зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий
 Скачать 135.64 Kb.
|
|
45. Триазины и производные фенилмочевины (диурон) как ингибиторы фотосинтеза Наиболее широко применяемыми ингибиторами фотосинтеза являются симметричные S-триазины (атразин, симазин) и производные фенилмочевины (диурон). Эти вещества способны подавлять процесс нециклического фотофосфорилирования, присоединяясь к тиллакоидным мембранам и блокируя перенос электронов ко вторичному акцептору электронов белку Q β . Этот белок кодируется локализованным в пластидной ДНК геном psbA. Сравнение гена psbA из обычных растений и из устойчивого к атразину сорного растения Amaranthus hybridus (такие растения были обнаружены на полях, где атразин применялся более десятка лет) показало, что мутантные варианты отличаются либо заменой остатка серина в 228 положении на остаток глицина, либо заменой валина в положении на изолейцин, либо фенилаланина-225 на тирозин. Несмотря на то, что такой мутантный белок имел несколько сниженную по сравнению с белком дикого типа биологическую активность, кодирующий его ген был объединен с последовательностью из гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы гороха (rbcS), кодирующей транзитный пептид, и эта конструкция под промотором нопалинсинтазы была введена в клетки табака с помощью агробактериальной векторной системы. Полученное трансгенное растение табака было резистентно к атразину. Эта работа, выполненная в 1984 году, была первой работой, показавшей возможность введением одного гена придать растению хозяйственно полезный признак. Далее было показано, что источниками генов, придающих устойчивость к гербициду не обязательно должны быть высшие растения. Путем культивирования на средах гербицидом были отобраны устойчивые к диурону и атразину мутанты цианобактерии Anacystis nidulans такие же мутанты одноклеточной эукариотической водоросли Chlamidomonas reinhardii. Из них были отклонированы гены psbA и также показана возможность их экспрессии в клетках растений табака. 47. Характеристика опинов. Биохимические исследования корончатых галлов привели к обнаружению, что клетки опухоли синтезируют и выделяют в окружающую среду особые вещества, получившие название опины (первые сведения в 1956г). Было установлено, что химическая структура опина определяется не растением, а вызывающими опухоль бактериями – при заражении одним и тем же штаммом Agrobacterium tumefaciens различных видов растений в опухолях обнаруживали одинаковый опин (1960 г, Жорж Морель). Более того, каждый определяющий продукцию того или иного опина штамм использовал именно этот опин в качестве источника азота и углерода. В то же время растительные клетки использовать такие соединения в своем обмене веществ не способны. По химической природе большинство опинов являются производными аминокислот, к которым в реакциях конденсации присоединяются либо кетокислота, либо сахар. Этот класс опинов разделяется на три основных семейства: октопиновое семейство АК + пируват - лизопин(измененный лизин), октопин(октоп.к-та) нопалиновое семейство АК + альфа-кетоглютарат - нопалин, нопалин.к-та. агропиновое семейство АК + манноза - агропин, маннопин. Всего известно около 30 опинов, причем некоторые из них обнаруживаются только в индуцируемых агробактериями опухолях (хризопин, кукумопин, гелиопин, метиопин). Известны и опины, не выявляемые в индуцированных агробактериями опухолях: аланопин, тауропин, эпилейцинопин, изолейцинопин, валинопин, фенилаланинопин. Еще одно соединение – сахаропин является одним из промежуточных продуктов метаболизма лизина у грибов, высших растений и млекопитающих, включая человека, но он не накапливается в тканях в норме. Кроме опинов, являющихся производными аминокислот, в большинстве вызываемых агробактериями опухолей обнаруживаются необычные производные сахаров, которые называются агроцинопины. Все они представляют собой фосфодиэфиры моно- и дисахаридов. Известно четыре разновидности агроцинопинов: - агроцинопин А – фофсофдиэфир сахарозы и L-арабинозы; - агроцинопин В – фософдиэфир фруктозы и L-арабинозы; - агроцинопин С – фосфодиэфир сахарозы и D-глюкозы; - агроцинопин D – фосфодиэфир двух молекул D-глюкозы. Образование опинов этой группы также является специфичным. Как