зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1. Билет 1 1 характеристика агробактерий

• Название: Билет 1 1 характеристика агробактерий
• Дата: 13.05.2021
• Размер: 135.64 Kb.
• Имя файла: зима билеты трансгеныotvety_po_biletam_1.docx
• Тип: Документы; #204393
• страница: 3 из 9

Метод слияния протопластов растительных клеток и сферопластов бактерий. Бактериальные клетки лешенные твердой клеточной стенки называют сферопластами,потому что еще нет способа полного удаления клеточной стенки бактерий. Такие клетки имеют сферическую форму, могут сливаться друг с другом или с протопластами других клеток в растворах веществ, которые способствуют объединению биологических мембран – полиэтиленгликоля, поливиниловый спирта или других. Для реализации такого метода нужно получение сферопластов из бактериальной культуры несущей соответствующую генетическую конструкцию. Штаммы Е.coli можно превратить в сферопласты и их можно использовать для слияния с протопластами растительных клеток.

Трансформация изолированных клеток. Экспременты по введению ДНК в целое растение давали низкую частоту образования трансформантов. Поэтому начали использовать изолированные лишенные клеточной стенки клетки.

Для удаления клеточной стенки растительных клеток используют комплекс ферментов, состоящий из пектинлиаз и целлюлаз. Полученные протопласты трансформируются при обработке их растворами ДНК. Если повысить значение рН растворов до 10 и если в трансформирующих растворах будут находиться дивалентные ионы (Са2+, Mg2+, Zn2+ и Cu2+), то это повысит частоту трансформации.

Билет 11
1) Кокультивирование, как способ получения трансгенных растений
Сразу получают каллусы и регенирируют из них растение. Потом подготавляиваются изолированные листья или побеги путем обмывания их поверхности моющими и стерилизующими растворами, разделения в асептических условиях на фрагменты (экспланты) и нанесения на поверхность фрагментов культуры агробактерий посредством их погружения в суспензию бактериальных клеток на несколько минут. Затем фрагменты растения помещают на агаризованную среду, индуцирующую образование каллусов, которая содержит селективный для трансформированных растительных клеток агент (например, канамицин ), и культивируют несколько дней на свету при комнатной температуре. Этот этап называют кокультивацией эксплантов и агробактерий.

Затем экспланты переносят в стерильную воду и затем подсушивают на поверхности стерильной фильтровальной бумаги (удаление агробактерий). Далее экспланты переносят в жидкую каллусиндуцирующую среду с канамицином и антибиотиком, к которому чувствительны агробактерии (например, ампициллином), и культивируют. После отмывания экспланты переносят на агаризованную каллусиндуцирующую среду с обоими антибиотиками (канамицин + ампициллин) и продолжают культивирование до формирования хорошо выраженных каллусов.
Это не читай,прочитаешь,если останется время.

Еще один метод кокультивация агробактерий и суспензионной культуры клеток растений или их протопластов. Протопласты помещают в условия, способствующие восстановлению клеточных стенок, выдерживают некоторое время до начала построения элементов клеточной стенки и затем вносят бактериальные клетки в соотношении приблизительно 400 бактерий на один протопласт. Оседающие на поверхность таких «полупротопластов» бактерии закрепляются образующимися при регенерации клеточной стенки целлюлозными волокнами. Кокультивацию продолжают до полной регенерации клеточных стенок, после чего проводят высев на агаризованную среду для культивирования растительных клеток, содержащую селективный агент для трансформированных клеток растений и антибиотик, убивающий бактериальные клетки.
2) Интегрирующие векторы для получения трансгенных Pichia pastoris и Hansenula polymorpha
Интегрирующие векторы - это векторы, обеспечивающие встраивание вводимого фрагмента ДНК в ДНК дрожжевых хромосом.

Вектор содержит начало и конец гена алкогольоксидазы 1. У дрожжей Pichia pastoris образуются две алкогольоксидазы – 1 и 2, первая из них является основной, вторая – вспомогательной, но в норме их совместное действие и позволяет клеткам активно использовать метанол для питания. Эти гены имеют так называемые метанолиндуцируемые промоторы,т.е. при престустчвии метонола эти гены более активны. Первый фрагмент гена алкогольоксидазы 1 одновременно является и промотором для вводимого в геном дрожжей гена (вируса гепатита В – HbSAg). Сайт терминации транскрипции и полиаденилирования также обычно используют из гена алкогольоксидазы, но за ним обычно располагают дрожжевой ген(ген his4). Этот ген кодирует один из белков пути биосинтеза аминокислоты или азотистого основания. Наличие этого гена в интегрируемом участке плазмиды позволяет отобрать те клетки, в которых интеграция прошла вследствие двойного кроссинговера по 5’-фрагменту и расположенному за геном фактора роста 3’-фрагменту гена алкогольоксидазы 1.

