зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий
 Скачать 135.64 Kb.
|
|
Билет 24. 1)векторные системы на основе ретровирусов. Основой для получения ретровирусных векторов являются ретровирусы мыши. Их геном состоит из двух одинаковых одноцепочечных молекул РНК, которая функционально разделена на шесть областей: 1) 5’-LTR 2) не кодирующую белков, но ответственную за упаковку РНК капсид область пси+ 3) кодирующую три белка внутренней оболочки капсида (gag); 4) кодирующую обратную транскриптазу и интегразу (pol); 5) кодирующую белок оболочки (env); 6) 3’-LTR Жизненный цикл вируса заключается в синтезе комплементарной ДНК на матрице геномной РНК сразу же после проникновения вириона в клетку и разрушения его капсида. Жизненный цикл этого вируса заключается в синтезе кДНК на матрице геномной РНК сразу после проникновения вириона в клетку и разрушения его капсида. Затем кДНК транспортируется в ядро. После встраивания промотоа осуществляется транскрипция, и вновь синтезированные РНК перемещаются в цитоплазму, после трансляции появляются белки Gag, Pol и Env. Часть молекул РНК не транслируется, а упаковывается в формирующиеся капсиды вместе с молекулами обратной транскриптазы. Сформированные вирионы освобождаются из клетки–хозяина и могут в дальнейшем инфицировать новые клетки. Для создания ретровирусных векторов кДНК генома вируса объединили с ДНК стандартной плазмиды pBR322 E.coli и получили «обезоруженные» укороченные варианты, лишенные областей env, pol и части области gag. Вставку ДНК чужеродного гена осуществляют в стык с оставшейся частью области gag. ДНК такого гибридного вируса можно вводить в клетки методом электропорации. Была разработана система упаковки гибридных вирусных молекул в капсиды . Для этого используют специальную линию клеток мыши, в геноме которых присутствуют два укороченных варианта ретровируса. Один из вариантов представляет собой последовательность 5’-LTR + gag + 3’-LTR, второй - 5’-LTR + pol, env + 3’-LTR, т.е. оба варианта лишены необходимой для упаковки РНК в капсид области пси. В клетках такой линии синтезируются все необходимые для построения капсида белки и обратная транскриптаза, но формирующиеся капсиды остаются пустыми. Если в такие клетки дополнительно ввести несущий чужеродную генетическую информацию ретровирусный вектор, в котором имеется пси+-область, происходит упаковка РНК вектора, т.е. гибридной. 2) Получение ГМ-растений устойчивых к атразину(гербицид) Атразин является ингибитором процесса фотосинтеза. Способен подавлять процесс нециклического фотофосфорилирования, присоединяясь к тиллакоидным мембранам и блокируя перенос электронов ко вторичному акцептору электронов белку Qβ. Этот белок кодируется локализованным в пластидной ДНК геном psbA. Сравнение гена psbA из обычных растений и из устойчивого к атразину сорного растения Amaranthus hybridus показало, что мутантные варианты отличаются либо заменой остатка серина-228 на глицин, либо валина-219 на изолейцин, либо фенилаланина-225 на тирозин. Кодирующий белок ген был объединен с последовательностью из гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы гороха (rbcS), и эта конструкция под промотором нопалинсинтазы была введена в клетки табака с помощью агробактериальной векторной системы. Полученное трансгенное растение табака было резистентно к атразину. Далее было показано, что источниками генов, придающих устойчивость к гербициду не обязательно должны быть высшие растения. Путем культивирования на средах гербицидом были отобраны устойчивые к диурону и атразину мутанты цианобактерии Anacystis nidulans такие же мутанты одноклеточной эукариотической водоросли Chlamidomonas reinhardii. Из них были отклонированы гены psbA и также показана возможность их экспрессии в клетках растений табака. Билет 25 1) Молекулярные механизмы транспорта Т-ДНК в клетки растений Перенос Т-ДНК в растительную клетку осуществляется продуктами плазмидных vir-генов. Для формирования канала, пронизывающего оболочку бактериальной клетки, и так называемого Т-пилюса, продлевающего этот канал непосредственно до цитоплазмы растительной клетки, необходимы VirВ-белки. Сначала с помощью белка VirВ8 белок VirВ1выводится через цитоплазматическую мембрану в периплазматическое пространство и начинает перестройку пептидогликанового слоя в данном месте. Затем белки VirВ4, VirВ10 и VirВ11 встраиваются во внутреннюю мембрану рядом с белком VirВ8, что способствует выходу в периплазму гетеродимера из белков VirВ7-VirВ9 и дальнейшему расщеплению пептидогликана. От белка VirВ1 