правило, агроцинопины А и В обнаруживаются в опухолях совместно с опинами нопалинового семейства, тогда как агроцинопины С и D – агропинового. Эти вещества также используются бактериями, вызывающими образование опухоли, в качестве источников углерода и энергии. Утилизация опинов агробактериями осуществляется за счет наличия у них специализированных белков, обеспечивающих транспорт опина в бактериальную клетку и затем гидролиз их до обычных соединений, которые используются в общих путях метаболизма бактериальной клетки. Например, для использования октопина у конкретных штаммов агробактерий имеются октопинпермеаза и октопиноксидаза, синтез которых индуцируется октопином и другими опинами этого семейства. Они создают внутри индуцированных ими опухолей специфическую экологическую нишу, в которой нет подходящих условий для обитания популяций других видов и, следовательно, нет конкуренции с их стороны. 1. Клеточная и генетическая инженерия как одно из направлений развития современной биологии, история его развития. Клеточная инженерия — создание клеток нового типа на основе их гибридизации, реконструкции и культивирования. В узком смысле слова под этим термином понимают гибридизацию протопластов или животных клеток, в широком — различные манипуляции с ними, направленные на решение научных и практических задач. Генетическая инженерия (генная инженерия) — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Осуществляемое под воздействием человека изменение свойств организмов началось во времена перехода первобытного человека от охоты и собирательства к выращиванию растений и разведению животных для удовлетворения собственных нужд. Проводимый в течение нескольких тысячелетий бессознательный искусственный отбор привел к появлению культурных растений и домашних животных, отличающихся от своих диких предков наличием хозяйственно-полезных признаков. Затем возникший в результате развития наук методический искусственный отбор дал к середине 20-го века огромное многообразие сортов и пород, но все эти отобранные человеком варианты являлись лишь закреплением в рядах поколений изначально создаваемых природой свойств. И только с появлением технологии получения рекомбинантных ДНК и разработкой методов их введения в наследственный материал различных организмов такой методический подход получил реальное воплощение. Основанием для создания и реализации такого подхода стали доказательства роли нуклеиновых кислот как носителей генетической информации, выяснение принципов ее кодирования и экспрессии, разработка методик манипулирования. Фактически, за 20 лет с момента опубликования работы Дж. Уотсона и Ф. Крика (1953 год) до опубликования работ Стэнли Коена и его коллег (1973 год), сообщавших о направленном получении молекул ДНК, объединяющих фрагменты нуклеиновых кислот бактерий и вируса обезьян, молекулярная биология прошла путь от чисто теоретической науки до технологии, получившей название генетическая инженерия. Практическое применение генетической инженерии началось с использования генетически измененных прокариотических организмов, но к началу 80-х годов были получены первые генетически модифицированные растения (рекомбинантные технологии). Именно такие эукариотические организмы получили название трансгенных, то есть полученных путем направленного переноса в их хромосомы генов других организмов. Основанием для разработки основного метода получения трансгенных растений стало открытие в 1977 году ранее неизвестного варианта симбиотических отношений, получившего название генетическая колонизация хозяина. Такой способ взаимодействия со своими хозяевами осуществляют бактерии рода Agrobacterium, вызывающие заболевания растений из класса Двудольные. Именно они, единственные из известных организмов, способны осуществлять естественным путем трансформацию растительных клеток путем введения в их хромосомы специальных фрагментов ДНК, что широко используется в биотехнологии. 