Так же можно вводимй ген поставить под промоуторный участок(интеграция будет осуществялться за счет промоуторного участка)и расположенного сразу же за ним сайта терминации/полиаденилирования. Примером такой интеграции может служить введение генов альфа- и бетта-цепей человеческого гемоглобина в хромосому Hansenula polymorpha.

Еще один пример это введение гена бычьего лизоцима в геном Pichia pastoris (желудочный фермент жвачных, используется как добавка к комбикормам). В данном случае интеграция была осуществлена не по последовательностям гена алкогольоксидазы, а по последовательностям гена his4 дрожжей. Использовался все тот же дефектный по синтезу гистидина штамм-реципинент, но был отобран вариант, когда кроссинговер произошел между двумя последовательностями гена his4 - дефектной и нормальной, внесенной в результате интеграции. В этом случае интегрируется вся плазмида и достаточно одиночного кроссинговера, чтобы осуществилась такая встройка.
Билет 12
1) Бакуловирусы насекомых как основа векторных сиситем
Механизм их репродукции в организмах членистоногих: После попадания вириона бакуловирусов в клетку эпителия кишечника насекомого он проникает в ядро, где и происходит освобождение двунитевой ДНК из белкового капсида. В ядре происходит репликация этой ДНК, затем экспрессия генов и образование новых вирусных частиц. Образовавшиеся вирионы отшнуровываются от клеток и гемолимфой насекомого разносится по организму животного, но большая часть собирается в компактную структуру внутри клетки и покрывается специальной оболочкой, состоящей в основном из белка полиэдрина,т.е. переходит в неактивное состояние.

Если удалить белок полиэдрин, то репродукция вирусных ДНК продолжится в обычном порядке. Так же выяснили,что промотор гена полиэдрина является очень сильными работает конститутивно. Это и стало основой для применения бакуловирусов в качестве векторных систем.

Основным видом вируса, на котором проводятся все исследования генно-инженерного направления, является вирус множественного ядерного полиэдроза (аутографа калифорника). Векторы для введения генетической информации в клетки насекомых представляют собой стандартную плазмиду E.coli на основе pBR322 в которую встроены фрагменты ДНК AcMNPV:

1) последовательность, предшествующая 5’-концу гена полиэдрина

2) промоторная область этого же гена, обозначаемая Рр;

3) сайт терминации транскрипции и полиаденилирования гена полиэдрина (Pt).

Между Рр и Рt находится один из стандартных искусственных полилинкеров.
(это принип введения чужеродной генетической инормации с помощью бакуловирусов, 15 билет 2 вопрос…прочитаешь,если будет время)

Последовательность нужного гена вводится в вектор в системе E.coli и здесь же нарабатывается ДНК для трансфекции. Трансфекции подвергаются клетки насекомого, уже несущие AcMNPV, и если происходит двойной кроссинговер, то в ДНК вируса исходный ген полиэдрина заменяется чужеродным геном. Было установлено, что линеаризованная ДНК вируса гораздо хуже вызывает инфекционный процесс. Это послужило основой для улучшения системы бакуловирусных векторов.

В геном AcMNPV ввели уникальный сайт для рестриктазы Bsu36I и в клетки насекомых вводили вирусную ДНК после ее обработки этой рестриктазой. Репродукция вируса происходила только лишь в некоторых клетках. Но если вместе с линеаризованной ДНК вируса вводить кольцевую ДНК вектора, в которой есть сайты для гомологичной рекомбинации с ДНК вируса что, приводит к репродукции вируса. Эта система была улучшена за счет введения еще одного сайта для рестриктазы Bsu36I в один из генов, ответственных за репликацию ДНК вируса. Причем оба сайта для Bsu36I локализовались слева и справа от структурного гена полиэдрина в результате чего обработка этой рестриктазой приводила к полному удалению из ДНК вируса последовательности гена полиэдрина.

