зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий
 Скачать 135.64 Kb.
|
|
Билет 29 1) получение и применение трансгенных мышей Мыши являются модельным объектом для трансгеноза. Основными методами введения генетической информации в их организм являются трансфекция бластомеров 8-клеточного эмбриона с помощью ретровирусных векторов Для получения трансгенный мышей используется метод микроинъекций. Для его реализации у самок белых мышей стимулируют овуляцию путем введения сыворотки беременной лошади и через 48 часов – хорионического гонадотропина человека, в результате чего в яичниках мыщи образуется более 30 яйцеклеток вместо обычных 5-10. Затем осуществляют скрещивание таких самок с самцами и их быстрое умерщвление для вымывания оплодотворенных яйцеклеток из яйцеводов. С использованием микроманипулятора, под микроскопом поочередно фиксируют каждую клетку и с помощью инъекционной пипетки в ядро слившегося с яйцеклеткой сперматозоида вводится суспензия молекул ДНК, содержащих необходимую генетическую информацию. Когда ядро яйцеклетки и ядро сперматозоида сливаются и получается полноценная зигота, она микрохирургическим путем имплантируется в матку так называемой суррогатной матери - самки, которая была перед этим скрещена с самцом у которого в семенной жидкости нет сперматозоидов. В матку одной самки вводят от 25 до 40 зигот, для того, чтобы хотя бы часть из них имплантировалась нормально, и началось дальнейшее развитие эмбрионов. Через три недели рождается трансгенное потомство, которое оценивается в дальнейшем на наличие введенных генов и выраженность желаемого признака. Еще один подход – это введение генетически модифицированных стволовых клеток в бластоцисту.В донорной бластоцисте внутриклеточная масса культивируется и получаются ES-клетки. Трансфекцией вводится чужеродный ген. В векторе, предназначенном для трансфекции ES-клеток должен быть маркерный ген и трансген располагаются между последовательностями, гомологичными последовательностям из таких сайтов. Отбор клеток со встроенным геном. Далее делают микроинъекцию в бластоцисту. И эту бластоцисту имплантируют в эксперементальное животное. 2) ДНК пластид и использование их для трансформации растений (Не уверена, но похоже на правду) Молекулы пластидных ДНК кольцевые ковалентнозамкнутые. Число молекул ДНК в пластидах зависит от уровня организации растения. Кольцевые молекулы могут быть в форме моно-, ди-, три- и тетрамеров и это связывают с наличием в них как минимум двух инвертированных повторов, условно разделяющих всю молекулу на так называемые однокопийные районы – большой и малый . Возможность рекомбинации по этим повторам очевидно и определяет формирование и распад коинтегратов. Установлено, что составляющие собственно повторы последовательности высоко консервативны и кодируют рибосомальные РНК пластид, поэтому эти повторы есть практически у всех исследованных видов высших растений. Стратегия введения в геном пластид целевых генов заключается в осуществлении гомологичной рекомбинации между вводимой ДНК и каким-либо участком в кольцевой молекуле пластид. Для вставки районом пластидного генома используют межгенный участок между генами trnI и trnA. Для интеграции в этот район используют генетическую конструкцию, включающую ген trnI, селективный ген aadA. Каждый компонент этой конструкции выполняет свою функцию. Расположенные по краям trn-гены из пластидного генома создают гомологию для рекомбинационной замены. Промотор гена 16S рРНК обеспечивает экспрессии внутри хлоропластов. Бактериальный ген aadA при экспрессии с этого промотора дает фермент аминогликозид-3’-аденилилтрансферазу, который аденилирует стрептомицин или спектиномицин, лишая тем самым их активности. Отбор трансформированных клеток или растений основан на том, что в присутствии стрептомицина хлоропласты утрачивают способность синтезировать белки из-за связывания антибиотика с белками пластидных рибосом, вследствие чего растение на селективной среде теряют зеленую окраску. Трансформированные растения на этой среде остаются зелеными, так как антибиотик в их клетках инактивируется. Целевой ген для вставки в такую конструкцию должен иметь на своем 