Шпоры по вирусологии (МГАВМиБ). Отличия вирусов от других инфекционных агентов и черты их сходства. Вирионы вирусов, их строение и химический состав
 Скачать 259.5 Kb.
|
|
23. Серологическая диагностика В целях определения вида данного вируса при изучении защитных процессов в организме больного человека или зараженного животного применяются серологические методы. Серология (от лат. Serum - сыворотка, жидкая составная часть крови) - это раздел иммунологии, изучающий реакции антигена специфическими защитными веществами, антителами, которые находятся в сыворотке крови. Антитела нейтрализуют действие вируса. Они связываются с определенными антигенными веществами, находящимися на поверхности вирусных частиц. В результате связывания молекул антител с поверхностной структурой вируса последний теряет свои патогенные свойства. Для установления уровня (количества) антител в сыворотке или определения типа данного вируса проводится реакция нейтрализации вируса. Ее можно проводить как на животных, так и на культуре клеток. Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить цитопатическое действие, называют титром сыворотки, нейтрализующей вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек. Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. Из методов, применяемых в вирусологии для различных исследовательских целей, можно еще упомянуть методы, при помощи которых вирусологический материал подготавливается для физических и химических анализов, которые облегчают изучение тонкого строения и состава вирусов. Эти анализы требуют большого количества совершенно чистого вируса. Очистка вируса - процесс, при котором из суспензии с вирусом устраняются все посторонние, загрязняющие ее частицы. В основном это кусочки и «обломки» клеток - хозяев. Одновременно с очисткой происходит обычно сгущение суспензии, повышение концентрации вируса. Так получается исходный материал для многих исследований. Из отдельных методов очистки упомянем лишь наиболее эффективный - метод ультрацентрифугирования, который дает препараты вируса очень высокой концентрации. Опишем вкратце процедуру получения и очистки вирусной суспензии. Процесс этот начинается с искусственного введения вируса в мозг подопытного животного. По прошествии нескольких дней вирус размножится в ткани мозга. При этом обнаружатся характерные нарушения функций нервной системы «хозяина», и у животного выявятся признаки заболевания. Когда симптомы достигнут наибольшего развития, зверька умерщвляют, а его мозг, в тканях которого содержатся большие количества вируса, извлекают в стерильных условиях из черепа животного. Затем из мозга готовится, скажем ,10 %-ная суспензия. Кроме вирионов она содержит еще и большое количество кусочков нервной ткани, остатки кровеносных сосудов, кровяные тельца и другие биологические компоненты. Кусочки ткани и другие крупные частицы устраняются первым центрифугированием со скоростью 5000-10000 оборотов в минуту. Оно продолжается около получаса. Жидкость над осадком (суперкатакт) осторожно сливают в специальные пробирки для центрифугирования, сделанные из пластмассы или нержавеющей стали, поскольку стекло не выдерживает давление, которое развивается при высокоскоростном центрифугировании. А осадок обезвреживают дезинфицирующими средствами. Слитый «супернатант» обрабатывается затем уже в ультрацентрифуге. Для седиментации мельчайших вирусов необходимо многочасовое ультрацентрифугирование, причем полученный осадок часто бывает не больше булавочной головки. Но и после такой обработки мы имеем не совсем чистый вирусный материал, в нем еще содержатся чужеродные примеси. Для тонких анализов этот осадок надо несколько раз обработать различными реактивами и повторить ультрацентрифугирование. Только тогда можно получить концентрированную суспензию вируса высокой чистоты, которая требуется для точных и достоверных биохимических, кристаллографических анализов или для наблюдений в электронно-оптических приборах. В распоряжении вирусологов вообще много различных технических приспособлений, как , например , центрифугирование по градиентам концентрации, когда вирионы разделяются по степеням концентрации или по форме. Другой прибор, представляющий в наше время