2) Получение трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям
Бактерии вида Bacillus thuringiensis могут вызывать гибель различных видов насекомых. Эти бактерии накапливают в цитоплазме белок протоксин, которые под действием протеаз пищеварительного сока насекомых превращаются в активный токсин. (проверялся на белых мышах, 15 дней кормили пищей с 5 г энтомотоксина..через 10 минут польностью переваривается)

Гены, ответственные за синтез инсектицидных белков В. thuringiensis практически не экспрессируются в растениях. НО эти белки нужны в большом количестве. Для этого уменьшили размер встроенного гена так, чтобы синтезировалась только N-концевая часть молекулы токсина. Для повышения уровня экспрессии ген снабдили сильным растительным промотором. Количество синтезируемого токсина увеличилось, и трансгенные растения получили некоторую защиту от насекомых-вредителей.

Для повышения инсектицидного качетсва трансгенных растений модифицировали последовательности укороченных генов энтомотоксинов (cry-генов). В них заменили кодоны, способствующие образованию вторичной структуры РНК и участки, способные приводить в появлению сайтов полиаденилирования. Клетки растений с таким геном продуцировали в 100 раз больше токсинов, чем у растений с геном дикого типа.

Недостаток таких растений заключается в появлении устойчивых к данному таксону вредителей. Это можно решить, если экспрессия гена энтомотоксина будет осуществляться с регулируемых промоторов. Токсин будт образовываться на определенном этапе вегетации. На табаке были опробованы конструкции с промоторами генов PR-белков,экспрессию их вызывают опрыскиванием нетоксичными химикатами. Одноразовое применения такого препарата приводит к накоплению токсина в растении, а затем он постепенно разрушается.

Для непещевых и некормовых растений используют холестеролоксидазу. Она токсична против личинок жесткокрылых. Ее испытали на табаке и затем ввели в хлопчатник для защиты от хлопкового долгоносика.
Билет 13
1. получение растений устойчивых к вирусам
Существует 2 подхода

подход 1: введения вирусных генов, в геном растений, которые кодируют белки капсида.

При накоплении в растительных клетках белка вирусных оболочек репродукция вируса (синтез его нуклеиновой кислоты) если не прекращается, то сильно снижается. Экспрессия поставленного под сильный промотор гена вируса может давать такое количество белка, которое соответствует (если не превышает) количеству, ограничивающему репродукцию. Примеры: картофель,тыква,томатыогурцы,табак.

Подход 2: введение в геном растения тех же генов белков оболочки вируса, которая дает антисмысловую РНК путем синтеза двунитевой кДНК так, чтобы при транскрипции синтезировалась комплементарная значащей нити последовательность. В клетке антисмысловая рнк взаимодействует комплементарно с мРНК вируса(заражающего растение) и препятствовать трансляции(рнк). Подход был опробован на табаке с РНК4 вируса мозаики огурца, но оказалось, что трансгенные растения устойчивы только при низкой инфицирующей дозе вируса. Вероятно, количества антисмысловой РНК не хватает для связывания множества молекул, образующихся при массовом заражении.

Сверхпродукция белков одного вируса не защищает в достаточной степени от заражения другими вирусами. Есть подходы где последовательности, кодируют так называемые сателлитные РНК. Эти нетранслируемые РНК появляются в клетках растений в период репродукции в них вирусов, при увеличении количества такой РНК ослабляется проявление симптомов вирусной инфекции и ограничивается распространение вируса по растению. Интеграция в геном растения кДНК повышает устойчивость к вирусу (на табаке).

Так же можно использовать гены антивирусных белков некоторых растений. Это было показано в работе где использовались белки Phytolacca americana – PAP, PAPII и РАР-S. Но полной защиты не было потому что при постановке этих генов под сильные промотры растения плохо росли и утрачивали способность к семенному размножению.
2. векторы на основе аденовирусов
Для получения аденовирусных векторов сначала «сконструировали» с помощью ретровирусного вектора клеточную линию, несущую в геноме фрагмент ДНК аденовируса с аденовирусным геном Е1 (для инициации образования вирусных частиц). Затем получили плазмиду E.coli, содержащую фрагмент ДНК аденовируса, в середину которого можно встраивать ген, выбранный для введения в клетки млекопитающих. Одновременно был получен «укороченный» вариант аденовируса включающая Е1-ген.

В результате котрансфекции Е1⁺-клеток ДНК такого вируса и ДНК плазмиды со встроенным геном за счет рекомбинации и последующей репликации происходит образование «полноразмерной» ДНК, где вместо гена Е1 находится выбранный для введения ген. Благодаря продукту,который находится в Е1-гене,происходит упаковка и выход вирусных частиц с такими ДНК. Эти частицы и будут векторами. После инфицирования ими нужных клеток и начинающейся с 5’-конца транскрипции будет появляться и мРНК введенного гена, а после трансляции – продукт этого гена.