отщепляется фрагмент VirВ1*, который закрепляется в наружной мембране, определяя место формирования Т-пилюса. Гетеродимеры VirВ7-VirВ9, благодаря наличию в белке VirВ7 липидного компонента, закрепляются в наружной мембране таким образом, чтобы белок VirВ9 был направлен в периплазматическое пространство. Белки VirВ3 и VirВ5 также связываются с наружной мембраной в месте закрепления VirВ7 и создают условия для сборки циклических олигомеров из белка VirВ2 и формирования из них Т-пилюса. Во внутреннюю мембрану дополнительно встраиваются VirВ6 и VirD4, а новые молекулы VirВ9 связываются между собой и с молекулами VirВ11 так, чтобы образовался сплошной канал, соединяющий внутреннюю и наружную мембраны. Продолжением этого канала является полый Т-пилюс, пронзающий в конечном итоге цитоплазматическую мембрану растительной клетки. Тем самым формируется путь, соединяющий цитоплазмы двух клеток и позволяющий в один этап транслоцировать из бактериальной клетки в растительную субстраты системы секреции типа IV (T4SS) - белки и нуклеопротеины. Параллельно в клетках осуществляется процессинг Т-ДНК. Суть: формирование Т-комплекса. С Т-ДНК Тi-плазмид взаимодействуют белки VirС1, VirD1(нужны для прикрепления VirD2 к концевым повторам Т-ДНК) и VirD2(основной). Эндонуклеаза VirD2 делает надрез одной нити ДНК и начинается остоединение этой нити от комплементарной ей в направлении левого концевого повтора. Одновременно заполняются образующейся в Т-ДНК бреши новыми нуклеотидами. Отделившейся нить с VirD2-белком на 5’-конце представляет собой Т-комплекс,который направляется к секреторному каналу системы секреции типа 4. Из-за VirD4 Т-комплекс поступает в канал системы екреции типа 4 и транспортируется в цитоплазму растительной клетки. Так же переносятся белки VirE2,VirE3,VirF. VirЕ3-считается вспомогательным белком. Молекулы VirЕ2 присоединяются к Т-комплексу по всей длине,защищаяоднонитевую ДНК от расщепления растительными эндонуклеазами и совместно с VirD2 определяют транспорт Т-комплекса в ядро. Далее VirЕ2 связывается с двумя растительными белками VIP1 и VIP2. Эти белки определяют перемещение Т-комплекса из цитоплазмы в нуклеоплазму. Далее VirD2 и VirЕ2 участвуют в процессе интеграции Т-ДНК в хромосомную ДНК растения. 2) Получение и направления использования трансгенных свиней Хотят разработать и осуществить трансгеноз свиньи с целью использования органов таких животных для пересадок человеку. Но почти сразу же после пересдаки идет гиперострое отторжение. Оно вызывается осаждением антител на поверхности клеток пересаженного органа и активацией вследствие этого системы комплемента по классическому пути, что, естественно, моментально разрушает клетки. На модели обезъян выяснилось, что основным антигеном, который вызывает образование антител является углеводный компонент поверхностных белков клеток свиньи. Для того что бы это преодолеть можно «подобраться» к генам свиньи, кодирующим поверхностные антигены и изменить их так, чтобы убрать этот углеводный компонент. Так же можно ввести в геном свиньи гены человека, контролирующие образование ингибиторов системы комплемента, защищающих собственные клетки от его действия. Еще были получены свиньи, продуцирующие человеческий гемоглобин. В этом случае в геном свиньи ввели два гена α-цепи гемоглобина человека, один ген β-цепи гемоглобина и регуляторную область гена β-цепи под промотором свиного гена β-цепи гемоглобина. Перспективы применения таких свиней – приготовление из их крови компонентов кровезаменителей. В сельскохозяйственном аспекте пытались получить породу быстрорастущих мясных свиней путем введения гена бычьего гормона роста. Трансгенные животные быстрее росли, но у них обнаруживались язвы желудка и кишечника, почечная и сердечная недостаточность, воспаления суставов и снижение защитных свойств слизистой оболочки дыхательных путей. Билет 26 1)вироиды Вироиды это группа векторов, дающих множество копий вводимой генетической информации. Они являются возбудителями болезней некоторых видов растений и представляют собой небольшие молекулы РНК. Эти РНК способны воспроизводиться в сравнимом с вирусами количестве копий и распространяться по растению при полном отсутствии капсида, что и привлекло к ним внимание специалистов по генетической инженерии. РНК вироидов является однонитевой ковалентно замкнутой кольцевой молекулой, которая из-за комплементарности большей части последовательности представляет собой суперскрученную палочковидную структуру с небольшими шпилькообразными выступами. Инфицирование растений РНК