52. Отличия опухолевых клеток растения от обычных. все они отличаются от вызываемых другими бактериями опухолей так называемым неограниченным ростом. Галлы, развивающиеся под воздействием других организмов, перестают увеличиваться в размерах после удаления вызвавшего их появления фактора, а корончатый галл, бородатый корень и стеблевой галл сохраняют способность к росту и после исчезновения бактерий из этих опухолей. Более того, изолированные из таких опухолей растительные клетки продолжают делиться на питательных средах, не содержащих фитогормонов, что поначалу послужило основанием для появления такого термина, как гормоннезависимый рост. Биохимические исследования тканей корончатых галлов и полученных из них культур клеток (60-70-х года) показало, что в вызванных Agrobacterium tumefaciens опухолях присутствуют ауксин индолилуксусная кислота (ИУК) и цитокинин трансзеатин. Т.е. клетки корончатых галлов, в отличие от обычных паренхиматических клеток растения, постоянно продуцируют значительные количества фитогормонов. Из этого следовало, что воздействие агробактерий на клетки растения-хозяина приводит к стабильному изменению процессов жизнедеятельности, которое является наследственно закрепленным. Клетки опухоли синтезируют и выделяют в окружающую среду особые вещества, получившие название опины. Основные работы по выяснению химической структуры опинов в те годы проводились в Национальном институте агрохимических исследований в Версале (Франция) под руководством Жоржа Мореля. В его лаборатории было установлено, что химическая структура опина определяется не растением, а вызывающими опухоль бактериями (при заражении одним и тем же штаммом Agrobacterium tumefaciens различных видов растений в опухолях обнаруживали одинаковый опин). Более того, каждый определяющий продукцию того или иного опина штамм использовал именно этот опин в качестве источника азота и углерода. В то же время растительные клетки использовать такие соединения в своем обмене веществ не способны. 41. Гербициды хлорсульфурон и сульфометуронметил ингибиторы биосинтеза синтеза разветвленных аминокислот 3) Ингибиторы биосинтеза разветвленных аминокислот. Гербициды хлорсульфурон и сульфометуронметил (производные сульфонилмочевины) - ингибиторы биосинтеза синтеза разветвленных аминокислот (изолейцина и валина). Сходным действием обладают и имидазолиновые гербициды. Мишенью для всех гербицидов с таким механизмом действия является изофермент II ацетолактатсинтетазы (ALS II) – первый фермент пути биосинтеза изолейцина и валина. У растений кодирующие ALS II гены имеют хромосомную локализацию, но продукт их трансляции имеет транзитный пептид для транспортировки в хлоропласты. Для создания растений, устойчивых к гербицидам этой группы, путем селекции на средах с этими веществами были получены мутанты бактерий (Salmonella typhimurium), дрожжей (Sacharomyces cerevisiae), а также клеточные линии Nicotiana tabacum и Arabidopsis thaliana. В допущенных до коммерческого использования сортах нашли применение гены из арабидопсиса (усточивый к имидазолинам рис) и табака (одна из линий трансгенной кукурузы). Во всех этих случаях методами генетической инженерии в растениях заменяли чувствительный к гербициду белок (мишень) на устойчивый. Еще одна возможность сделать растение резистентным – это придать ему способность разрушать или химически модифицировать поступающие в клетку молекулы гербицида так, чтобы они не могли оказывать свое губительное действие. Это второе стратегическое направление кажется более предпочтительным с точки зрения уменьшения засоренности почв гербицидами, но для его реализации необходим поиск особых специфических генов. Успешно реализовать такой подход в создании резистентности удалось в отношении фосфинотрициновых гербицидов. 36.Улучшенная система получения рекомбинантных бакуловирусов с помощью Bsu36I-рестрикции. В геном AcMNPV ввели уникальный сайт для рестриктазы Bsu36I и в клетки насекомых вводили вирусную ДНК после ее обработки этой рестриктазой. Репродукция вируса происходила только лишь в некоторых клетках, где, происходило случайное закольцовывание вирусной ДНК. Но если вместе с линеаризованной ДНК вируса вводить кольцевую ДНК вектора, в которой есть сайты для гомологичной рекомбинации с ДНК вируса (т.