Недостатки таких векторов – отсутствие стабильной интеграции в геном клетки-хозяина и ограниченная емкость. Для повышения емкости была сконструирована плазмида Е.coli, в которую ввели 5’-концевую и 3’-концевую области аденовирусной ДНК (состав: 1)точка инициации репликации; 2)последовательность, отвечающая за упаковку в капсид; 3)терминирующая область). После вставки в эту плазмиду последовательностей, размер плазмиды не должна привышать 36 т.п.н. После обработки рестриктазой кольцевая плазмидная ДНК превращается в линейную таким образом, чтобы фрагменты аденовирусной ДНК в линейной молекуле образовывали концы. Затем такой ДНК совместно с ДНК вируса-помощника котрансфецируют клетки Е1+-линии. Вирус-помощник дает все необходимое для репликации и упаковки, но в капсиды упаковываются только векторные молекулы ДНК.

Второй недостаток – отсутствие интеграции в геном, частично преодолевается с помощью векторов на основе аденоассоциированных вирусов.

P.S. котрансфекция - заключается в одновременной трансфекции клеток-хозяев двумя рекомбинантными ДНК разных типов: обычно одна является векторной плазмидой, несущей селективный маркер, а другая — векторной плазмидой без селективного маркера.
Билет 14
1) Методы подтверждения наличия трансгеннов в геноме млекопитающих.
Позитивной селекцией называют культивирование клеток на среде с маркерным геном Neo^r (продукт которого придает клеткам млекопитающих устойчивость к G-418 (генетицину)), которое позволяет отобрать клетки, в которых произошла встройка векторной молекулы в геном. Иногда встройки могут происходить в различные участки генома, поэтому в составе вектора находятся еще два гена тимидинкиназы из генома вируса простого герпеса – HSV-tk1 и HSV-tk2. Они убирают клетки с ненужными вставками. Эти гены располагаются в векторе слева и справа от нужных для направленной интеграции гомологичных фрагментов, и если встраивание произошло случайно, не по этим гомологичным последовательностям, то в геноме клетки оказывается хотя бы один из генов тимидинкиназы. Если клетки выращивать на среде с ганцикловиром, то гены тимидинкиназы под воздействием этого фермента превращается в токсическое для клетки соединение. Если после трансфекции ES-клетки поместить на среду, одновременно содержащую и генетицин (G-418) для позитивной селекции и ганцикловир - для негативной, будут размножаться только те клетки, в которых произошла интеграция в нужный сайт хромосомы.

Еще один метод - ПЦР, для этого используют другие векторы. В таких векторах рядом с предназначенным для введения геном (между ним и одной из необходимых для гомологичной рекомбинации последовательностей) располагают короткую уникальную последовательность (US), которая нигде больше в геноме животного не встречается. Для идентификации нужных клеток необходимы два праймера: один из них (Р1) комплементарен этой уникальной последовательности, а второй (Р2) – последовательности из того сайта хромосомы, в который предполагается встройка. Если после амплификации ДНК из трансфецированных клеток выявляется фрагмент предусмотренного размера, то, значит, именно в этих клетках интеграция произошла в нужное место хромосомы.

Далее клетки такого клона с использованием микроманипулятора вводят в бластоцисту мыши, и затем имплантируют эту бластоцисту в матку суррогатной матери. После этого по описанной выше схеме получают чистые трансгенные линии.
2)Получение растений на основе Глифосат( n-фосфомитилглицирин как ингибитор биосинтеза )ароматических аминокислот

Глифосфат подавляет активность 5-енолпирувил-3-фосфатсинтетазы-фермент биосинтеза АК в хлоропластах. Сначала было известно, что хлоропластный путь биосинтеза аминокислот является прокариотическим. Поэтому были использованы бактерии как источники генов устойчивых к глифосату. Устойчивость к глифосату может определяться как сферхпродукцией фермента или как мутациями в структурной части гена aroA (так называется бактериальный ген, кодирующий 5-енолпирувил-3-фосфатсинтетазу). Для переноса в растения использовали гены с изменениями в структурной части из устойчивых к глифосату мутантов E.coli, Salmonella typhimurium и Agrobacterium tumefaciens штамм CP4.

Мутантную последовательность aroA объединяли с 5’- концевым фрагментом гена малой субъединицы рибулозобифосфаткарбоксилазы rbcS из растений гороха. Этот фрагмент содержит промоторную область и последовательность лидерного пептида, который транспортировал прикрепленный к нему белок в хлоропласты. Эта конструкция вводились в хромосомную ДНК растений с помощью агробактериальных векторных систем.