зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий
 Скачать 135.64 Kb.
|
|
Билет 19 1. Использование липосом для введения ДНК в клетку Липосомами называют везикулы, которые можно получить суспендируя в растворе фосфолипидные молекулы по особой методике. Если в таком растворе присутствуют молекулы ДНК или РНК, они оказываются внутри везикул. При совмещении протопластов растительных клеток и липосом в буфферных растворах, содержащих способствующие слиянию мембран и эндоцитозу вещества, высокую концентрацию ионов кальция и имеющих щелочные значения рН, происходит ассоциация липосом с поверхностью мембраны протопластов и поглощение их путем эндоцитоза.В цитоплазме протопласта фосфолипидная оболочка со временем распадается, освобождая молекулы нуклеиновой кислоты. Недостатком метода считаются высокие требования к протопластированию – протопласты не должны иметь на поверхности даже остатков клеточной стенки. Кроме того, получение липосом несколько усложняет методику в целом, но это компенсируется снятием токсического эффекта высоких концентраций ДНК и защитой ДНК от эндонуклеаз растительной клетки. 2. Получение трансгенных растений с улучшенными пищевыми качествами и товарным видом Для улучшения хранения продуктов были использованы несколько подходов. Один из них заключается в получении кДНК на матрицах зрелых иРНК этих генов и создания конструкций, дающих при экспрессии в клетках растений антисмысловую РНК. Следующий подход состоит в получении растений, не продуцирующих этилен. Были получены генетические конструкции, дающие при экспрессии антисмысловые РНК АСС-синтетазы и АСС-оксидазы, и их введение в растение приводило к гораздо более медленному накоплению этилена в тканях плода. Для придания товару более сладкого вкуса использовали ген белка монеллина из плодов тропического растения. Этот белок очень не стоек термически и легко распадается. Для введения этого белка в традиционно потребляемые в сыром виде растения использовали последовательность, кодирующую обе цепи монеллина. Основными питательными веществами для человека и животных в растительных тканях являются углеводы (крахмал, моно и дисахариды) и белки, которых крайне мало. Наиболее насыщенными белками из органов растений являют семена. Существует несколько подходов для создания растений с улучшенным набором запасных белков: 1) Совмещение в одном растении генов запасных белков из генов различных других растений. Например: ген фазеолин был введён в клетки табака. 2) Это использование собственных генов тех или иных растений, поставленные под более сильный промотор. 3) Направленное изменение аминокислотного состава определённых запасных белков, посредством введения в исходную последовательность кодонов, соответствующих незаменимым аминокислотам. Наиболее лучшим местом для введения является С-концевой домен, у которого имеется гипервариабельный участок. Ещё одним подходом для улучшения аминокислотного состава запасных белков семян является изменение общего количества аминокислот, синтезируемых в растениях. Примером получения с/х растения является «золотой рис». Золотой – т.к. имеет большое количество провитамина А. Клетки «золотого риса» были трансформированы генетической конструкцией. Так же был получен картофель с улучшенным качеством крахмала. Путём введения гена амилозы (имеет линейные цепи), в обратной ориентации и под сильный промотор. Количество амилозы стало равно нулю, а количество амилопектина повысилось в несколько раз. Именно он указывает на качество крахмала. Билет 20 1)вакцины, получаемые на основе геноинж. растен, Методами генной инженерии удалось создать ряд вакцин, которые испытываются для проверки эффективности их воздействия на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). С помощью рекомбинантной ДНК полу-чают и человеческий гормон роста, являющийся единственным средством ле-чения редкой детской болезни – гипофизарной карликовости. В Беларуси в РНПЦ эпидемиологии и микробиологии создан лиофилизированный препарат рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса гепатита С, который обла-дает антигенными и иммуногенными свойствами и будет использован в каче-стве антигена в диагностической иммуноферментной тест-системе отечест-венного производства для выявления антител к вирусу гепатита С. Большим преимуществом данных генно-инженерных лекарственных препаратов является отсутствие при их использовании негативных побочных эффектов. При получени противобактериальных вакцин был использован один из генов термолабильного энтеротоксина энтеропатогенных E.coli. Сейчас пытаются создать трансгенные “вакцинные” растения, которые можно употреблять в пищу в сыром виде, в частности, бананов. Исследования показали, что введение в пластидный геном генов бактериальных