стандартное оборудование почти каждой научно-исследовательской вирусологической лаборатории - электронный микроскоп. Это дорогостоящий, большой и сложный аппарат. Для получения изображения вирусов существует много различных методов, и все они прошли свои этапы развития. Чтобы обнаружить вирионы в клетках, в настоящее время пользуются методом ультратонких срезов Фиксированный материал, залитый эпоксидной смолой, разрезается тончайшим стеклянным или алмазным ножом. При помощи точных ультрамикротомов одну клетку можно разрезать более чем на тысячу тонких срезов. Полученные таким образом срезы обрабатываются затем специальными химикалиями, что обеспечивает лучшую их видимость. Для наблюдения тонкого строения отдельных вирионов применяется метод негативного контрастирования (окрашивания), внедрение которого значительно повысило качественный уровень электронного микроскопирования. Вирусные частицы при этом осторожно смешиваются с раствором фосфовольфрамовой кислоты, дающей осадок, не пропускающий электронные лучи. В результате вирионы предстают в виде своих совершенно точных отпечатков, по которым можно изучать самые тонкие детали их поверхностей. При методе позитивного окрашивания (или «металлизирования» препарата) применяются такие вещества, которые способны выборочно прилипать к поверхности вирионов (например, специфические антитела, меченные ферритином, содержащим в своей молекуле железо и потому хорошо различимые в электронном микроскопе). 24, 27-28. Титрование. Титр – это кол. вируса, содер. в ед. объема материала. Из локальных повреждений, вызываемые вирусами, наиболее известны бляшки и оспины на ХАО КЭ. Если имеются данные обр. то инф. активность вируса может быть измерена в бляшкообр. ед (БОЕ) или оспообр. ед (ООЕ) 1БОЕ = дозе вируса, способной вызвать обр. одной бляшки, а одна ООЕ – одной оспины. Метода: заражают несколько КК или КЭ на ХАО. Высчитывают среднеарифметическое кол. оспин или бляшек. Оно = БОЕ или ООЕ вируса. Рассчитывают сколько БОЕ или ООЕ приход на ед. объема вируссодерж. материала. Это и есть титр. Т=n/Va, где n-сред ариф. бляшек или оспин, а –разведение материала, V – введенная доза. Метод 50%-ного инф. действия. За ед. кол. вируса принимается доза, которая способна вызвать инф. эффект у 50% зараженных. Число таких доз в ед. материала и будет выражать титр вируса в этом материале. Готовыт 10 кратное разведение исл. материала, затем одинаковыми дозами заражают равные группы живых тест объектов. Учит. результат действия и пор. в каком разведение вирус проявил сое действие на 50%. Если сразу такое разведение не найдено то оно расчит. по формуле Т=lgB – (b-50)/(b-a) *lgd, где В – разведние дающие инфекц. эффект более 50%, b – процент дающий инф. эффект более 50%, а – менее 50% d – кратность разведения. За 1ГАЕ принимается такая доза вируса, которая способн. агглютинировать примерно 50% эритроцитов содерж. в том же, что и вирус объеме 1% суспензии отмытых эр. Готовят ряд послед. кратных разведений материала и к каждому разведению добав. 1% суспензию. Реакция оценивается в крестах. Реак. с 2 крестами содерж. 1ГАЕ. которая умножается на кратность разведения. Минимальную концентрацию сыворотки, содержащей антитела, достаточную для того, чтобы нейтрализовать вирус, не дать ему проявить цитопатическое действие, называют титром антител, нейтрализующих вирус. Эта концентрация может быть выявлена и с помощью метода бляшек. Для обнаружения антител используется метод торможения гемагглютинации (склеивания эритроцитов под воздействием вируса) и метод связывания комплемента. 26. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР является наиболее чувствительным методом. Реакция обнаруживает вирусные НК. Реакция открыта в 1985 году в США. Сутью метода является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК in vitro. ПЦР основана на амплификации ДНК при помощи ДНК-полимеразы, которая осуществляет синтез взаимокомплементарных цепей ДНК начиная с 2-х праймеров (затравок) Primer – фрагмент ДНК из 20-30 нуклеотидов. Синтезированный искусственно. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК. Обычно при ПЦР ставят от 25 до 40 циклов в зависимости от возбудителя. Каждый цикл состоит из трех этапов.