3’-конце некодирующую последовательность из какого-либо хлоропластного гена. Чаще всего используются концевые последовательности генов psbA. Билет 30 1. Электропорация, микроинъекция, взаимодействие сферопластов и протопластов Микроинъекции. Заключается в непосредственном введении растворов ДНК в клетку или ее ядро спомощью полых стеклянных микроигл. После проникновения кончика иглы в объект, с помощью специальной гидравлической системы через иглу подается от 1 до 5 пиколитров раствора ДНК с концентрацией от 0,1 до 1,0 мкг/мл. Электропорация. Он основан на том, что под действием электрического тока молекулы в биологических мембранах меняют свое положение. После снятия воздействия молекулы липидного бислоя и связанные с ними белковые молекулы возвращаются в исходное положение. Проводимые на клетках животных эксперименты, показали, что при правильно подобранных силе тока, напряжении и времени воздействия в мембранах клеток возникают кратковременно существующие поры, через которые присутствующие в высокой концентрации молекулы ДНК успевают проникнуть в цитоплазму. Два подхода: используют либо высоковольтный импульс малой длительности, либо низковольтный импульс гораздо большей длительности. Одним из самых эффективных методов прямой трансформации протопластов – это обработка протопластов растительных клеток смесью соответствующих векторных молекул и полиэтиленгликоля. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) представляет собой сильно гидрофильное вещество и способен связывать много свободной воды в растворе. Таким образом, при высоких концентрациях ПЭГ такие макромолекулы, как ДНК, не могут оставаться в растворе и осаждаются. Мембрана протопласта в норме отрицательно заряжена. Благодаря фосфатным группам ДНК тоже имеет отрицательный заряд, и, следовательно, взаимное отталкивание зарядов препятствует взаимодействию между ДНК и протопластами. При концентрациях 15-40% ПЭГ минимизирует взаимное отталкивание зарядов; таким образом, клеточные мембраны могут прийти в тесный контакт с ДНК. Кроме того, ПЭГ представляет собой и сильный стимулятор эндоцитоза у протопластов растений. Таким образом, общий механизм воздействия ПЭГ связан с преципитацией, т.е. осаждением плазмидной ДНК на плазматической мембране и затем стимуляцией ее поглощения путем эндоцитоза. В отличие от остальных веществ ПЭГ гораздо менее токсичен по отношению к большинству протопластов, и, как правило, можно подобрать такую концентрацию, при которой достигается хороший уровень поглощения ДНК при незначительном повреждении клеток. 2. Трансгенные рыбы введения ДНК в икринки осуществлятют путем микроинъекцией или электропорацией. Трансфецированные икринки оставляют в воде для развития эмбриона и выхода трансгенного потомства. Наличие трансгена у мальков определяют посредством ПЦР. так же проводились исследования с лососем, в которой была использована кДНК гена гормона роста лосося, поставленная под промотор и сайт полиаденилирования гена антифризного белка североамериканской бельдюги.наблюдалось увеличение роста в 10 раз. Обсуждается возможность получения пород устойчивых к болезням и стрессовым воздействиям при скученном содержании рыб.Так же велись работы на аквариумных рыбках данио рерио.Использовались в комерческих целях.Разнообразие цветов и оттенков получено путем использования генов различных коралловых полипов. Причем теперь это не только данио рерио и медака, а еще тернеция, скалярия и цихнида. Билет 31 1..Классификация плазмид агробактерий Большинство обнаруженных в природных штаммах Ti-плазмид попадают в три основные группы: плазмиды октопинового типа. При инфицировании растений штаммами с плазмидами этой группы развиваются шероховатые опухоли, клетки которых продуцируют опины октопинового и агропинового семейств. нопалиновые плазмиды, обеспечивающие образование гладких опухолей (реже – тератом). агропиновые плазмиды, определяющие образование корончатых галлов с различной поверхностью, но без придаточных корней, в которых синтезируются опины агропинового семейства и агроцинопины D и С. Опухоли, вызванные штаммами с плазмидами этой группы, отличаются более выраженным отмиранием клеток в центральной