е. обычный вектор для экспрессии), то в результате рекомбинации резко увеличивается количество кольцевых молекул, что, естественно, приводит к репродукции вируса и формированию зон лизиса на газоне культуры. Эффективность отбора рекомбинантных вариантов при применении такого подхода повысилась с менее 1% до 30%. Эта система была улучшена за счет введения еще одного сайта для рестриктазы Bsu36I в один из генов, ответственных за репликацию ДНК вируса. Причем оба сайта для Bsu36I локализовались слева и справа от структурного гена полиэдрина в открытых рамках считывания ORF603 и ORF1629, в результате чего обработка этой рестриктазой приводила к полному удалению из ДНК вируса последовательности гена полиэдрина. Одновременно была получена векторная молекула на основе репликона pBR322, в составе которой имелись последовательности, соответствующие ORF603 и ORF1629, фланкирующие участок, состоящий из промотора гена полиэдрина, полилинкера и сайта терминации-полиаденилирования этого же гена. При включении в вектор какого-либо гена по уникальным сайтам рестрикции полилинкера формируется система экспрессии этого гена в клетках насекомых. Одновременная трансфекция клеток насекомого обработанной Bsu36I ДНК вируса и ДНК такого вектора приводит к гомологичной рекомбинации этих ДНК по последовательностям ORF603 и ORF1629 и формированию за счет этого несущего нужный ген рекомбинантного бакуловируса. Наличие в векторе обширных областей гомологии с вирусной ДНК повысило выход рекомбинантов до 99%. 39.Векторные системы для введения генетической информации в клетки млекопитающих на основе микрохромосом Разработка микрохромосом ведется на основе объединения теломерных, центромерных последовательностей и точек инициации репликации. В работе Harrington, Bokkelen, Mays, Gustashow, Willard (Nat. Genet., 1997) продемонстрировано получение трех вариантов микрохромосом: 1) получен путем укорочения исходной хромосомы; 2) укорочение + замена центромерной области на другую, введенную путем трансфекции; 3) лигирование in vitro всех трех областей и затем введение этой конструкции в клетки. 41.Методы введения генетической информации в организм млекопитающих: введение в мужской пронуклеус Последний метод, получивший название метода микроинъекций, несмотря на технические сложности и трудоемкость, получил наибольшее распространение. Для его реализации у самок белых мышей стимулируют овуляцию путем введения сыворотки беременной лошади и через 48 часов – хорионического гонадотропина человека, в результате чего в яичниках мыщи образуется более 30 яйцеклеток вместо обычных 5-10. Затем осуществляют скрещивание таких самок с самцами и их быстрое умерщвление для вымывания оплодотворенных яйцеклеток из яйцеводов. Полученные таким образом клетки пока не являются полноценными зиготами, поскольку в них еще не произошла кариогамия (слияние ядер). С использованием микроманипулятора, под микроскопом поочередно фиксируют каждую клетку и с помощью инъекционной пипетки (тонкая стеклянная трубочка, соединенная с создающим давление механизмом) в ядро слившегося с яйцеклеткой сперматозоида (мужской пронуклеус) вводится суспензия молекул ДНК, содержащих необходимую генетическую информацию. Когда ядро яйцеклетки (женский пронуклеус) и ядро сперматозоида сливаются и получается полноценная зигота, она микрохирургическим путем имплантируется в матку так называемой суррогатной матери - самки, которая была перед этим скрещена с вазэктомированным самцом (в семенной жидкости таких самцов нет сперматозоидов), поскольку у мышей не разработаны методы другие методы (например, гормональные) для подготовки матки самки к имплантации. В матку одной самки вводят от 25 до 40 зигот, для того, чтобы хотя бы часть из них имплантировалась нормально, и началось дальнейшее развитие эмбрионов. Через три недели рождается трансгенное потомство, которое оценивается в дальнейшем на наличие введенных генов и выраженность желаемого признака. Метод трудоемок и требует специальной подготовки: квалифицированный специалист в течение рабочего дня подвергает микроинъекции несколько сотен яйцеклеток, при этом часть яйцеклеток повреждаются и становятся непригодными для имплантации. Кроме того, имеются определенные трудности и в ходе собственно имплантации, а также не каждая имплантированная зигота в дальнейшем развивается нормально (поэтому их имплантируют больше, чем в норме может развиться в матке мыши). К сожалению, и часть родившихся детенышей могут оказаться мало жизнеспособными и умирают на ранних стадиях постэмбрионального развития. |