В ПЦР используют праймеры из консервативных участков ДНК вируса, которые имеют уникальную последовательность для каждого возбудителя. Методика постановки. Из исследуемого материала выделяют НК, которую помещают в чистую пробирку и добавляют амплифицирующую смесь, которая состоит из:
Пробирки помещают в програмируемый термостат-амплификатор и проводят амплификацию в автоматическом режиме по заданной программе для соответствующего вида возбудителя (2-3 часа). Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль. Регистрация результатов – детекция амплификонов. Проводят методом электрофореза в 1-2% агаровом геле в присутствии бромистого этидия, который соединяется с фрагментами ДНК и высвечивается в виде полосок при УФО (трансилюминатор). 29. Патогенез Различают три вида воздействий, оказываемых вирусами животных на клетки. Легче всего выявляется деструктивный, или цитолитический, эффект, для которого характерно обширное повреждение множества различных клеточных органелл. Вероятно, вирус - специфические макромолекулы вызывают первичное повреждение, влекущее за собой цепь вторичных деструктивных процессов, в которых участвуют уже продукты метаболизма самой клетки. На другом конце спектра возможных последствий находится явление трансформации, когда зараженная вирусом клетка приобретает способность к неограниченному делению. По-видимому, это результат устойчивой интеграции вирусного генома или его части с геномом клетки, которая не приводит к ее гибели. Трансформированная клетка часто выходит из-под контроля механизмов, регулирующих клеточное деление. Действие некоторых вирусов, геном которых не включается в хромосомы клеток, занимает промежуточное положение между резко выраженным деструктивным эффектом и трансформирующим действием. В этих случаях зараженные клетки еще некоторое время функционируют и по меньшей мере в одном случае - при заражении парамиксовирусами - продолжают расти и делиться, одновременно продуцируя вирус («персистентная инфекция»). Возможна еще одна категория реакции клеток, при которой можно говорить об индуктивном действии вируса. Многие вирусы способны индуцировать образование в зараженной клетке белков, кодируемых не вирусным, а клеточным геномом, но, по-видимому, синтезируемых клетками в ответ на вирусную инфекцию. Этот тип реакции не обязательно связан с тем или иным конечным результатом взаимодействия вируса с клеткой. Зная, что многие вирусы вызывают резкие деструктивные изменения клеток-хозяев, биохимики заинтересовались вопросом, прекращается ли при этом синтез всех клеточных белков РНК и ДНК, и если да, то в какой последовательности. Ответы сводятся к следующему: 1. Вероятно, различные вирусы подавляют синтез клеточных белков, используя разные механизмы. Степень и время этого подавления тоже неодинаковы. 2. Нередко вирус блокирует накопление клеточной РНК, приостанавливая процессинг пре-р РНК, но никак не влияя на ее синтез. Образование клеточной т РНК часто не снижается. Во многих случаях бывает нарушен синтез клеточных м РНК, но механизм этого нарушения совершенно неясен. 3. Нередко бывает подавлена инициация синтеза клеточной ДНК, однако при некоторых вирусных инфекциях клетки, уже вошедшие в фазу S, могут завершить цикл синтеза ДНК, а клетки, прошедшие через фазу S, могут пройти и через митоз. Ингибирование синтеза клеточной ДНК- это вероятно, вторичное следствие прекращение синтеза белка, так как синтез ДНК идет лишь в том случае, если одновременно продолжается синтез белка. Пути проникновения: носоглотку (оспа), пищеварительный тракт (ящур), кожного контакта (оспа), при + насекомых (арбовирусы) далее размножается на месте проникновения или в опр. тк. далее разносится с кровью или по нервн. путям. Выделение из организма: с фекалиями, мочой, носовым экссудатом (пантропные инф. вирусы). Ч/з носоглотку (грипп, ринотрахеит). Со слюной (бешенство), из кожн. поражений (оспа), со спермой (лейкоз, ящур). 5)факторов влияющих на чуств. к вирусам: 1)гормоны 2)возраст 3)беременность 4)ионизирующее излучении 5)температура 32. Экспресс-методы 1)Обнаружение вирусных АГ. Используют серологические реакции. 1.РИФ – реакция иммунофлюорисценции. Метод обнаружения – флюоресцентное свечение под микроскопом. 2.ИФА – иммуно-ферментный анализ. АТ-ферментным комплексом дает цветную реакцию. 3.РСК – реакция связывания комплемента. Задержка гемолиза – реакция положительная. Если произошел гемолиз, значит комплемент связан гем-системой – реакция отрицательная. 4.РДП - реакция диффузной преципитиции. Метод обнаружения – образование контура преципитации. 5.РНГА – реакция непрямой гемаглютинации. агглютинация эритроцитов. 6.РТГА – реакция торможения гамаглютинации 7.РТГАд – реакция торможения гемадсорбции 8.РН – реакция нейтрализации. Метод обнаружения – нейтрализация инфекционной активности вируса. 2)Обнаружение телец-включений. Представляют собой скопления зрелых вирионов в кл., где шла их репродукция, или массы кл. материала, измененного под влиянием репродукции вируса. 3)Обнаружение виронов. С + эл. микросокопа, только оспа – световой. 4)Биопроба – экспериментальное заражение материалом от больных жив. лаб. или естественно восприимчивых жив. 33. Этиологическая роль вируса Иногда требуется доказать этиологическую роль выделенного вируса. Для этого используют парные сыворотки крови в серологических реакциях. В качестве АГ используют выделенный вирус, а в качестве АТ – парные сыворотки. Повышение титра антител во второй сыворотке в 4 и более раз свидетельствует о этиологической роли выделенного вируса. 34. Диагноз Предварительный диагноз.