части. Ri-плазмиды разделили на два типа: - Ri-плазмиды агропинового типа: клетки продуцируют опины агропинового семейства и агроцинопин А. - Ri-плазмиды маннопинового типа: дают опухоли с продукцией маннопина, маннопиновой кислоты, агропиновой кислоты и агроцинопина С. На основании морфологических признаков различают три основных варианта корончатого галла: шероховатые опухоли. Для них характерны округлая форма и наличие на поверхности небольших по размерам утолщений, из которых развиваются укороченные придаточные корни. гладкие опухоли, так как на их поверхности не формируются придаточные корни, а имеются небольшого размера выступы, напоминающие сильно утолщенные и укороченные листья. тератомы (уродства). Поверхность таких опухолей, как правило, не отличается от поверхности исходного здорового стебля, но внутри них наблюдается неупорядоченное смешение тканей, формирующееся из недоразвитых побегов, корней или листьев. 2.. Биобезопасность Разработанные в лаборатории ГМ-растения не имеют какой-либо опасности. Но эти растения нужно переносить в реальные условия и для этого создаются специальные полигноы для тестирования таких растений. Эти тестирования должны соответствовать определенным правилам,которые прописаны в постановлении министерства ресурсов и охраны окружающей среды. Одно из правил на таком полигоне это содержание рядом с полигоном информационной доски (ФИО индивидуального предпринимателя, площадь опытного поля, предупреждение о том что тут тестируется ГМО). Индивидуальный предприниматель должен иметь паспорт на этот объект (ФИО, тестируемые виды, описание места где проводится испытание, схема местоположения, описание почвы, описание растений и животных обитающих рядом). Полигон должен быть огорожен. Из-за развития создания ГМО возникает вероятность попадания их в организм человека. Поэтому при производстве продуктов содержащих ГМО должна быть информация, что в продукте содержится такие организмы. Формуля для расчет риска риск = вероятность × последствие Существует риск появления устойчивости к используемым трансген-ным токсинам у насекомых-фитофагов, бактерий, грибов и других вредителей под действием отбора на признак устойчивости, высокоэффективного для этих организмов. Вероятно и негативное влияние на биоразнообразие через поражение токсичными трансгенными белками нецелевых насекомых и поч-венной микрофлоры, а также нарушение трофических цепей. Вызывает опасения и возможность неконтролируемого горизонтально-го переноса трансгенных конструкций в ризосферную микрофлору. Актуальны также риски появления новых, более патогенных штаммов фитовирусов в результате их взаимодействии с трансгенными конструкциями. Не исключают также синергетического воздействия на растения рекомбинантой вирус-ной ДНК и других типов вирусов, присутствующих в растении. Остальные вопросы 2. Культуры клеток насекомых как объект генетической инженерии Наиболее часто такие культуры используются для получения белков возбудителей вирусных болезней человека и животных, например, антигена вируса синего языка, антигена вируса Денге типа I, белка оболочки ВИЧ-1, капсидного белка вируса простого герпеса, гемагглютинина вируса гриппа, белка вируса Ласса, белков полиовирусов, гликопротеина вируса бешенства, гликопротеина 50 вируса псевдобешенства, антигена ротавируса обезьян. Это обусловлено тем, что пострансляционные модификации белков таких вирусов в норме определяются системами, характерными для клеток животных, которые могут отсутствовать в клетках других организмов. Показана также возможность применения клеток насекомых для получения белков человека, имеющих отношение к ряду наследственных патологий: 3) липазы поджелудочной железы человека; 5) белков, имеющих различное терапевтическое применение: α- и β-интерферонов; интерлейкина-2; эритропоэтина; 6) белков, не предназначенных для медицинского применения: мышиные моноклональные антитела, ДНК-полимеразу человека α; 7) других белков человека, получаемых для изучения их структуры и функции: белки различных рецепторов, выделение которых из организма в достаточных для изучения количествах затруднительно. Выбирают клетки насекомых потому что на этих