Ответы на экзамен по вирусологии. 1. определение вируса. Отличия и сходство с клеточными организмами. Вирусы
 Скачать 0.59 Mb.
|
|
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИРУСА. ОТЛИЧИЯ И СХОДСТВО С КЛЕТОЧНЫМИ ОРГАНИЗМАМИ. Вирусы –это субмикроскопические ДНК или РНК содержащие объекты, репродуцирующиеся только в живых клетках, заставляя их синтезировать так называемые вирионы, которые содержат геном вируса и способны перемещать его в другие клетки. Первым открытым вирусом был вирус мозаичной болезни табака, обнаруженный русским ученым Д.И.Ивановским в 1892 году. Каждый вирус в своем онтогенезе проходит 2 стадии: - внеклеточную, когда вирус находится в состоянии покоя, и получившую название вирион. В таком состоянии он находится в условиях окружающей среды; - внутриклеточную, в течение которой происходит весь цикл репродукции в клетках хозяина. Каждый вирион представлен двумя основными компонентами – нуклеиновой кислотой и белком, что позволяет называть вирусы неклеточными формами жизни. Отличия вирусов от клеточных организмов представлены в таб
Вирус явл. внутриклеточным паразитом, т.е не размножается вне клетки, не дышат, Не проявляют раздражительность, Не способны двигаться самостоятельно, не проявляют обмена веществ и энергии (метаболизма); имеют только одну нуклеиновую кислоту — либо ДНК, либо РНК. Сходство вирусов с клеточными организмами:· Способность к размножению.· Наследственность · Характерна приспособляемость к меняющимся условиям окружающей среды. 2. ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ ВИРУСОВ. Отряд: Virales Cемейство: Viridae Подсемейство: Virus Род : Virus В основу современной классификации положены следующие основные критерии: 1. Тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), ее структура (одноцепочечные/ двуцепочечные; полные/недостроенные; цельные/фрагментированные), конфигурации( линейные/кольцевые), геномной функции (плюс/минус-нитевые). 2. Размер и морфология вириона, тип симметрии (спиральный/кубический/икосаэдрический), число капсомеров в капсиде. 3. Органно-тканевой тропизм вирусов и их цитопатическое действие (энтеро, пневмо, вазо- и лимфотропные). 4. Круг восприимчивых хозяев (вирусы растений, бактерий, животных). 5. Проявление вирусных болезней. 6. Географическое распространение. 7. Способ передачи. 8. Антигенная специфичность. 9. Форма существования (внеклеточная/внутриклеточная). На основании перечисленных признаков вирусы делятся на семейства, подсемейства, роды и типы. Современная классификация вирусов человека и животных включает 19 семейств, из них 7 — ДНК-содерж. и 12— РНК-содерж. вирусов. К числу семейств вирусов исключительно позвоночных относятся вирусы герпеса, аденовирусы, паповавирусы, гепаднавирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы, аренавирусы, корона-вирусы. Некоторые вирусы обладают способностью преодолевать филогенетические барьеры и размножаться как в позвоночных, так и в беспозвоночных хозяевах (клещи, комары, москиты): буньявирусы, тогавирусы, роды Vesiculovirus и Lyssavirus семейства рабдовирусов, род Orbivirus семейства реовирусов, вирус африканской лихорадки свиней семейства иридовирусов. Для этих вирусов членистоногие являются и естественными хозяевами, и переносчиками инфекции между позвоночными. Такие вирусы составляют экологическую группу арбовирусов, т. е. вирусов позвоночных, передающихся членистоногими. Группа ДНК-содержащих вирусов представлена 7 семействами, четыре из них - вирусы позвоночных, а в остальных трех имеются подсемейства, роды и виды, вызывающие болезни у насекомых. 1) Herpesviridae – дермотропные вирусы, вызывающ у чел-ка везикулёзные высыпания наполненные жидким содержимым на коже и слизистых. Локализация: на губах (простой герпес) и в межреберьях (опоясывающий герпес). 2) Adenoviridae – вирусы поражающие верхние дыхательные пути, либо кишечник. 3) Papovaviridae – вызывает доброкачественные разрастания кожи и слизистых оболочек. 4) Hepadnaviridae – вирус гепатита В. 5) Poxviridae – дермотропные вирусы вызывающие высыпания на коже и слизистых оболочках. 6) Iridoviridae – кристаллизуясь, вирусы отливают всеми цветами радуги. 7) Parvoviridae. У человека и животных вирусы вызывают множество заболеваний, включая оспу, грипп, корь, свинку, инфекционный гепатит, желтую лихорадку, полиомиелит, герпес, бешенство, СПИД, раковые заболевания. 