вироидов легко осуществляется механической инокуляцией, например втиранием в листья. В круг хозяев вироидов входят как широко распространенные сельскохозяйственные растения (картофель, томаты, баклажан, яблоня, груша, слива, виноград), так и такие тропические и субтропические культуры, как кокосовая пальма, авокадо, цитрусовые, персик. Известны и вироиды, поражающие декоративные культуры – колеус и хризантемы. К настоящему времени описаны 27 видов вироидов, принадлежащих к восьми родам и двум семействам. Самым обширным является семейство Pospiviroidae (23 вида), типовым для него признан наиболее изученный вироид веретенобразности клубней картофеля - PSTVd (от англ. potato spindle tuber viroid). Остальные виды входят в семейство Avsunviroidae, названное по типовому вироиду солнечного ожога (пятнистости) авокадо – ASBVd (от агл. avocado sunblotch viroid). Вироиды отличаются от вирусов тем, что могут передаваться в рядах поколений через пыльцу и семена. 2)получение антител из растений Сложность создания растений, которые бы продуцировали антитела в норме присутствующие в секретах слизистых оболочек ротовой полости, заключалась в в том, что молекула секреторного иммуноглобулина состоит из 4-х различных белковых цепей (H-цепь, L-цепь, J-цепь и секреторный компонент), кодируемых различными нуклеотидными последовательностями. Исследователи создали четыре отдельных линии растений табака, продуцирующих один из необходимых белков. Все 4 гена под промотором 35S РНК CaMV были по отдельности вставлены в плазмиду pMON 530, эти плазмиды перенесены в клетки Agrobacterium tumefaciens, несущие плазмиду-помощник (система бинарных векторов), и этими агробактериями были обработаны изолированные клетки листьев табака. Далее было получено 4 линии растений. Каждая подверглась самоопылению. И далее скрестили растения несущих легкие и тяжелые цепи. Полученное потомство продуцировало IgG-IgA, состоящий из тяжелых и легких цепей. Ттакое растение скрестили с растением, содержащим ген j-цепи. В клетках такого гибридного потомства обнаруживался белок с массой около 400 кД, соотвествующей димеру. Далее растение,продуцирющее димеры, скрестили с растением, несущим ген секреторного компонента. В клетаках полученного растения обноружили мономерные и димерные антитела и белки с массой около 470 кД, что приблизительно соответствовало секреторному иммуноглобулину. Анализ белка из клеток потомков показал, что без J-цепи не образуются ни димерные формы, ни комплексы из секреторного компонента и иммуноглобулина. Антитела могут быть использованы не только для терапии или профилактики инфекционных болезней, но и для терапии раковых заболеваний. Одна биотехнологическая фирма имеет трансгенную сою сорта BR96, дающую моноклональные антитела, специфичные к антигенам раковых клеток. Их хотят использовать для лечения рака яичников, рака легких и рака толстой кишки. Билет 27 1) Общие требования, предъявляемые к векторным молекулам, пригодным для введения генетической информации в геном растений. Соответствие природных Ti-плазмид этим требованиям. Вектор в биологическом смысле – это молекула нуклеиновой кислоты, обеспечивающая введение наследственной информации в клетки и создание условий для ее выражения и поддержания в ряду поколений того или иного вида организмов. Векторы должны соотвествовать общим требованиям. Первое требование – введение. (Ti-плазмиды соответствуют) Процесс трансформации обычных растительных клеток в опухолевые заключается в переносе Т-ДНК в растительную клетку с помощью специализированных белков. Введенная в растительную клетку Т-ДНК доставляется в ядро и встраивается в хромосомы растительных клеток. Второе требование – создание условий для реализации введенной генетической информации. (Ti-плазмиды соответствуют) Трансформированные клетки растений вырабатывают гормоны роста и опины. Возникающие в результате деления таких клеток дочерние клетки продолжают выделять цитокинины и опины, а, значит, обеспечивается и третье требование – стабильное поддержание введенной генетической информации. (Ti-плазмиды соответствуют) возникающее в результате деления трансформированных клеток дочерние клетки продолжают выделять цитокинины и опины. Этим и обеспечивается это требование. Четвертое требование-Вектор так же не должен препятствовать регенерации растения из отдельных растительных клеток и его размножению вегетативным и семенным путем. (Ti-плазмиды соответствуют) Пятое требование- векторная емкость. (Ti-плазмиды соответствуют) Это значит что, количество генетической информации, которое может нести вектор без нарушения его основных свойств – способности эффективного введения и стабильного наследования. Шестое требование -хозяйская специфичность. (Ti-плазмиды соответствуют) Желательно что бы вектор можно было вводить в любые растения. Седьмое требование – вектор не должен вызывать патологического состояния в трансформированном организме природные. Ti-плазмиды не соответствуют. 2) Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC) Saccharomyces cerevisiae. Используется для вставок больших фрагментов (более 100 т.п.н.) ДНК. Они широко применяются для физического картирования ДНК высших эукариот, включая человека. В упрощенном виде плазмида для получения искусственных дрожжевых хромосом (pYAC) представляет собой: 1) фрагмент pBR322 (Ampr, oriE); последовательность, обеспечивающую автономную репликацию линейных молекул в клетках дрожжей (ARS); 2) последовательность, соответствующую центромерной области дрожжевой хромосомы (CEN); 3) гены биосинтеза аминокислот и азотистых оснований в дрожжевых клетках (TRP1 и URA3); 4) две теломерные области дрожжевой хромосомы (Т); 5) уникальный сайт рестрикции (например, для SmaI) и 2) два тоже уникальных (сайта рестрикции для другой рестриктазы, (BamHI-сайты). ДНК такой плазмиды, выделенная из E.coli, подвергается обработке двумя рестриктазами и щелочной фосфатазой (последнее необходимо, чтобы не образовывались вновь кольцевые молекулы – щелочная фосфатаза отщепляет фосфатные группы с 5’-концов, а без них ДНК-лигаза не соединяет молекулы). ДНК организма, последовательности которого хотят клонировать в дрожжах, обрабатывают рестриктазой, для которой в pYAC имелся только один уникальный сайт, и смешивают с фрагментами плазмиды. В результате лигирования получаются линейные молекулы с теломерными последовательностями по концам, которые после введения в клетки дрожжей, дефектных по тем генам синтеза аминокислот и оснований, которые имеются в плазмиде, поддерживаются как автономные хромосомы. Для подтверждения наличия вставки часто используют какой-либо маркерный ген, продукт которого дает цветную реакцию. В этом случае такой ген располагается так, чтобы вставка по уникальному сайту нарушала его рамку считывания, и на специальной среде отбираются неокрашенные колонии. Билет 28 1) растения устойчивые к биалофосу. Биалофос - гербицид, продуцируемый стрептомицетами двух видов: Streptomyces hygroscopiсus и Streptomyces viridochromogenes. Это соединение представляет собой трипептид, состоящий из двух остатков L-аланина и остатка фосфинотрицина.Когда биалофоса попадает в растительную клетку происходит его распад (за счет пептидаз) и освобождается фосфинотрицин, который инактивирует глютаминсинтетазу. В настоящее время используется аналог фосфинотрицина-глюфозинат аммония. Эти стрептомицеты не чувствительны к фосфинотрицину, поскольку образуют фермент фосфинотрицинацетилтрансферазу, снимающий токсическое действие фосфинотрицина путем его ацетилирования. У Streptomyces hygroscorpius кодирующий такой фермент ген получил название bar, а у Streptomyces viridochromogenes – pat. Линии гербицидоустойчивых сортов рапса, турнепса, сахарной свеклы, сои, кукурузы, цикория содержат ген bar, а трансгенный рис – ген pat. 2) клонирование млекопитающих Для получения трансгенный мышей используется метод микроинъекций. Для его реализации у самок белых мышей стимулируют овуляцию путем введения сыворотки беременной лошади и через 48 часов – хорионического гонадотропина человека, в результате чего в яичниках мыщи образуется более 30 яйцеклеток вместо обычных 5-10. Затем осуществляют скрещивание таких самок с самцами и их быстрое умерщвление для вымывания оплодотворенных яйцеклеток из яйцеводов. С использованием микроманипулятора, под микроскопом поочередно фиксируют каждую клетку и с помощью инъекционной пипетки в ядро слившегося с яйцеклеткой сперматозоида вводится суспензия молекул ДНК, содержащих необходимую генетическую информацию. Когда ядро яйцеклетки и ядро сперматозоида сливаются и получается полноценная зигота, она микрохирургическим путем имплантируется в матку так называемой суррогатной матери - самки, которая была перед этим скрещена с самцом у которого в семенной жидкости нет сперматозоидов. В матку одной самки вводят от 25 до 40 зигот, для того, чтобы хотя бы часть из них имплантировалась нормально, и началось дальнейшее развитие эмбрионов. Через три недели рождается трансгенное потомство, которое оценивается в дальнейшем на наличие введенных генов и выраженность желаемого признака. |