фосфинотрициновых гербицидов. Первым гербицидом этой группы был биалофос - вещество, продуцируемое стрептомицетами двух видов: Streptomyces hygroscopiсus и Streptomyces viridochromogenes. Это соединение представляет собой трипептид, состоящий из двух остатков L-аланина и остатка фосфинотрицина – аналога глютаминовой кислоты. При попадании биалофоса в растительную клетку под действием внутриклеточных пептидаз происходит его распад и освобождается фосфинотрицин, который необратимо инактивирует ключевой фермент в ассимиляции аммония – глютаминсинтетазу. В настоящее время в качестве действующего вещества ряда гербицидов используется химически синтезированный аналог фосфинотрицина – глюфозинат аммония. Источниками генов резистентности к этой группе гербицидов стали продуценты биалофоса. Эти стрептомицеты не чувствительны к фосфинотрицину, поскольку образуют фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу, снимающий токсическое действие фосфинотрицина путем его ацетилирования. Новые трансгенные сорта создаются преимущественно в рамках этой стратегии. Найдены пути создания растений, устойчивых к феноксикарбоксильным кислотам (гербициды ауксиноподобного механизма действия 2,4-D и 2,4,5-T). В этом случае в генетических конструкциях используется ген tfdA из бактерий Alcaligeneseutrophus, кодирующий диоксигеназу, способную разрушать эти соединения. Против оксиниловых гербицидов, являющихся ингибиторами фотосистемы II, в растения хлопка ввели ген нитрилазы из бактерий рода Klebsiella– под действием этого фермента бромоксинил и иоксинил утрачивают свою токсичность. Для придания растениям устойчивости к цианамидам может быть применен ген цианамидгидратазы из гриба Myrotheciumverrucaria, которая превращает гербицид в мочевину. Устойчивость табака к далапону (дихлорпропионату натрия) удалось создать, использовав ген дегалогеназы из бактерий Pseudomonasputida. Отщепление атомов хлора превращает гербицид в пропионовую кислоту. 34. Соответствие природных Тi-плазмид требованиям для векторов. Вектор в биологическом смысле – это молекула нуклеиновой кислоты, обеспечивающая введение наследственной информации в клетки и создание условий для ее выражения и поддержания в ряду поколений того или иного вида организмов. Векторы должны соотвествовать общим требованиям. Первое требование – введение. (Ti-плазмиды соответствуют) Процесс трансформации обычных растительных клеток в опухолевые заключается в переносе Т-ДНК в растительную клетку с помощью специализированных белков. Введенная в растительную клетку Т-ДНК доставляется в ядро и встраивается в хромосомы растительных клеток. Второе требование – создание условий для реализации введенной генетической информации. (Ti-плазмиды соответствуют) Трансформированные клетки растений вырабатывают гормоны роста и опины. Возникающие в результате деления таких клеток дочерние клетки продолжают выделять цитокинины и опины, а, значит, обеспечивается и третье требование – стабильное поддержание введенной генетической информации. (Ti-плазмиды соответствуют) возникающее в результате деления трансформированных клеток дочерние клетки продолжают выделять цитокинины и опины. Этим и обеспечивается это требование. Четвертое требование-Вектор так же не должен препятствовать регенерации растения из отдельных растительных клеток и его размножению вегетативным и семенным путем. (Ti-плазмиды соответствуют) Пятое требование- векторная емкость. (Ti-плазмиды соответствуют) Это значит что, количество генетической информации, которое может нести вектор без нарушения его основных свойств – способности эффективного введения и стабильного наследования. Шестое требование -хозяйская специфичность. (Ti-плазмиды соответствуют) Желательно что бы вектор можно было вводить в любые растения. Седьмое требование – вектор не должен вызывать патологического состояния в трансформированном организме природные. Ti-плазмиды не соответствуют. 39. Трансгенные растения – будущее сельского хозяйства Лидером в выращивании генно-инженерных сортов по-прежнему являются США, но в настоящее время опережающими темпами в свое сельское хозяйство эти современные сорта внедряют развивающиеся страны.Этот факт как нельзя более наглядно демонстрирует преимущества трансгенных растений перед обычными – их выращивание оказывается более выгодным по сравнению с любыми из сортов, культивируемых ранее. Основными трансгенными культурами являются соя, кукуруза, хлопок и рапс.Стремительный рост площадей под трансгенными растениями уже сам по себе является ярким доказательством их преимуществ над обычными сортами.