токсинов (холерного токсина, столбнячного токсина); генов, кодирующих поверхностные антигены бактерий (возбудителя чумы, возбудителя сибирской язвы), простейших (антиген дизентерийной амебы) и вирусов (ротавирусов животных и человека, вирусов гепатита) обеспечивает высокий уровень продукции этих белков трансформированными растениями. Это дает возможность применять их в качестве «съедобных вакцин», так и создания «биофабрик» для дешевых вакцин инъекционного введения. Имеются предпосылки для разработки препаратов, пригодных для создания пассивного иммунитета. Целью этой работы было получение растений, способных продуцировать антитела в норме присутствующие в секретах слизистых оболочек ротовой полости. Антитела могут быть использованы для терапии раковых заболеваний. Одна биотехнологическая фирма имеет трансгенную сою сорта BR96, дающую моноклональные антитела, специфичные к антигенам раковых клеток и предполагается их использование для доставки химиотерапевтического препарата. Перспективы использования трансгенных растений в медицинских целях: За: вакцины и антитела, в отличие от получаемых из организмов или культур клеток животных, должны быть дешевле и безопасней в плане отсутствия в них плохо тестируемых вирусов. Против: получаемые в больших масштабах препараты для инъекций трудно очищать от алкалоидов и других токсических веществ растительного происхождения. 2)введение стволовых клеток животным В донорной бластоцисте внутриклеточная масса культивируется и получаются ES-клетки. Трансфекцией вводится чужеродный ген. В векторе, предназначенном для трансфекции ES-клеток должен быть маркерный ген и трансген располагаются между последовательностями, гомологичными последовательностям из таких сайтов. Отбор клеток со встроенным геном. Далее делают микроинъекцию в бластоцисту. И эту бластоцисту имплантируют в эксперементальное животное. Методом отбора эмбриональных стволовых клеток является позитивно-негативная селекция. Позитивной селекцией называют культивирование клеток на среде с маркерным геном Neor (продукт которого придает клеткам млекопитающих устойчивость к G-418 (генетицину)), которое позволяет отобрать клетки, в которых произошла встройка векторной молекулы в геном. Иногда встройки могут происходить в различные участки генома, поэтому в составе вектора находятся еще два гена тимидинкиназы из генома вируса простого герпеса – HSV-tk1 и HSV-tk2. Они убирают клетки с ненужными вставками. Эти гены располагаются в векторе слева и справа от нужных для направленной интеграции гомологичных фрагментов, и если встраивание произошло случайно, не по этим гомологичным последовательностям, то в геноме клетки оказывается хотя бы один из генов тимидинкиназы. Если клетки выращивать на среде с ганцикловиром, то гены тимидинкиназы под воздействием этого фермента превращается в токсическое для клетки соединение. Если после трансфекции ES-клетки поместить на среду, одновременно содержащую и генетицин (G-418) для позитивной селекции и ганцикловир - для негативной, будут размножаться только те клетки, в которых произошла интеграция в нужный сайт хромосомы. Еще один метод - ПЦР, для этого используют другие векторы. В таких векторах рядом с предназначенным для введения геном (между ним и одной из необходимых для гомологичной рекомбинации последовательностей) располагают короткую уникальную последовательность (US), которая нигде больше в геноме животного не встречается. Для идентификации нужных клеток необходимы два праймера: один из них (Р1) комплементарен этой уникальной последовательности, а второй (Р2) – последовательности из того сайта хромосомы, в который предполагается встройка. Если после амплификации ДНК из трансфецированных клеток выявляется фрагмент предусмотренного размера, то, значит, именно в этих клетках интеграция произошла в нужное место хромосомы. Далее клетки такого клона с использованием микроманипулятора вводят в бластоцисту мыши, и затем имплантируют эту бластоцисту в матку суррогатной матери. После этого по описанной выше схеме получают чистые трансгенные линии. Билет 21 1. Позитивно-негативная селекция трансформированных клеток млекопитающих Позитивной селекцией называют культивирование клеток на среде с маркерным геном Neor (продукт которого придает клеткам млекопитающих устойчивость к G-418 (генетицину)), которое позволяет отобрать клетки, в которых произошла встройка векторной молекулы в геном. Иногда встройки могут происходить в различные участки генома, поэтому в составе вектора находятся еще два гена тимидинкиназы из генома вируса простого герпеса – HSV-tk1 и HSV-tk2. Они убирают клетки с ненужными вставками. Эти гены располагаются в векторе слева и справа от нужных для направленной интеграции гомологичных фрагментов, и если встраивание произошло случайно, не по этим гомологичным последовательностям, то в геноме клетки оказывается хотя бы один из генов тимидинкиназы. Если клетки выращивать на среде с ганцикловиром, то гены тимидинкиназы под воздействием этого фермента превращается в токсическое для клетки соединение. Если после трансфекции ES-клетки поместить на среду, одновременно содержащую и генетицин (G-418) для позитивной селекции и ганцикловир - для негативной, будут размножаться только те клетки, в которых произошла интеграция в нужный сайт хромосомы. 