клетках хорошо изучены ДНК-содержащие вирусы этих организмов – бакуловирусов. Эти вирусы применяются для биологического контроля за численностью насекомых-вредителей в лесном и сельском хозяйстве. Механизм их репродукции закулючается в: После попадания вириона бакуловирусов в клетку эпителия кишечника насекомого он проникает в ядро, где и происходит освобождение двунитевой ДНК из белкового капсида. В ядре происходит репликация этой ДНК, затем экспрессия генов, образование новых вирусных частиц. Некоторая часть вновь образовавшихся вирионов отшнуровывается от клеток и гемолимфой насекомого разносится по организму животного, но большая часть собирается в компактную структуру внутри клетки и покрывается специальной оболочкой, состоящей в основном из белка полиэдрина. За счет активных вирусов, распространяющихся по организму, постепенно происходит накопление таких полиэдриновых частиц во многих клетках организма насекомого и через 5-6 дней после заражения насекомое погибает. 6. введение в зиготы и эмбриональные стволовые клетки млекопитающих искусственных дрожжевых хромосом Это делается методом микроинъекций в мужской пронуклеус. Так были получены мыши, несущие 5 функциональных генов β-гемоглобина человека (введенный фрагмент имел протяженность 250 т.п.н.), и мыши, способные продуцировать человеческие антитела. В последнем случае собственные гены мышей, кодирующие легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов были «нокаутированными» двумя вставками: кластера генов Н-цепей человека, включающего 4 V-гена, 16 D-генов, 6 J-генов и всех генов С γ и С μ ; и кластера, содержащего 4V κ -гена, 5 J κ -генов и С κ -ген. Уже даже такие мыши синтезировали человеческие антитела в ответ на введение в их организм некоторых антигенов и были даже получены гибридомы на основе их В-лимфоцитов. Из-за того что разнообразие таких антител было ограничено в ES-клетки мышей обычной линии методом слияния клеток (бактериальных протопластов с клетками мыши) была введена искусственная дрожжевая хромосома размером 1000 т.п.н., содержащая 66 V H -генов, 30 D H -генов, 6 J H -генов и все гены цепей μ, δ, и γ (эта хромосома была сделана путем обединения 4 ранее созданных YAC). Одновременно в другие ES-клетки этой же линии мышей ввели созданную из трех уже существовавших YAC хромосому размером 800 т.п.н. с 32 V κ -генами, 5 J κ -генами и С κ -геном. Затем путем микроинъекций в бластоцисту получили две отдельных линии мышей: с «YAC легких цепей» и с «YAC тяжелых цепей». Мышей из каждой линии скрещивали с мышами линии с «нокаутироваными» генами собственных иммуноглобулинов и путем инбридинга добились получения чистых линий, у которых не экспрессировались мышиные иммуноглобулины (надо было освободиться от локусов, внесенных мышами с YAC). И наконец, при аутбридинге мышей уже этих последних чистых линий были получены мыши, которые в ответ на введение трех очень разных антигенов дали полноценные человеческие антитела и полученные на основе их клеток мышиные гибридомы были использованы для получения человеческих моноклональных антител. 7. вирус табачной мозаики BTM Геном вируса табачной мозаики представляет собой одноцепочечную +РНК и кодирует 4 белка: белок, обеспечивающий системное распространение, белок оболочки и две РНК-зависимые РНК-полимеразы . Оболочка вирусной частицы ВТМ состоит из одинакового белка, причем для сборки капсида более важными являются определенные его участки. Это и открыло возможности для введения небольших по размерам фрагментов ДНК в ген белка оболочки. Один из подходов в рамках этой стратегии – это удлинение белка за счет снятия терминирования транскрипции. Она была установлена сразу за стоп-кодоном белка оболочки и к ней присоединена последовательность, кодирующая пептид из 12 аминокислот - ингибитор ангиотензипревращающего фермента млекопитающих, имеющий применение в лечении гипертонии. Потом вводили такую конструкции в клетки табака и томатов. Позже из структуры бека оболочки вируса был выявлен небольшой участок, называемый поверхностная петля. При сборке вирусной частицы этот участок не задействован и находится на поверхности капсида. Встройка в этот район антигенной