выращивание трансгенных растений дало: 1) прирост доходов от реализации сельхозпродукции выросло 2) экономия пестицидов, что существенно снизило нежелательное воздействие на окружающую среду; 3) выброс СО2 в атмосферу из-за меньшего использования с/х техники был уменьшен.4) было спасено от распашки много гектаров территорий. 40. Трансгенные растения как источник медицинских препаратов Одной из первой работ была работа группы Чарльза Арнтцена из Техасского университета в Хьюстоне. Им удалось показать, что экспрессируемый в клетках табака ген поверхностного белка вируса гепатита В дает белок, способный вызвать в организме лабораторных животных иммунный ответ, приводящий к продукции антител, защищающих от гепатита. Они же показали что можно получить противобактериальные вакцины с помощью генной инженерии. В этой работе был использован один из генов термолабильного энтеротоксина энтеропатогенных E.coli. Этот токсин состоит из одной субъединицы А, массой 27 кД (обозначается LT-A), и 5 пяти одинаковых субъединиц В, массой 11,6 кД (соответственно LT-B). Было известно, что иммунитет определяется выработкой антител против субъединицы В, которые блокируют связывание молекулы токсина с ганглиозидом G M1 клеток эпителия кишечника, в силу чего субъединица А не проникает внутрь клетки и не может оказать токсического действия. Это стало основанием для выбора гена, кодирующего LT-B, в качестве основы для создания вакцинного препарата. Исследования конца 1990-х – начала 2000-х годов показали, что введение в пластидный геном генов бактериальных токсинов (холерного токсина, столбнячного токсина); генов, кодирующих поверхностные антигены бактерий (возбудителя чумы, возбудителя сибирской язвы), простейших (антиген дизентерийной амебы) и вирусов (ротавирусов животных и человека, вирусов гепатита) обеспечивает высокий уровень продукции этих белков трансформированными растениями, что открывает широкие возможности для применения их как в качестве «съедобных вакцин», так и своеобразных «биофабрик» для дешевых вакцин инъекционного введения. Помимо использования растений для получения вакцин, имеются предпосылки для разработки препаратов, пригодных для создания пассивного иммунитета. Целью этой работы было получение растений, способных продуцировать антитела в норме присутствующие в секретах слизистых оболочек ротовой полости. Антитела могут быть использованы не только для терапии или профилактики инфекционных болезней, но и для терапии раковых заболеваний. Биотехнологическая фирма Agracetus Incorparated имеет трансгенную сою сорта BR96, дающую моноклональные антитела, специфичные к антигенам раковых клеток и предполагается их использование для доставки химиотерапевтического препарата. Перспективы использования трансгенных растений в медицинских целях: За: вакцины и антитела, в отличие от получаемых из организмов или культур клеток животных, должны быть дешевле и безопасней в плане отсутствия в них плохо тестируемых вирусов. Против: получаемые в больших масштабах препараты для инъекций трудно очищать от алкалоидов и других токсических веществ растительного происхождения. 44. трансекция бластомеров -клеточного эмбриона Основными методами введения генетической информации в их организм являются трансфекция бластомеров 8-клеточного эмбриона с помощью ретровирусных векторов, введение генетически модифицированных с помощью тех же векторов стволовых клеток в эмбрионы на более поздних стадиях развития и прямое введение ДНК в зиготу до слияния мужского и женского ядер. метод микроинъекций. у мышей стимулируют овуляцию в результате чего в яичниках мыщи образуется более 30 яйцеклеток. Затем осуществляют скрещивание таких самок с самцами и их быстрое умерщвление для вымывания оплодотворенных яйцеклеток из яйцеводов.С использованием микроманипулятора, под микроскопом поочередно фиксируют каждую клетку и с помощью инъекционной пипетки в мужской пронуклеус вводится суспензия молекул ДНК(трансген), содержащих необходимую генетическую информацию. Когда ядро яйцеклетки (женский пронуклеус) и ядро сперматозоида сливаются и получается полноценная зигота, она микрохирургическим путем имплантируется в матку, которая была перед этим скрещена с самцом (нет сперматозоидов), для подготовки матки самки к имплантации. В матку одной самки вводят от 25 до 40 зигот.Через три недели рождается трансгенное потомство, которое оценивается в дальнейшем на наличие введенных генов и выраженность желаемого признака.хвост.ПЦР. |