2. Коинтегративные векторы на основе Ti- плазмид Используемые в контегративной векторной системе плазмиды должны после совмещения их в клетках агробактерий объединяться в коинтеграт, переводя «нагруженную» Т-ДНК и vir-регулон в cis-положение. В составе векторных плзмид имеется фрагмент, содержащий только правую часть Т-ДНК с правым концевым повтором и достаточно протяженный участок, гомологичный левой части Т-ДНК. В такой плазмиде отсутствует участок, обеспечивающий репликацию и стабильное наследование в клетках агробактерий, что обеспечивает после совмещения двух плазмид отбор только тех клеток, в которых произошла рекомбинация (коинтеграция). Ti-плазмиды должны не содержать правого концевого повтора Т-ДНК, но обязательно содержать левый концевой повтор и прилегающий к нему участок, гомологичный тому фрагменту, который находится в векторной плазмиде. В результате образутеся Т-ДНК с обоими концевыми повторами, между которыми и оказывается предназначенная для введения в растительную клетку генетическая конструкция. Векторная ДНК рекомбинирует в A. tumefaciens с «разоруженной» Ti-плазмидой, Т-ДНК которой не несет опухолеродных генов, таким образом, что весь клонирующий вектор встраивается в неонкогенную Ti-плазмиду .Коинтегративный вектор и неонкогенная Ti-плазмида-помощник содержат гомологичные последовательности, которые образуют сайт для гомологичной рекомбинации. После рекомбинации клонирующий вектор становится частью неонкогенной Ti-плазмиды, которая содержит vir-гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительную хозяйскую клетку. Билет 22 1)Бинарные векторные системы для растений В клетках агробактерий присутствуют две независимо реплицирующиеся плазмиды: 1)векторная плазмида с «нагруженной» Т-ДНК 2)Ti-плазмида с vir-генами. Векторная плазмида обязательно содержит: 1)сайт инициации репликации (оri) для ешерихии коли и для агробактериум тумефациенс 2)селективный маркерны ген,который может быть использован либо в эшерихии либо в агробактерии 3)интересующий ген 4)растительный селективный марерный ген 5)и по 25 п.н. левого и правого краев Т-ДНК Пункты 3 и 4 должны быть встроены в Т-ДНК. Векторсодержит сайты ori,но не имеет vir-генов. Все стадии клонирования проводятв ешерихии,а затем вектор вводяит в агробактерию. Шамм агробактерии несет модифицированную неонкогенную Ti-плазмиду. Она содержит vir-гены,но из нее удалена Т-ДНК. На Ti-плазмиде синтезируются продукты vir-генов бинарного клонирующего вектора. Продуцируя белки,которые кодируются vir-генами, неонкогенная Ti-плазмида выступает в роли помощника. Она способствует встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения. 2) про птиц-получение и применение У птиц при оплодотворении в яйцеклетку проникает, как правило, несколько сперматозоидов, но лишь один из них сливается с ядром. Поэтому осуществлять инъекции в мужской пронуклеус считается нецелесообразным. Были использованы стандартные ретровирусные векторы млекопитающих. Часть полученных таким образом цыплят наследовали маркерный ген и не продуцировали вирусных частиц, но опасения, что присутствие ретровирусного генома может иметь нежелательные последствия при потреблении полученных от таких птиц продуктов, заставили дальше отказаться от такого подхода. К настоящему времени используют метод введения ДНК в бластомеры куриных эмбрионов с помощью липосом. Для этого из яиц извлекают эмбрион, разделяют его на клетки и смешивают их с суспензией липосом, содержащих чужеродную ДНК. Добиваются слияния липосом с клетками, а затем вводят суспензию таких клеток в подзародышевую область свежее отложенных яиц,которые подвергали облучению. Если из такого яйца в дальнейшем вылупливается птенец, то в части его клеток можно обнаруживать присутствие введенного гена. Такие цыплята называются химерными и их в дальнейшем используют для скрещивания. Анализ потомства позволяет выявить особи, у которых трансген присутствует во всех клетках, и такая птица становится основателем чистой линии. Потенциальное хозяйственное применение трансгенных птиц видят в следующем получение пород кур, устойчивых к различного рода инфекциям.