детерминанты малярийного плазмодия позволила создать химерный вирус. был реализован еще один подход, который позволяет получать большое количество свободного белка при экспрессии с вирусных векторов на основе ВТМ. Для этого сразу после промотора белка оболочки встроили полилинкер для вставки целевого гена и вслед за ним промотор из другого штамма ВТМ, с которого и транскрибируется собственно белок оболочки. C такого гибридного вектора TMV-30B экспрессировали полноразмерный белок VP1 вируса ящура, а не отдельные антигенные детерминанты в составе белка оболочки. Введение белкового экстракта листьев табака лабораторным животным вызывало развитие эффективного иммунного ответа против ящура. этот вектор был усовершенствован введением последовательности, кодирующей 7 остатков гистидина, которые будут прикреплены к С-концу экспрессируемого белка. С помощью такого вектора были получены очищенные препараты белка VP8 ротавируса крупного рогатого скота. 12. Доказательства плазмидной локализации генов, обуславливающих способность агробактерий колонизировать растение. Для получения локализованных на Ti-плазмидах мутаций использовали два подхода. Один из них называется делеционное картирование: клонирование определённых фрагментов Ti-плазмид на векторах Е.coli => рестрикция и лигирование => получение укороченных вариантов клонированных последовательностей => перенос плазмид с укороченной последовательностью в клетки агробактерий, содержащие изучаемую Ti-плазмиду => отбор клонов, к которых исходных фрагмент заменился на укороченных в результате гомологичной рекомбинации. Второй подход базировался на использовании инсерционного мутагенеза, суть которого состоит в интеграции бактериальных транспозонов, несущих гены антибиотикоустойчивости, в ДНК Ti-плазмид (локализация инсерционного гена определяется путём сравнения рестрикционных фрагментов исходной плазмиды и плазмиды с инсерцией). Для введения транспозонов в ДНК Ti-плазмид использовали несколько методических приемов: 1. Получение инсерций транспозона во фрагмент Ti-плазмиды, клонированный в клетках Е.coli,и последующая рекомбинационная замена немутантного фрагмента на мутированный в клетках Agrobacterium tumefaciens. 2. Получение инсерций транпозонов непосредственно в Ti-плазмиды в клетках Е.coli. Плазмида широкого круга хозяев (группы несовместимости IncP и IncW) вводится в агробактерию с Ti-плазмидой => образование коинтерграта введённой и резидентной плазмид => передача коинтеграта посредством конъюгации в клетки Е.coli (поддерживается в колях за счёт репликона плазмиды с широким кругом хозяев), в хромосоме которых локализован транспозон => перемещение транспохона в ДНК коинтеграта => возвращение кострукции в Agrobacterium tumefaciens. 3. Получение инсерций транпозонов в ДНК Ti-плазмид непосредственно в клетках Agrobacterium tumefaciens. Для этого в клетки агробактерий вводили неспособные реплицироваться в них плазмиды, содержащие транспозон, и культивировали эти клетки на средах с антибиотиком, устойчивость к которому определяется транспозоном. Проверка антибиотикорезистентных клонов агробактерий на наличие изучаемых свойств позволяла отобрать мутанты с определенным фенотипом. Применение транспозонового мутагенеза и делеционного картирования позволило точно установить, какие свойства агробактерий определяются плазмидными генами и определить относительное расположение этих генов в пределах плазмидной ДНК. К 1988 году былом установлено, что локализованные на Ti-плазмидах Agrobacterium tumefaciens гены определяют: 1) способность агробактерий индуцировать образование опухоли на инфицированном растении; 2) состав опинов, вырабатываемых клетками опухоли; 3) способность агробактерий использовать опины в качестве источников С, N и энергии; 4) чувствительность к агроцину К84 – бактериоцину нуклеотидной природы, продуцируемому Agrobacterium rhizogenes К84 (характерно только для плазмид нопалинового типа); 5) ограничение развития бактериофага Ар1; 6) конъюгативный перенос Ti-плазмид в клетки Agrobacterium и Rhizobium; 7) способность к автономной репликации и несовместимость с близкородственными плазмидами в клетках Agrobacterium и Rhizobium. |