Окончательный диагноз. От больных или погибших животных берется патологический материал, нахождение вируса в котором наиболее вероятно, т.е. материал из пораженных органов а так же кровь, истечения, фекалии и т.д. ЧАСТНАЯ ВИРУСОЛОГИЯ 35. Ларинготрахеит кур. 1. Сем.: герпесвирусы. 2. Возбудитель ИЛТ - ДНК-содержащий вирус, размер вирионов - 87-97 нм, их внешняя оболочка, ее толщина различаются по структуре нуклеоида. Антигенная структура не изучена. Известные штаммы вируса в антигенном отношении родственны эталонному штамму. Иммунологических различий среди штаммов вируса ИЛТ не обнаружено. Вирус обнаруживают главным образом в дыхательных путях. Гемагглютинирующая активность не установлена. Вирус чувствителен к липолитическим агентам, теплу и различным дезинфектантам, длительно сохраняет активность в лиофилизированном состоянии и при температуре - 20-60°С. 3. Инфекционный ларинготрахеит - энзоотическое контагиозное заболевание кур и фазанов. Различают ларинготрахеальную и конъюнктивальную формы болезни. Первая обычно сопровождается кашлем, хрипами, удушьем, связанными с образованием в гортани казеозных пробок. При конъюнктивальной форме отмечают гиперемию и отек слизистой оболочки глаз. Кроме этих изменений отмечают при ИЛТ катарально-геморрагическое воспаление слизистой оболочки тонких кишок, клоаки и фабрициевой сумки и на эпикарде - мелкие кровоизлияния. ИЛТ регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство. 4. Диагноз основан на эпизоотологических, клинических данных, на патологоанатомических изменениях и результатах лабораторных исследований. Материалом для лабораторной диагностики служат слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы; парные сыворотки. экспpecc-диагностика основана на выявлении на отпечатках с патматериала вирусных антигенов при помощи РИФ и обнаружении эозифильных внутриядерных включений в пораженных клетках. Выделение вируса проводят путем заражения куриных эмбрионов 9-12-дневного возраста, культур клеток и цыплят (30-90-дневного возраста). Идентификацию вируса проводят в РН и РДП. Ретроспективный диагноз ставят с помощью РН и РДП. 5. Переболевшие птицы в естественных условиях приобретают пожизненный иммунитет. Для специфической профилактики используют вирус-вакцину. Клинически здоровых птиц иммунизируют клоачным и аэрозольным методами. 36. Оспа кур. 1. Сем.: поксвирусы (англ. покс - пустула, язва). 2. Вирус - ДНК-содержащий, кирпичеобразной или овоидной формы, самые крупные вирусы - до 300 нм: имеет суперкапсид репродукция в цитоплазме клетки. Обладает гемагглютинирующей способностью. Имеет разновидности, которые различаются по' видам животных, однако, способны заражать не только «свои» вид животного но и родственные виды. Дерматотропный (эпителиотропный) Устойчив во внешней среде в патматериале до нескольких месяцев 3. Оспой болеют домашние и дикие животные (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, лошади, верблюды, буйволы и др.), птицы (куры, голуби, индейки и др.), человек. Болезнь имеет распространение среди животных. Оспа человека полностью ликвидирована Оспа - контагиозная вирусная болезнь животных и человека характеризующаяся лихорадкой и папулезно-пустулезной сыпью (Папула -небольшие плотные узелки на коже, из которых образуются везикулы -пузырьки с серозным содержимым, пустулы – пузырьки с гнойным содержимым. Летальность – 20-90%, особенно среди молодняка, зимой - при осложнениях. 4. Оспа относительно легко диагностируется по клинической картине и эпизоотологическим данным, но требует лабораторного подтверждения. Материал для исследования: папулы, везикулы, пустулы с содержимым. Экспресс-метод. Вирусоскопия. Мазки обрабатывают по Морозову серебрение) на обнаружение элементарных телец. Вирусологические методы: а) выделение вируса проводится на культуре клеток (КК), на куримых эмбрионах (КЭ) и на молодняке того вида животных, от которого получен патматериал; б)идентификация (определение вида) вируса: обнаружение элементарных телец; обнаружение бляшек на хориоаллантоисной оболочке КЭ: постановка серологических реакций - РИФ, РДП, РН. 5. Переболевшие животные приобретают длительный иммунитет. Для специфической профилактики оспы применяют в основном живые вакцины - осповакцину. иногда родственный вирус (кур иммунизируют вирусом оспы голубей). Продолжительность иммунитета после вакцинации - до 1 года. |