3. ОСНОВНЫЕ СЕМЕЙСТВА ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА. Современная классификация вирусов человека и животных включает 19 семейств, из них 7 — ДНК-содерж. и 12— РНК-содерж. вирусов. К числу семейств вирусов исключительно позвоночных относятся вирусы герпеса, аденовирусы, паповавирусы, гепаднавирусы, парамиксовирусы, ортомиксовирусы, аренавирусы, корона-вирусы. Некоторые вирусы обладают способностью преодолевать филогенетические барьеры и размножаться как в позвоночных, так и в беспозвоночных хозяевах (клещи, комары, москиты): буньявирусы, тогавирусы, роды Vesiculovirus и Lyssavirus семейства рабдовирусов, род Orbivirus семейства реовирусов, вирус африканской лихорадки свиней семейства иридовирусов. Для этих вирусов членистоногие являются и естественными хозяевами, и переносчиками инфекции между позвоночными. Такие вирусы составляют экологическую группу арбовирусов, т. е. вирусов позвоночных, передающихся членистоногими. Группа ДНК-содержащих вирусов представлена 7 семействами, четыре из них - вирусы позвоночных, а в остальных трех имеются подсемейства, роды и виды, вызывающие болезни у насекомых. 1) Herpesviridae – дермотропные вирусы, вызывающ у чел-ка везикулёзные высыпания наполненные жидким содержимым на коже и слизистых. Локализация: на губах (простой герпес) и в межреберьях (опоясывающий герпес). 2) Adenoviridae – вирусы поражающие верхние дыхательные пути, либо кишечник. 3) Papovaviridae – вызывает доброкачественные разрастания кожи и слизистых оболочек. 4) Hepadnaviridae – вирус гепатита В. 5) Poxviridae – дермотропные вирусы вызывающие высыпания на коже и слизистых оболочках. 6) Iridoviridae – кристаллизуясь, вирусы отливают всеми цветами радуги. 7) Parvoviridae. У человека и животных вирусы вызывают множество заболеваний, включая оспу, грипп, корь, свинку, инфекционный гепатит, желтую лихорадку, полиомиелит, герпес, бешенство, СПИД, раковые заболевания. 4. КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ ПО БАЛТИМОРУ. Классификация Балтимора основана на различиях в механизме продукции мРНК. Эта система включает в себя 7 групп: 1) Вирусы, содержащие 2-цепочечную ДНК и не имеющие РНК стадии (герпес-, поксвирусы) 2) Содержащие 1-цепочечную ДНК (парвовирусы) 3) Содержащие 2-цепочечную РНК (ротовирусы) 4) Содержащие 1-цепочечную РНК положительной полярности (пикорно-, флавивирусы) 5) Содержащие 1-цепочечную РНК негативной или двойной полярности (ортомиксо-, флавивирусы) 6) Имеющие в своём жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК (ретровирусы, вирус ВИЧ) 7) Содержащие 2-цепочечную ДНК и имеющие в жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК (вирус гепатит В) 5. КЛАССИФИКАЦИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ПО БРЕДЛИ.  6. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЯ ВИРУСОВ. В лабораторной диагностике вирусных инфекций используют следующие основные группы методов: 1) определение вирусов непосредственно в клиническом материале (экспресс-тесты); 2) выделение вирусной культуры с индикацией и идентификацией вируса (вирусологический метод); 3) серологическая диагностика вирусной инфекции (определение специфических антител к вирусу в сыворотке пациента для подтверждения диагноза вирусной инфекции; при некоторых заболеваниях помимо антител в сыворотках проводят определение антигенов). Происхождение материала для исследования зависит от локализации и формы вирусной инфекции. Исследуют носоглоточный смыв, мокроту, кровь, ликвор, фекалии, мочу, соскобы из высыпных элементов, биоптаты органов и тканей, включая аутопсийный материал. Определение вирусов непосредственно в клиническом материале основано на прямом выявлении специфических вирусных нуклеиновых кислот или вирусных антигенов в образцах, полученных от пациента. Иногда для выявления вируса в материале могут применяться прямые вирусоскопические методы обнаружения вирусных частиц (электронная микроскопия, микроскопия внутриклеточных вирусных включений). Вирусные ДНК или РНК в материалах определяют при помощи ПЦР, реже – методом молекулярной гибридизации. С их помощью проводят как индикацию, так и генетическую идентификацию вирусов (вид, вариант и т.д.) 7. ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ. По способности заражать клетки выделяют вирусы человека и животных, растений и микроорганизмов. Всем им присущ рад свойств, отличающих их от всех других форм жизни, поэтому для их выделения и идентификации применяют особые методы. Культивирование вирусов животных требует использования эмбрионов птиц, лабораторных животных, культур животных клеток. Применяются как первичные культуры клеток, полученные с помощью разрушения межклеточных контактов преимущественно эмбриональных тканей протеолитическими ферментами (трипсином), так и культуры перевиваемых линий клеток, источником которых являются клетки опухолевых или нормальных тканей, дополнительно обработанные трансформирующими агентами и обладающие способностью к росту в течение неограниченного периода времени в условиях субкультивирования. Методика трипсинизации тканей и получение однослойных культур клеток была предложена в 1952 г. Р. Дульбекко (R. Dulbecco) и М. Фогт (М. Vogt). Культивируемые клетки животных выращивают в виде однослойной культуры в стеклянных или пластмассовых плоскостенных сосудах - матрацах. Среда для выращивания клеток содержит различные макро- и микроэлементы, углеводы, нуклеозиды, незаменимые аминокислоты, витамины, гормоны (инсулин, глюкокортикоиды и т. д.), ростовые факторы (факторы роста нервов, фибробластов и др.). Часто в качестве источника вышеперечисленных соединений к средам добавляется эмбриональная телячья сыворотка. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференцировки ткани. Чем меньше степень дифференцировки ткани, тем более интенсивной способностью к пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбрионов и опухолевых тканей значительно легче культивировать вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных. Наибольший ростовой потенциал у тканей эмбриона свойствен клеткам соединительной ткани, а у взрослых животных - эпителиальным клеткам. В качестве примера культур перевиваемых клеток, нашедших наибольшее применение в вирусологии, можно привести клетки, полученные из нормальных тканей: FL (из амниона человека), Rh (из почки человека), ВНК-21 (из почки сибирского хомячка) и др.; из клеток злокачественных тканей: HeLa, Нер-1 (из шейки матки человека), Нер-2 (из гортани человека), J-96 (из лейкоцитов человека) и др. Лабораторных животных используют главным образом для выделения вирусов, не вызывающих видимых изменений в культуре клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах (вирус Коксаки А, возбудитель лимфоцитарного менингита и др.). 8. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ В КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ. При использовании для культивирования вирусов эмбрионов птиц суспензию вируса наносят на хорион-аллантоисную оболочку, вводят в аллантоисную или амниотическую полость либо в желточный мешок. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку применяют в тех случаях, когда вирус хорошо размножается в клетках этой оболочки (поксвирусы, герпесвирусы, вирус лейкоза кур и др.), в аллантоисную полость - при культивировании тех вирусов, которые размножаются в клетках эпителия (орто- и парамиксовирусы, герпесвирусы и др.). Вирус при этом поступает в аллантоисную жидкость, накапливаясь в ней в высоких концентрациях (например, вирус гриппа). Заражение в амниотическую полость является самым эффективным методом для выделения ряда орто- и парамиксовирусов, в желточный мешок – для культивирования поксвирусов (вирусы гриппа, болезни Ньюкасла, возбудитель орнитоза и др.). При культивировании в курином эмбрионе индикацию вируса выполняют по гибели эмбриона, помутнению хорион-аллантоисной мембраны с кровоизлияниями, образованию бляшек на мембране, в реакции гемадсорбции и реакции гемагглютинации с аллантоисной жидкостью. Идентификацию проводят в реакции нейтрализации гибели куриного эмбриона и в РТГА. 9. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВИРУСОВ ЖИВОТНЫХ. Культивирование вирусов животных требует использования эмбрионов птиц, культур клеток лабораторных животных (например, клетки ВНК-21 из почки сибирского хомячка). Используются как первичные культуры клеток (получаемые путём разрушения нормальных тканей ферментами), так и культуры перевиваемых линий (источник – опухолевые или нормальные ткани, обработанные трансформирующими агентами). Наибольшим ростовым потенциалом обладают: клетки соединительных тканей эмбриона, эпителиальные клетки взрослых животных. Растения, на которых хорошо выявляются симптомы заражения вирусом – растения-индикторы (например, для индикации вируса табачной мозаики – табак обыкновенный или табак клейкий). Для обнаружения вирусов растений, для их количественного определения в разных препаратах, для гистологических и цитологических исследований вирусных болезней используются антисыворотки к вирусам растений разной степени очистки или к выделенным вирусным белкам. На рисунке ниже: как именно размножают вирусы в курином эмбрионе.  10. МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ С БАКТЕРИОФАГАМИ. ТИТР БАКТЕРИОФАГА, СПОСОБЫ ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ. ФАГОЛИЗАТ, ПОЛУЧЕНИЕ ФАГОВЫХ ЛИЗАТОВ. Бактериофагов можно культивировать: В жидкой погруженной культуре хозяина На плотной питательной среде с поверхностным газоном бактериальных клеток По “двуслойной методике”: пластина твёрдого агара заливается смесью вирусов и клеток хозяина в питательной среде с полужидким агаром Через определённое время культура становится прозрачной или на поверхности агара пояаляются бляшки. Титрование – самый распространённый способ количественного учёта бактериофагов, основанный на подсчёте бляшек в “двуслойной” культуре. Одна бляшка соответствует одной бляшкообразующей единице (PFU – plagueformingunit). Число таких PFU на определённый объём (1 мл) – титр фага. Бактерифаги, если не образуют бляшек, то образуют зоны угнетённости роста (количественный эквивалент бляшек). Кроме того, иногда возможен количественный подсчёт с помощью электронного микроскопа (негативное / положительное контрастирование). Фаголизат суспензионной культуры – суспензия вирусныз частиц, смытая с поверхности плотной среды. |