пород с измененным составом желтка и мяса ; пород с измененным составом белка. Билет 23 1)Т-ДНК агробактерий строение, функции. Основным элементом Ti-плазмид является T-ДНК, размер которой составляет 5–8 % Тi-плазмиды. T-ДНК отвечает за индукцию опухолей в растении, т.е. за онкогенность. Т-ДНК имеет концевые прямымые повторы длиной 25 пар нуклеотидов, между которыми располагаются гены, не способные транскрибироваться в прокариотической клетке. Отличительной чертой октопиновых плпзмид Т-ДНК является наличие внутри Т-ДНК еще двух таких же повторов, что приводит к разделению Т-ДНК на ТL-ДНК (левая Т-ДНК=13 kb) и ТR-ДНК (правая Т-ДНК=7,8 kb).Благодаря этому Т-ДНК октопиновых плазмид в растительную клетку может переноситься и интегрироваться в растительный геном и как единая последовательность и как два отдельных фрагмента . В нетранслируемых областях Т-ДНК имеются типичные эукариотические ТАТА- и СААТ-боксы и полиА-сайты. Из этого следует, что продукты этих генов синтезируются только в растительной клетке и от них зависят отличия опухолевых клеток от обычных. В левой части Т-ДНК Ti-плазмид находятся гены, определяющие способность опухолевых клеток к интенсивному делению. В плазмидах октопинового типа это два гена iaaM и iaaH, продукты которых катализируют превращение триптофана сначала в индолацетамид, а затем в индолилуксусную кислоту . Вспомогательную роль в опухолеобразовании играют ген 5 и ген 6b. Ген 5 определяет образование индол-3-лактата, который является антагонистом ауксина и регулирует скорость деления опухолевых клеток. Ген 6b повышает чувствительность растительных клеток к гормонам роста. Ближе к правому концу левой части октопиновых плазмид расположены два Гена: -Ген ocs кодирует октопинсинтазу -ген ons, продукт которого обеспечивает выделение синтезируемых опинов из опухолевых клеток в межклеточное пространство. Остальные гены синтеза опинов mas1, mas2 и ags - расположены в правой Т-ДНК октопиновых плазмид. Геном mas2 фермент катализирует реакции конденсации глютамина с глюкозой, а затем продукт гена mas1 доводит полученные соединения до маннопин. Ген ags кодирует фермент, превращающий маннопин в агропин. Маннопин, и агропин могут самопроизвольно превращаться в агропиновую кислоту, таким образом в опухолях, вызванных агробактериями с плазмидами октопинового типа можно обнаруживать восемь опинов – четыре из октопинового сесмейства и четыре из агропинового (маннитилового) семейства. Принципиально функциональный состав Т-ДНК Ti-плазмид всех типов сходен: в них всегда имеются две группы генов – гены опухолеобразования и и гены синтеза опинов.классификация проводится по генам синтеза опинов(нопалинового, октопинового и агропинового). 2)Трансгенные растения устойчивые к стрессам Есть растения, обитающие на засушливых почвах, синтезируют и накаплвают в клетках низкомолекулярные осмопротекторы(сахара, пролин и бетаин!).бетаин образуется их холина в 2 этапа: 1) катализируется холинмонооксигеназой и 2) бетаинальдегидрогеназой. Его образуют не все растения, но можно перенести 2 гена из растени в которых бетаин есть или брать гены из микроорганизмов, у которых один фермент - холиндегидрогеназа катализирует 2 превращения тогда, ген betA из E.coli перенесли под промотером 35S рнк CaMV - солеустойчивость повысилась. Что бы повысить значение признака увеличивали дозы гена, который вводили. Устойчивость к нехватке воды за счет накопления в клетках осмопротектора - трегалозы. Введение в пластидный геном табака гена tps1 из генома дрожжей Saccharomyces cerevisiae, кодирующего трегалозо-6-фосфатсинтетазу - это увеличло уровень трегалозы. Если много трегалозы в цитоплазме клеток - прибегают к синтезу, тогда накапление идет в пластиды. Устойчивость к заморозкам: введение генов в пластидный геном. Гены дельта-9-сатуразы из дикоростущего картофеля и такой же ген из цианобактерии Anacystis nidulans. При накоплении этого фермента повышается уровень продукции липидов с ненасыщенными жирными кислотами. Устойчивость к тяжелым металлам: пластидный геном табака вводили оперон из 2 генов из бактериального транспозона. Оперон определяет устойчивость бактрерии к ртути. 1 ген кодирует редуктазу(неорг. ионов ртути) 2 ген лиазу(он разрушает огр. соли ртути). Еще один подход: в клетках растений образуется надпероксидный анион О2 - как реакция на повышение t или дозы ультрофиолета. В качестве защиты от этого аниона применяется фермент супероксид-дисмутаза(ее изоформы: Cu/Zn-хлоропласты, Mn-митохондрии, Fe-есть не у всех). Гены этих двух ферментов были клонированы посредством выделения соотвествующих матричных РНК и синтеза in vitro кДНК и затем оба варианта под промоторами 35S РНК CaMV были введены в клетки табака. Оказалось, что растения со сверхэкспрессией гена Cu/Zn-супероксид-дисмутазы могли фотосинтезировать при повышенном уровне освещенности. |